止得咳顆粒提取工藝的優(yōu)化

梁潔 陳輝華 徐暉 謝譚芳 祁靜 信晨曦 陳日蘭 趙立春

摘 要 目的：優(yōu)化止得咳顆粒的提取工藝。方法：采用小鼠氨水引咳實(shí)驗(yàn)和二甲苯致耳腫脹實(shí)驗(yàn)初步篩選止得咳顆粒的提取方法（水提、醇提、水提醇沉法）?；谠摲降闹苽渎肪€，首先以吸水量為指標(biāo)，考察含揮發(fā)油藥材的浸泡時(shí)間;再并以揮發(fā)油得率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)考察加水量和提取時(shí)間，篩選含揮發(fā)油藥材的最優(yōu)提取工藝。以次野鳶尾黃素和總黃酮含量為指標(biāo)，在單因素考察的基礎(chǔ)上，采取正交試驗(yàn)考察加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)等3個(gè)因素的影響，優(yōu)化止得咳顆粒的水提工藝并驗(yàn)證。結(jié)果：藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，水提物低、高劑量組（6.34、12.68 g/kg，以生藥量計(jì)）和水提醇沉提取物高劑量組（12.68 g/kg，以生藥量計(jì)）小鼠的咳嗽潛伏期均較模型組顯著延長(zhǎng)，2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著減少（P<0.05或P<0.01）;水提物低、高劑量組（6.34、12.68 g/kg，以生藥量計(jì)），醇提物高劑量組（12.68 g生藥/kg，以生藥量計(jì)）和水提醇沉提取物高劑量組（12.68 g/kg，以生藥量計(jì)）小鼠的耳腫脹度均較模型組顯著降低（P<0.05或P<0.01），水提物、醇提物和水提醇沉提取物低、高劑量組的腫脹抑制率分別為42.26%、55.08%、33.49%、51.56%、39.57%、44.36%，表明以水提法所得提取物的止咳、抗炎效果更優(yōu)。含揮發(fā)油藥材的最優(yōu)提取工藝為加入5倍量水，浸泡30 min，提取3 h。最佳水提工藝為加入12倍量水，浸泡50 min后提取3次，每次1.0 h;3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，最優(yōu)工藝所得提取物中次野鳶尾黃素的平均含量為76.47 μg/g（RSD=2.15%，n=3），總黃酮的平均含量為92.45 mg/g（RSD=0.48%，n=3）。結(jié)論：優(yōu)化的止得咳顆粒提取工藝穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞 止得咳顆粒;藥效學(xué);正交試驗(yàn);提取工藝

中圖分類號(hào) R285.5;R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）07-0832-07

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To optimize the extraction technology of Zhideke granules. METHODS： The extraction technology （water extraction， alcohol extraction， water extraction and ethanol precipitation） of Zhideke granules was initially screened by ammonia-induced cough experiment and xylene-induced ear swelling experiment in mice. Based on its preparation route， the immersion time of medicinal materials containing volatile oil was investigated with water absorption as index firstly. The single factor test was adopted to investigate the amount of water added and the extraction time taking the volatile oil yield as index to optimize the extraction technology of medicinal materials containing volatile oil. Taking the contents of irisflorentin and total flavonoids as indicators， on the basis of single factor investigation， orthogonal test was adopted to examine the influence of three factors including the amount of water added， extraction time and extraction frequency， so as to optimize the water extraction technology of Zhideke granules and the validation tests were conducted. RESULTS： The results of pharmacodynamics experiment showed that the cough latency of mice in water extract low-dose and high-dose groups （6.34， 12.68 g/kg， by crude drug） and water-extraction alcohol-precipitation extract high-dose group （12.68 g/kg， by crude drug） were significantly longer than those in model group， and the number of cough within 2 minutes was significantly reduced （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， the ear swelling of mice in water extract low-dose and high-dose groups （6.34， 12.68 g/kg， by crude drug）， ethanol extract high-dose group （12.68 g/kg， by crude drug） and water-extraction alcohol-precipitation extract high- dose group （12.68 g/kg， by crude drug） were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The swelling inhibition rates were 42.26%， 55.08%， 33.49%， 51.56%， 39.57% and 44.36% in low-dose and high-dose groups of water extract， alcohol extract， water-extraction and alcohol-precipitation extract respectively， indicating that the water extract had better antitussive and anti-inflammatory effects. The optimal extraction technology of volatile oil was adding 5-fold water， soaking for 30 minutes， and extracting for 3 hours. The optimal water extraction technology was adding 12-fold water， extracting for 3 times after soaked for 50 min， lasting for 1 h each time. Results of 3 times of validation tests showed that average content of irisflorentin in the extract obtained by optimal technology was 76.47 μg/g （RSD=2.15%， n=3） and the average content of total flavonoids was 92.45 mg/g （RSD=0.48%， n=3）. CONCLUSIONS： The optimal extraction technology of Zhideke granules is stable and feasible.

