水產動物異亮氨酸營養(yǎng)研究進展

李晉南 王 良 王連生*

(1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江省水生動物病害與免疫重點實驗室，哈爾濱150070；2.濰坊加易加生物科技有限公司, 濰坊261100)

異亮氨酸是支鏈氨基酸(branch-chain amino acid，BCAA)中唯一的生糖兼生酮氨基酸[1-2]，與纈氨酸和亮氨酸一樣具有由甲基側鏈形成的分支結構[3]，由Ehrlich發(fā)現(xiàn)并提取，其理化性質與亮氨酸差別較大，但化學組成相同，結構式為“α-氨基-β-甲基戊酸”，被認為是有別于亮氨酸的一種氨基酸,故將其定名為異亮氨酸。異亮氨酸在機體的生命活動中起重要的作用，其能夠促進蛋白質的合成，并抑制蛋白質的分解；促進機體合成需要的激素或酶類，如胰島素和生長激素等[4]；作為谷氨酰胺合成的底物，調節(jié)氨基酸代謝，為機體提供能量[5]。本文將對水產動物異亮氨酸營養(yǎng)研究進展進行綜述，包括水產動物異亮氨酸需要量以及異亮氨酸在水產動物蛋白質代謝、免疫、抗氧化功能、腸道發(fā)育和肉質等方面的作用，以期為異亮氨酸在水產動物飼料中的應用提供借鑒。

1 水產動物異亮氨酸需要量

異亮氨酸作為必需氨基酸之一，飼料中異亮氨酸的缺乏會降低水產動物的生長性能和蛋白質效率，增加飼料系數[6-7]。基于生長試驗得出的水產動物異亮氨酸需要量見表1，由表可知，水產動物異亮氨酸需要量因品種、規(guī)格以及評價指標的不同而不同，魚類對異亮氨酸的需要量為0.62%～1.98%，蝦蟹類對異亮氨酸的需要量為1.01%～2.25%，而仿刺參對異亮氨酸的需要量為0.98%。不同品種的水產動物對異亮氨酸的需要量差別較大，斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)對異亮氨酸的需要量僅為0.62%[8]，而中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)對異亮氨酸的需要量則為2.25%[9]。而同一品種不同規(guī)格的水產動物對異亮氨酸的需要量也不同，體重為8.25和256.80 g的草魚(Ctenopharyngodonidellus)對異亮氨酸的需要量分別為1.46%[10]和1.21%[11]；體重為0.61和1.20 g的印度鯉魚(Catlacatla)對異亮氨酸的需要量分別為1.13%[12]和0.94%[13]；而小規(guī)格(0.087 g)的尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)對異亮氨酸的需要量低于大規(guī)格(1.24 g)的尼羅羅非魚[14-15]。評價指標的不同對異亮氨酸的需要量也有一定的影響印度鯪(Cirrhinusmrigala)經二次多項式模型分析后，評價指標為增重率、蛋白質效率和飼料系數時，得出異亮氨酸的需要量分別為1.32%、1.21%和1.23%[6]；大黃魚(Pseudosciaenacrocea)經二次多項式模型分析后，以增重率和飼料系數為評價指標，得出異亮氨酸的需要量分別為1.71%和1.59%[16]。

表1 水產動物異亮氨酸需要量(生長試驗)

續(xù)表1項目 Items體重Bodyweight/g模型 Model評價指標Evaluation indicator需要量 Requirement占飼料干物質的百分比 Percentage of dietary dry matter/%占飼料蛋白質的百分比Percentage of dietary protein/%參考文獻Reference大黃魚 Large yellow croaker (Pseudosciaena crocea)6.00二次多項式模型特定生長率1.713.98飼料效率1.593.70李燕[16]尼羅羅非魚 Nile tilapia (Oreochromis niloticus)0.087折線模型增重率0.873.11Santiago等[14]2.46折線模型增重率1.375.00Araújo等[15]18.09方差分析增重率0.702.50Neu等[24]吉富羅非魚 Nile tilapia (Oreochromis niloticus)49.12二次多項式模型增重率1.474.52特定生長率1.474.52蛋白質效率1.444.43蛋白質沉積率1.444.43飼料系數1.434.40孫玉軒[25]遮目魚 Milkfish (Chanos chanos Forsskal)0.32折線模型增重率1.604.00Borlongan等[26]烏鱧 Snakehead (Channa punctatus)6.74二次多項式模型增重率1.814.01飼料系數1.824.04蛋白質沉積率1.844.09異亮氨酸沉積率1.803.99Sharf等[27]美國紅魚 Red drum (Sciaenops ocellatus)3.68二次多項式模型增重率1.113.00Castillo等[28]紅鰭東方鲀 Tiger puffer (Takifugu rubripes)29.00二次多項式模型蛋白質沉積率1.93魚體粗蛋白質含量1.83—肌肉異亮氨酸含量1.96孫志遠等[29]大鱗大麻哈魚 Chinook salmon (Oncorhynchus tschawytscha)0.98折線模型增重率0.90～1.102.20～2.70Chance等[30]雜交石斑魚 Hybrid grouper (Epi-nephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus)6.00二次多項式模型增重率1.983.99Zhou等[31]虹鱒 Rainbow trout (On-corhynchus mykiss)47.00二次多項式模型增重率1.404.00Rodehutscord等[32]湖鱒 Lack trout (Salveli-nus namaycush)3.20方差分析增重率0.722.06Hughes等[33]斑點叉尾 Channel cat-fish (Ictalurus punctatus)200.00折線模型增重率0.622.58Wilson等[8]