KEYWORDS? ?Zhideke granules; Pharmacodynamics; Orthogonal test; Extraction technology

止得咳方為廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由龍脷葉、射干、黃芩、桔梗、白前、青天葵、枇杷葉、柴胡、薄荷、荊芥共10味藥材配伍而成。該方具有疏風(fēng)清熱、止咳利咽的功效，可用于治療急慢性支氣管炎、上呼吸道感染、肺炎、急性咽炎等風(fēng)熱犯肺者[1-3]。方中龍脷葉性平，味甘、淡，入肺經(jīng)，具有清熱化痰、止咳平喘之功效;射干味苦，性寒，具有清熱解毒、消痰、利咽之功效，亦歸肺經(jīng);二者共為君藥[3]。研究表明，與單用氨茶堿相比，止得咳方在改善支氣管哮喘急性發(fā)作期患者臨床癥狀、提高其生活質(zhì)量方面有一定的優(yōu)勢(shì)，且安全性好、毒副作用少;此外，該方治療風(fēng)熱犯肺型咳嗽變異性哮喘合并支原體感染患者的臨床療效顯著，具有一定的臨床價(jià)值[1，4]。止得咳方以湯劑形式應(yīng)用于臨床，但該劑型存在煎煮麻煩、口感差、不易攜帶和保存等不足，影響了患者的用藥順應(yīng)性，故本研究擬將該方制成適合于工業(yè)化生產(chǎn)且便于患者使用的中藥復(fù)方顆粒劑;同時(shí)，為保證制劑的質(zhì)量和療效，本研究擬對(duì)止得咳顆粒劑的提取工藝進(jìn)行考察。目前，復(fù)方制劑的提取工藝多以指標(biāo)性成分含量為依據(jù)進(jìn)行篩選，容易忽略最根本的藥效學(xué)指標(biāo)?；诖?，本研究參考文獻(xiàn)[5-10]，初步設(shè)計(jì)了3種止得咳顆粒的提取方法，并對(duì)各工藝所制樣品進(jìn)行止咳和抗炎的藥效學(xué)研究，確定出最優(yōu)提取工藝方案;再在單因素考察的基礎(chǔ)上，以次野鳶尾黃素（君藥射干的主要活性成分[11]）和總黃酮（止得咳顆粒的藥效活性組分[12-21]）含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化止得咳顆粒的提取工藝，為該顆粒劑提取工藝的優(yōu)化提供合理依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

實(shí)驗(yàn)用主要儀器包括Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）、WH-2000超聲波霧化器（廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司）、UV-2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)[島津儀器（蘇州）有限公司]、TGL-16G型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、UPC-Ⅱ-10T型實(shí)驗(yàn)室超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）、XS104型分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、HH-S6型恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、KH-500B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）、揮發(fā)油提取器（安徽美星實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、8 mm打孔器（張家港市雙銀醫(yī)療器械有限公司）等。

1.2 主要藥品和試劑

龍脷葉、射干、黃芩、薄荷、白前、柴胡、桔梗、荊芥、青天葵、枇杷葉等10味藥材均購(gòu)自廣西仙茱中藥科技有限公司（批號(hào)分別為20181001、20171101、20180601、20171101、20170201、20180501、20180501、20180601、20170901、20171001），經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院滕建北教授鑒定均為真品，且符合2015版《中國(guó)藥典》（一部）和《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第2卷）》項(xiàng)下相關(guān)規(guī)定[11，22]。

次野鳶尾黃素對(duì)照品（批號(hào)111557-200602，供含量測(cè)定用）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080-201409，供含量測(cè)定用）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;實(shí)驗(yàn)用藥品和試劑還包括磷酸可待因片（青海制藥廠有限公司，批號(hào)20180433，規(guī)格30 mg）、醋酸氫化可的松片（上海上藥信誼藥廠有限公司，批號(hào)2019180401，規(guī)格20 mg）、苯酚紅（成都金山化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20180706，分析純）、氨水（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20160322，分析純）、二甲苯（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)2018022，分析純）等;其余試劑亦為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用SPF級(jí)昆明種小鼠雌雄兼有，體質(zhì)量18～22 g，1.5～2月齡，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（湘）2016-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 止得咳顆粒提取方法的初步篩選

2.1.1 止得咳顆粒提取方法的設(shè)計(jì)與提取物的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[5-10]，該方藥材的提取方法主要包括水煎煮法和乙醇回流提取法。在此基礎(chǔ)上，本研究初步篩選設(shè)計(jì)了3種提取方法。（1）水提法：按處方量（龍脷葉、射干、黃芩、桔梗、白前、青天葵、枇杷葉、柴胡、荊芥、薄荷質(zhì)量比為3 ∶ 3 ∶ 2 ∶ 3 ∶ 3 ∶ 2 ∶ 3 ∶ 3 ∶ 2 ∶ 2，下同）取全方各藥材適量，加12倍量（mL/g，下同）水，煎煮提取3次，每次1 h，濾過(guò)，合并濾液，濃縮成稠膏（得膏率為34.58%）。（2）水提醇沉法：按處方量稱取全方各藥材適量，按上述水提法提取，合并濾液，濃縮;加乙醇至上述濃縮液中，使乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，靜置過(guò)夜，濾過(guò)，收集濾液并濃縮成稠膏（得膏率為16.75%）。（3）醇提法：按處方量稱取全方各藥材適量，加12倍量95%乙醇回流提取3次，每次1 h，濾過(guò)，合并濾液，濃縮成稠膏（得膏率為26.06%）。

2.1.2 止得咳顆粒不同提取物的止咳作用比較

采用小鼠氨水引咳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較[23-25]。將昆明種小鼠分為模型組、磷酸可待因組（陽(yáng)性對(duì)照，0.011 g/kg）、水提物低劑量組（2.19 g/kg，相當(dāng)于生藥6.34 g/kg）、水提物高劑量組（4.38 g/kg，相當(dāng)于生藥12.68 g/kg）、醇提物低劑量組（1.65 g/kg，相當(dāng)于生藥6.34 g/kg）、醇提物高劑量組（3.30 g/kg，相當(dāng)于生藥12.68 g/kg）、水提醇沉提取物低劑量組（1.06 g/kg，相當(dāng)于生藥6.34 g/kg）、水提醇沉提取物高劑量組（2.12 g/kg，相當(dāng)于生藥12.68 g/kg），每組10只，雌雄各半。磷酸可待因組給藥劑量根據(jù)臨床用量按體表面積換算成小鼠等效劑量;各提取物組給藥劑量均參照本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并根據(jù)該方臨床用量按體表面積換算為小鼠等效劑量，其中高、低劑量分別相當(dāng)于成人用量的1/5、1/10。上述藥物均以水為溶劑配成相應(yīng)藥液。模型組小鼠灌胃等體積水，各藥物組小鼠灌胃相應(yīng)藥液，灌胃體積均為0.02 mL/g，每天1次，連續(xù)給藥7天。末次給藥前禁食不禁水12 h，末次給藥后1 h，將小鼠放入燒杯中并罩住燒杯口，用超聲波霧化器向燒杯中通入濃氨水噴霧，20 s后停止。取出小鼠，觀察并記錄2 min內(nèi)其咳嗽次數(shù)（小鼠腹部收縮或縮胸，同時(shí)張大嘴、頭向前傾，有時(shí)帶有咳嗽聲等為小鼠咳嗽1次）和潛伏期（從誘咳至發(fā)生第1次咳嗽的時(shí)間）。采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;計(jì)量資料均以x±s表示，組間比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析;P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果，與模型組比較，水提物低、高劑量組，水提醇沉提取物高劑量組和磷酸可待因組小鼠的咳嗽潛伏期均顯著延長(zhǎng)，2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)均顯著減少（P<0.05或P<0.01），詳見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，與其他方法相比，以水提法所制提取物的止咳效果相對(duì)最佳。