根據Kaushik等[38]的方法，將表1中列出的水產動物異亮氨酸需要量進行了Meta分析。如圖1所示，將增重率進行標準化響應處理后與異亮氨酸需要量進行回歸分析，得到二次多項式回歸分析模型：y=-43.131x2+130.21x+1.514 9，R2=0.974 6(占飼料干物質的百分比，圖1-A)；y=-5.319 5x2+45.502x+0.516 4，R2=0.981 5(占飼料蛋白質的百分比，圖1-B)。以增重率為評價指標，經計算得到水產動物對異亮氨酸的需要量為占飼料干物質的1.51%，占飼料蛋白質的4.28%。

圖1 水產動物異亮氨酸需要量與增重率之間的關系分析

此外，關于氨基酸需要量的研究方法，除了比較常用的利用生長試驗測定以外，還有氨基酸氧化法、析因法、氮平衡法等[39]。在水產動物上，近年來Hua等[40]利用析因法研究了大西洋鮭(Salmosalar)和虹鱒的異亮氨酸需要量。Walton等[41]利用氨基酸氧化法計算了虹鱒的賴氨酸需要量，而Kim等[42]認為該方法不適合對虹鱒苯丙氨酸需要量進行測定，而利用該方法檢測水產動物異亮氨酸需要量的文獻還未見報道。研究者利用氮平衡方法研究得出吉富羅非魚的異亮氨酸需要量為占飼料蛋白質的3.26%[43]。此外，利用全魚氨基酸組成或肌肉氨基酸組成來評估必需氨基酸需要量的方法具有節(jié)省時間和成本的優(yōu)勢，通常以A/E[A/E=(單一必需氨基酸量/必需氨基酸總量)×1 000]值作為評價指標。通過該方法測定的不同品種魚對異亮氨酸的需要量為占飼料干物質的0.47%～1.40%，占飼料蛋白質的2.00%～3.44%(表2)。

表2 水產動物異亮氨酸需要量(其他方法)

續(xù)表2項目 Items體重Bodyweight/g模型 Model評價指標Evaluation indicator需要量 Requirement占飼料干物質的百分比 Percentage of dietary dry matter/%占飼料蛋白質的百分比Percentage of dietary protein/%參考文獻Reference銀鯧參魚 Plata pompano (Trachinotus marginatus)25.03全魚/肌肉氨基酸組成A/E值—1.61～1.78Tesser等[52]牙鲆 Japanese flounder(Paralichthys olivaceus)3.00全魚氨基酸組成A/E值1.002.00Forster等[53]亞馬遜石脂鯉 Matrinx?(Brycon amazonicus)—全魚氨基酸組成A/E值—3.08De Almeida Bicudo等[46]尼羅羅非魚 Nile tilapia (Oreochromis niloticus)4.31全魚氨基酸組成A/E值1.153.44Ogunji等[54]吉富羅非魚 GIFT (Oreochromis niloticus)20.40全魚氨基酸組成A/E值0.882.84Diógenes等[55]158.78氮平衡蛋白質效率—3.26Do Nascimento等[43]鋸腹脂鯉 Pacu (Piaractus mesopotamicus)54.30822.501 562.80全魚氨基酸組成A/E值0.820.810.85—Khan等[56]貝爾鮭脂鯉 Pebbly fish(Alestes baremoze)—全魚氨基酸組成A/E值—2.40～2.45Kasozi等[57]虹鱒 Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)0.2～20.020～100100～500500～1 500析因法1.09～1.373.0～3.11.07～1.353.0～3.10.99～1.252.80.75～0.952.1～2.2Hua等[40]126全魚氨基酸組成A/E值0.92.4Ogino[48]美國紅魚 Red drum—肌肉氨基酸組成A/E值1.002.90Moon等[58]真鯛 Red sea bream (Pagrus major)1.70全魚氨基酸組成A/E值1.102.20Forster等[53]銀鯧魚 Sliver pomfret (Pampus argenteus)—全魚氨基酸組成A/E值—2.00Hossain等[59]條紋鱸 Striped bass (Morone saxatilis)111.00790.00全魚氨基酸組成A/E值0.902.50Small等[60]大鱗鲆 Turbot (Psetta maxima)—全魚氨基酸組成A/E值—2.60Kaushik[49]高首鱘 White sturgeon (Acipens-er transmontanus)66.70全魚氨基酸組成A/E值1.302.99Ng等[61]

2 異亮氨酸與其他支鏈氨基酸的相互作用

支鏈氨基酸在通過細胞膜時會競爭載體，因而，飼料中支鏈氨基酸的失衡會導致動物生長性能或免疫功能的下降[62]。關于支鏈氨基酸的拮抗作用在單胃和瘤胃陸生動物中已經進行了報道[63]，但其在水產動物中相互作用的結果卻沒有統(tǒng)一結論[64]。對斑點叉尾的研究表明，血清中纈氨酸和異亮氨酸含量在亮氨酸缺乏的試驗組中顯著增加[8]。另外，飼料中異亮氨酸或纈氨酸含量的增加引起了血清中支鏈氨基酸含量的變化。對大鱗大麻哈魚的研究表明，其對異亮氨酸的需要量是隨著飼料中亮氨酸含量的增加而增加的[30]。在對牙鲆(Paralichthysolivaceus)的研究中發(fā)現(xiàn)，在高異亮氨酸試驗組中，牙鲆的增重率隨纈氨酸含量的升高而顯著升高，而在低異亮氨酸組中則沒有該現(xiàn)象[65]；而在亮氨酸與異亮氨酸相互作用的中研究發(fā)現(xiàn)，以生長為評價指標，在低亮氨酸(2.58%)飼料中，牙鲆幼魚的生長性能隨著異亮氨酸的添加量的增加而顯著提高，但在高亮氨酸(4.44%)飼料中添加異亮氨酸其生長性能隨著異亮氨酸添加量的增加而顯著下降，產生了拮抗作用；生長性能表現(xiàn)最佳的組為低亮氨酸-高異亮氨酸組和高亮氨酸-低異亮氨酸組[66]。在虹鱒[41]和湖鱒[33](Salvelinusnamaycush)的研究中發(fā)現(xiàn)，異亮氨酸和亮氨酸存在拮抗作用。但Choo等[67]認為過量亮氨酸對虹鱒魚生長的抑制和形態(tài)異常不是由于支鏈氨基酸的拮抗作用，而是由于過量亮氨酸本身的毒性作用。在斑點叉尾中，當飼料中3種支鏈氨基酸滿足要求時，支鏈氨基酸之間沒有發(fā)生拮抗作用[68]，在尼羅羅非魚的研究中也發(fā)現(xiàn)同樣的現(xiàn)象[15]。目前研究表明，尼羅羅非魚的支鏈氨基酸最優(yōu)比值是異亮氨酸∶亮氨酸∶纈氨酸=1∶1.3∶0.9[15]，印度鯪[6]的支鏈氨基酸最優(yōu)比值是異亮氨酸∶亮氨酸∶纈氨酸=1∶1.2∶1.2，雜交石斑魚的支鏈氨基酸最優(yōu)比值是異亮氨酸∶亮氨酸∶纈氨酸= 1∶1.7∶1.4[31]。