2.1.3 止得咳顆粒不同提取物的抗炎作用比較

采用二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較[23-24]。將雄性小鼠分為模型組、醋酸氫化可的松組（陽(yáng)性對(duì)照，0.011 4 g/kg）和水提物、醇提物、水提醇沉提取物的低、高劑量組（劑量同“2.1.2”項(xiàng)），每組10只。醋酸氫化可的松組給藥劑量根據(jù)臨床用量按體表面積換算成小鼠等效劑量;各提取物組給藥劑量設(shè)置依據(jù)同“2.1.2”項(xiàng)。上述藥物均以水為溶劑配成相應(yīng)藥液。模型組小鼠灌胃等體積水，各藥物組小鼠灌胃相應(yīng)藥液，灌胃體積均為0.02 mL/g，每天1次，連續(xù)給藥7天。末次給藥前禁食不禁水12 h，末次給藥后1 h，小鼠左耳均勻涂抹二甲苯40 μL，右耳（不作處理）作為對(duì)照，20 min后處死，剪下兩耳，在相同位置打孔并稱定兩耳片的質(zhì)量，計(jì)算腫脹度和腫脹抑制率：腫脹度=腫脹耳（左耳）質(zhì)量-對(duì)照耳（右耳）質(zhì)量，腫脹抑制率（%）=（模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度）/模型組平均腫脹度×100%。按“2.1.2”項(xiàng)下統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果，與模型組比較，水提物低、高劑量組，醇提物高劑量組，水提醇沉提取物高劑量組和醋酸氫化可的松組小鼠的耳腫脹度均顯著降低（P<0.05或P<0.01），水提物、醇提物、水提醇沉提取物的低、高劑量組以及醋酸可的松組的腫脹抑制率分別為42.29%、55.08%、33.49%、51.56%、39.57%、44.36%、63.31%，詳見(jiàn)表2。可見(jiàn)，與其他方法相比，以水提法所制提取物的抗炎效果相對(duì)最佳。

2.1.4 止得咳顆粒提取方法初篩結(jié)果

結(jié)合“2.1.2”“2.1.3”的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，以水為溶劑所制止得咳顆粒提取物的藥效相對(duì)最佳，故以水提法為該方提取方法。

2.2 止得咳顆粒含揮發(fā)油藥材提取工藝篩選

根據(jù)本課題組前期設(shè)計(jì)，止得咳顆粒的制備路線大致如下：先將含揮發(fā)油藥材（薄荷和荊芥）進(jìn)行提取，所得揮發(fā)油以倍他環(huán)糊精包合，備用;揮發(fā)油提取所得提取液經(jīng)濾過(guò)后備用;將揮發(fā)油提取后的藥渣與其余8味藥材混合，進(jìn)行水提，濾過(guò)，取濾液與上述含揮發(fā)油藥材提取液合并，濃縮至浸膏，加入適量蔗糖和環(huán)糊精混勻，再以乙醇制粒，干燥;隨后加入揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物，混勻，即得。因此，參考上述制備路線，本研究先采用單因素試驗(yàn)進(jìn)行含揮發(fā)油藥材提取工藝的篩選，再進(jìn)行水提工藝的優(yōu)化。

2.2.1 浸泡時(shí)間考察

取荊芥、薄荷藥材各111 g，共5份，加6倍量水（即質(zhì)量倍數(shù)，下同），分別浸泡10、20、30、40、50 min，濾過(guò)，稱取藥材吸水后的質(zhì)量，計(jì)算吸水率：吸水率=（藥材吸水后的質(zhì)量-藥材原質(zhì)量）/藥材原質(zhì)量×100%。結(jié)果，當(dāng)浸泡時(shí)間≥30 min，藥材的吸水率無(wú)明顯變化（約207%），提示藥材吸水基本已達(dá)飽和，故確定藥材的浸泡時(shí)間為30 min，詳見(jiàn)表3。