3 異亮氨酸的生理功能

3.1 異亮氨酸對蛋白質代謝的影響

3.2 異亮氨酸對機體免疫功能的影響

異亮氨酸在提高非特異性免疫細胞功能和免疫因子活性方面起到了重要的作用。非特異性免疫細胞包括樹突狀細胞、吞噬細胞和殺傷細胞等，免疫因子包括補體(complement，C)、酶類物質、白細胞介素(interleukin，IL)等，它們在抵擋入侵的病原體中發(fā)揮著重要的作用[77]。異亮氨酸可以增強吞噬細胞的吞噬和殺菌能力，在建鯉(Cyprinuscarpiovar. Jian)的研究中表明，其能提高頭腎指數以及血清中白細胞數量、白細胞的吞噬能力和免疫球蛋白M的含量[20]；對牙鲆的研究表明，適宜水平的異亮氨酸可以提高頭腎的呼吸爆發(fā)活性[78]。研究表明，適宜水平的異亮氨酸能夠提高牙鲆[78]、吉富羅非魚[25]、卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)[79]、建鯉[20]血清中溶菌酶、酸性磷酸酶活性以及C3和C4含量，從而提高機體非特異性免疫功能。目前關于異亮氨酸對魚類炎癥因子的影響僅有少量報道。在草魚的研究中發(fā)現(xiàn)，異亮氨酸顯著抑制了其鰓中由巨噬細胞分泌的促炎因子——腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)的表達，顯著促進了抗炎因子白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的表達[17]。Zhao等[20-21]對建鯉的研究表明，飼料中添加適宜水平的異亮氨酸可以改善建鯉的免疫反應，促進腸道和頭腎TGF-β的表達，抑制TNF-α的表達，同時發(fā)現(xiàn)，異亮氨酸可以提高草魚鰓中mTOR和其下游效應蛋白核糖體S6激酶(ribosomal protein S6 kinase，S6K1)mRNA的表達。研究表明mTOR活性的上調會抑制TNF-α含量的增加[17,80]，而S6K1則能激活IL-10和TGF-β[81]。由此推測，異亮氨酸很可能是通過上調mTOR和S6K1基因表達來調節(jié)促炎因子和抗炎因子的表達，從而調節(jié)機體的抗炎作用，但具體的調控機制還有待深入研究。

3.3 異亮氨酸對機體抗氧化功能的影響

機體在病理情況下產生過多的活性氧(reactive oxygen species，ROS)會導致氧化損傷[77]，而衡量氧化損傷程度高低的指標包括一些氧化產物和上皮細胞結構的完整性[82]。在建鯉[21]、草魚[17]、卵形鯧鲹[79]和建鯉[82]腸道上皮細胞中均發(fā)現(xiàn)適宜水平的異亮氨酸能顯著下調腸道組織或腸細胞及血清中的蛋白質氧化產物——蛋白質羰基(protein carbonyl，PC)和脂肪的氧化產物——丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量，以及評價上皮細胞完整性的胞外乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的活性，從而抵御機體的氧化應激。谷胱甘肽(glutathione，GSH)能有效地清除ROS，谷氨酸半胱氨酸連接酶(glutamate cysteine ligase，GCL)是GSH生物合成過程中的限速酶。在建鯉[21]和草魚[17]上的研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中補充異亮氨酸可以顯著提高建鯉腸道和草魚鰓中GSH含量，同時提高草魚肌肉中GCL的基因表達水平。

一些抗氧化物酶可以清除機體內的ROS。研究表明，添加適宜水平的異亮氨酸可以顯著增加牙鲆血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性[78]，抑制肝臟中過氧化氫酶(catalase，CAT)活性[83]；提高吉富羅非魚[25]和卵形鯧鲹[79]血清中SOD活性；提高建鯉[21]腸道中谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、SOD、谷胱甘肽硫轉移酶(glutathione S-transferase，GST)、CAT和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)活性，草魚鰓中SOD、CAT和GPx活性[17]。

此外，在草魚的研究中發(fā)現(xiàn)，異亮氨酸缺乏或過量會導致草魚肌肉中核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)mRNA表達水平的下降，適宜的異亮氨酸可抑制其降低[17]，Nrf2作為重要的轉錄因子可調節(jié)抗氧化酶基因的表達[84]，這說明異亮氨酸是通過Nrf2信號通路激活抗氧化防御系統(tǒng)。