2.2.2 加水量考察

取荊芥、薄荷藥材各111 g，共3份，分別加入4、5、6倍量水，浸泡30 min后，加熱至沸騰并保持微沸提取3 h，計(jì)算揮發(fā)油得率：揮發(fā)油得率=所得揮發(fā)油質(zhì)量/藥材原質(zhì)量×100%。結(jié)果，當(dāng)加水量為5倍量時(shí)，總揮發(fā)油得率達(dá)到最高，故選擇加水量為5倍，詳見(jiàn)表4。

2.2.3 提取時(shí)間考察

取荊芥、薄荷藥材各111 g，共3份，加入5倍量水，浸泡30 min后，加熱至沸騰并保持微沸提取0.5、1、1.5、2、2.5、3、4 h，分別按“2.2.2”項(xiàng)下公式計(jì)算提取不同時(shí)間的揮發(fā)油得率，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行測(cè)定3次。結(jié)果，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)，揮發(fā)油得率基本達(dá)到最高值;再延長(zhǎng)提取時(shí)間，揮發(fā)油得率無(wú)明顯變化，因此確定提取時(shí)間為3 h，詳見(jiàn)表5。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)過(guò)上述單因素考察，確定含揮發(fā)油藥材的最優(yōu)提取工藝為加5倍量水、浸泡30 min后提取3 h。取荊芥、薄荷藥材各111 g，共3份，按上述最優(yōu)提取工藝提取并按“2.2.2”項(xiàng)下公式計(jì)算揮發(fā)油得率。結(jié)果顯示，在上述工藝條件下，揮發(fā)油得率均為0.36%，與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。這表明單因素試驗(yàn)篩選的最優(yōu)含揮發(fā)油藥材提取工藝穩(wěn)定、可行。

2.3 止得咳顆粒水提工藝優(yōu)化

2.3.1 次野鳶尾黃素的含量測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定止得咳顆粒水提物中次野鳶尾黃素的含量。

（1）色譜條件：以Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇-0.2%磷酸水溶液? （55 ∶ 45，V/V）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm，流速為0.8? mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

（2）溶液的制備：精密稱取次野鳶尾黃素對(duì)照品2.8 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為0.28 mg/mL的次野鳶尾黃素對(duì)照品溶液。取止得咳顆粒水提物約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加水15 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）提取30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液。

（3）方法學(xué)考察：按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）[26]要求進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果，以待測(cè)物質(zhì)量濃度（X，? ? ?μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，求得回歸方程為Y=65.676 2X-29.554 3（r=0.999 6），表明次野鳶尾黃素檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為2.800～42.00 μg/mL。精密度試驗(yàn)的RSD為0.95%（n=6）;穩(wěn)定性試驗(yàn)（24 h）的RSD為2.49%（n=7）;重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，次野鳶尾黃素的平均含量為40.91 μg/g，RSD為1.85%（n=6）;平均加樣回收率為99.42%，RSD為1.92%（n=6）。這表明方法的精密度、重復(fù)性、準(zhǔn)確度均良好，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（4）樣品測(cè)定：精密稱取水提物樣品，按“2.3.1（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。每份樣品重復(fù)測(cè)定2次，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中次野鳶尾黃素的含量，取平均值。

2.3.2 總黃酮的含量測(cè)定

采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定止得咳顆粒水提物中總黃酮的含量（以蘆丁計(jì)）。

（1）溶液的制備：精密稱取蘆丁對(duì)照品48.5 mg，置于50 mL量瓶中，加乙醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為0.97 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。取止得咳顆粒水提物約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入水10 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液。

（2）測(cè)定波長(zhǎng)的確定：取“2.3.2（1）”項(xiàng)下蘆丁對(duì)照品溶液，分別加5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min;加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min;加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，再加乙醇定容至25 mL，放置15 min。以相應(yīng)試劑（即乙醇）作空白，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果，蘆丁的最大吸收波長(zhǎng)為509 nm，故將其作為測(cè)定波長(zhǎng)。

（3）方法學(xué)考察：按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）[26]要求進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果，以待測(cè)物質(zhì)量濃度（X，? ? ?μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，求得回歸方程為Y=1.099 1X+0.002 7（r=0.999 8），表明蘆丁檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.019 4～0.077 6 mg/mL。精密度試驗(yàn)的RSD為0.39%（n=6）;穩(wěn)定性（24 h）試驗(yàn)的RSD為0.28%（n=7）;重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，總黃酮的平均含量為52.61 mg/g，RSD為1.52%（n=6）;平均加樣回收率為99.54%，RSD為1.34%（n=6）。這表明方法的精密度、重復(fù)性、準(zhǔn)確度均良好，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（4）樣品測(cè)定：精密稱取水提物樣品，按“2.3.2（1）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.2（2）”項(xiàng)下條件測(cè)定吸光度。每份樣品重復(fù)測(cè)定3次，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中總黃酮的含量，取平均值。

2.3.3 止得咳顆粒水提工藝的單因素考察

本研究對(duì)藥材浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、提取次數(shù)等因素進(jìn)行單因素考察[25，27]。

（1）藥材浸泡時(shí)間：按處方比例稱取藥材，共8份，每份192.4 g（為原組方藥材總質(zhì)量的1/5，其中荊芥和薄荷為提取揮發(fā)油后的藥材殘?jiān)峦?，加?0倍量水分別浸泡10、20、30、40、50、60、70、80 min，濾過(guò)，稱取藥材吸水后的質(zhì)量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法計(jì)算其吸水率，以考察不同浸泡時(shí)間的影響。結(jié)果表明，當(dāng)浸泡時(shí)間≥50 min時(shí)，藥材的吸水率未見(jiàn)明顯變化，說(shuō)明藥材吸水性已到達(dá)飽和狀態(tài)，此時(shí)的吸水率為178.61%，詳見(jiàn)表6。從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，為確保藥材得以充分浸泡，確定藥材的浸泡時(shí)間為50 min。

（2）提取時(shí)間：按處方比例稱取藥材，共5份，每份192.4 g，加入10倍量水，浸泡50 min后，分別提取30、60、90、120、150 min，提取次數(shù)固定為1次。將提取液濃縮，按“2.3.1”“2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定次野鳶尾黃素和總黃酮的含量，并計(jì)算次野鳶尾黃素的轉(zhuǎn)移率（總黃酮無(wú)轉(zhuǎn)移率之說(shuō)，故不作考察）：轉(zhuǎn)移率=水提取浸膏中次野鳶尾黃素含量/藥材中次野鳶尾黃素含量×100%，以考察不同提取時(shí)間的影響。結(jié)果，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，次野鳶尾黃素和總黃酮的含量也有所增加。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到90 min時(shí)，次野鳶尾黃素和總黃酮的含量分別達(dá)到了12.28 μg/g、40.25 mg/g，次野鳶尾黃素的轉(zhuǎn)移率為8.51%;當(dāng)再增加提取時(shí)間后，次野鳶尾黃素的含量和轉(zhuǎn)移率均變化不大，而總黃酮的含量有所下降;此外，當(dāng)提取時(shí)間為60、90 min時(shí)，該方君藥指標(biāo)性成分次野鳶尾黃素的含量差異不明顯，詳見(jiàn)表7。從減少耗能等生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，選擇提取時(shí)間為60 min。

（3）提取次數(shù)：按處方比例稱取藥材，共4份，每份192.4 g，加入10倍量水，浸泡50 min后，分別提取1、2、3、4次，每次均加入10倍量水、提取60 min。合并提取液并濃縮后，按“2.3.1”“2.3.2”“2.3.3（2）”項(xiàng)下方法測(cè)定水提物中次野鳶尾黃素、總黃酮的含量和次野鳶尾黃素的轉(zhuǎn)移率，以考察不同提取次數(shù)的影響。結(jié)果，隨著提取次數(shù)的不斷增加，各指標(biāo)含量均呈不同程度的上升趨勢(shì);當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到3次時(shí)，次野鳶尾黃素和總黃酮的含量分別為49.57 μg/g、76.09 mg/g，次野鳶尾黃素的轉(zhuǎn)移率為39.40%;而當(dāng)提取次數(shù)為4次時(shí)，各指標(biāo)含量及次野鳶尾黃素轉(zhuǎn)移率的增幅均不大，詳見(jiàn)表8。從減少能耗等生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，選擇提取次數(shù)為3次。