3.4 異亮氨酸對腸道健康的影響

腸道消化酶活性是評價腸道對營養(yǎng)物質消化吸收能力的重要指標，除前面所述的異亮氨酸對腸道抗氧化和免疫指標的影響外[21]，飼料中適宜的異亮氨酸含量可以顯著提高吉富羅非魚[25]、卵形鯧鲹[79]腸道消化酶活性。王莉蘋等[83]和王旭等[85]對牙鲆的研究發(fā)現(xiàn)異亮氨酸和亮氨酸或異亮氨酸和纈氨酸的相互作用均可顯著提高其腸道消化酶活性，促進營養(yǎng)物質的吸收。胞質蛋白閉鎖小帶蛋白(zonula occludens，ZO)和閉合蛋白occludin、claudins組成的緊密連接蛋白(tight junctions，TJs)是保持細胞間結構完整性的重要蛋白[86]。在體外試驗中，異亮氨酸通過預防和修復途徑可以抑制銅誘導的建鯉原代腸上皮細胞的氧化損傷，從而保護腸上皮細胞的結構完整性[82]。在建鯉上的研究表明，異亮氨酸的缺乏上調了腸道occludin、claudin-3和claudin-7 mRNA表達水平[21]。這個結果與在草魚[17]上的研究結果不一致，在草魚上的研究表明適宜水平的異亮氨酸可以提高銅應激后草魚鰓中claudin-3、claudin-b、claudin-c、ZO-1和occludin mRNA表達水平[17]，從而提高細胞間的緊密連接。為了進一步闡明異亮氨酸與緊密連接蛋白的關系，Zhao等[21]檢測了調節(jié)緊密連接蛋白的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)信號通路，發(fā)現(xiàn)異亮氨酸對緊密連接蛋白基因表達的調控可能與下調細胞外調節(jié)蛋白激酶1(extracellular regulated protein kinase 1，ERK1)和提高p38MAPK基因表達有關。關于異亮氨酸對緊密連接蛋白相關基因的調控機制還需要深入的研究。

腸道微生物群對宿主動物的腸道健康起著重要作用。在建鯉上的研究發(fā)現(xiàn)，異亮氨酸促進了乳酸菌和芽孢桿菌的生長，抑制了嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和大腸桿菌(Escherichiacoli)的生長[21]。乳酸桿菌在抑制腸道內有害菌生長的同時，對緊密連接蛋白的分布與表達起到促進作用[87]，從而對腸道起到保護作用。而嗜水氣單胞菌和大腸桿菌則會破壞動物的腸道菌群結構，這說明異亮氨酸可以通過改善腸道菌群結構促進魚類腸道健康。

3.5 異亮氨酸對肉質的影響

異亮氨酸作為支鏈氨基酸，不同于非支鏈氨基酸，其主要在肌肉中分解代謝產生谷氨酸[66]。飼料中補充谷氨酸可以增強大西洋鮭魚(SalmosalarL.)魚片的硬度[88]?；诖?，Gan等[11]研究了異亮氨酸對草魚肌肉品質的影響。肌肉硬度和保水率是魚肉質量的2個重要參數，這些參數的下降通常被認為是魚肉質量損失的指標[89]。研究表明，飼料中缺乏(3.8 g/kg)或添加過量(18.5 g/kg)的異亮氨酸會使草魚幼魚肌肉剪切力與9.3 g/kg異亮氨酸組相比分別下降20%和30%；同時，異亮氨酸缺乏和過量還會導致肌肉蒸煮損失與12.5 g/kg異亮氨酸組相比分別增加近24%和26%。組織蛋白酶B和L在魚類肌肉降解過程中起關鍵作用[90]。飼料中添加9.3～12.5 g/kg異亮氨酸可以降低因異亮氨酸缺乏和過量引起的蛋白酶B和L活性的增強。Ofstad等[91]證明，膠原將肌肉纖維和纖維束粘在一起，有助于魚類肌肉的持水。缺乏異亮氨酸會導致草魚幼魚肌肉乳酸濃度的升高，當給予足夠水平的異亮氨酸時，可降低乳酸濃度。乳酸濃度與肌肉pH呈負相關[92]，而魚類肌肉pH下降通常伴隨著肌肉軟化和水分流失[93]。這表明，異亮氨酸可能通過降低魚體內乳酸濃度提高肌肉的pH，從而適當改善魚類的肉質。

4 小結與展望

目前，研究人員已經開展了大量關于水產動物異亮氨酸需要量的研究，魚類對異亮氨酸的需要量為0.47%～1.98%，蝦蟹類對異亮氨酸的需要量為1.01%～2.25%，而仿刺參對異亮氨酸的需要量為0.98%；同時，研究人員還研究了異亮氨酸與其他2個支鏈氨基酸之間的相互作用，開展了大量的關于異亮氨酸提高機體蛋白質代謝、免疫和抗氧化功能的研究。但是，關于異亮氨酸對腸道健康和肉質影響的報道相對較少，對其調控機制值得深入研究。此外，異亮氨酸還具有促進胰島素分泌的作用，暗示其可能具有調節(jié)機體糖、脂代謝的作用，未來有必要開展異亮氨酸對水產動物糖、脂代謝影響的研究。