2.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化止得咳顆粒的水提工藝

在單因素考察的基礎(chǔ)上，以次野鳶尾黃素和總黃酮的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)（因次野鳶尾黃素轉(zhuǎn)移率的變化趨勢(shì)與其含量基本一致，故未將轉(zhuǎn)移率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)），選定加水倍量（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）為考察因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。各試驗(yàn)均在藥材浸泡50 min后進(jìn)行。止得咳顆粒水提工藝正交試驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表9，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表10，其方差分析結(jié)果見(jiàn)表11。

由表10、表11可知，表中極差值的大小提示各因素對(duì)次野鳶尾黃素和總黃酮含量的影響大小依次均為：提取次數(shù)>加水倍量>提取時(shí)間，其中提取次數(shù)對(duì)上述成分含量的影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而加水倍量和提取時(shí)間的影響則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;直觀分析表明，以次野鳶尾黃素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)的最優(yōu)條件為A3B1C3，以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)的最優(yōu)條件為A3B3C3。由于提取時(shí)間的影響較弱，綜合考慮資源節(jié)約等生產(chǎn)實(shí)際，最終確定最優(yōu)水提工藝為A3B2C3，即用12倍量的水，浸泡50 min后提取3次，每次提取1 h。

2.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方比例稱取藥材，共3份，每份962 g;先按“2.2”項(xiàng)下方法提取荊芥和薄荷揮發(fā)油后，再將藥材殘?jiān)c其余8味藥材混合，按上述最優(yōu)水提工藝進(jìn)行提取，最后按“2.3.1”“2.3.2”項(xiàng)下方法檢測(cè)提取物中次野鳶尾黃素和總黃酮的含量。結(jié)果，3次驗(yàn)證試驗(yàn)所得提取物中次野鳶尾黃素的含量分別為77.84、77.41、74.16 μg/g，平均含量為76.47 μg/g（RSD=2.15%，n=3）;總黃酮的含量分別為93.07、92.23、92.06 mg/g，平均含量為92.45 mg/g（RSD=0.48%，n=3）。這提示該優(yōu)化水提工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

3.1 止得咳顆粒藥效學(xué)模型的建立

誘發(fā)咳嗽常用的化學(xué)刺激法包括氣霧吸入和直接注入兩種方法，其中氣霧吸入法主要是將沒(méi)有麻醉的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（如大鼠、小鼠）置于恒定容積的密閉容器內(nèi)，放入一定量的刺激性氣體，誘發(fā)其咳嗽;直接注入法則是給麻醉動(dòng)物（如兔）插入氣管套管，把規(guī)定劑量的刺激性氣體直接充入氣管套管中，誘發(fā)其咳嗽[27]。但有研究指出，后一種方法若操作不當(dāng)或麻醉過(guò)深則有可能會(huì)抑制咳嗽反射，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[27]。通過(guò)比較兩種方法，本研究選擇使用氣霧吸入氨水法來(lái)誘發(fā)咳嗽，此法操作簡(jiǎn)便且實(shí)驗(yàn)結(jié)果易觀察。

本研究通過(guò)化學(xué)試劑二甲苯涂抹小鼠耳朵致腫脹來(lái)建立急性炎癥模型，二甲苯致炎機(jī)制與臨床常見(jiàn)急性炎癥類似，且有操作簡(jiǎn)單、流程少、無(wú)需專用設(shè)備、效果好、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于抗炎效果評(píng)價(jià)和抗炎靶點(diǎn)化合物的篩選[28]。有研究指出，二甲苯可引起組胺激肽和纖維蛋白等炎癥介質(zhì)的溶出釋放，導(dǎo)致局部血管擴(kuò)張、毛細(xì)管通透性增加、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，誘發(fā)耳部急性滲出性炎癥水腫，從而建立急性炎癥模型[29]。

3.2 止得咳顆粒工藝優(yōu)化中評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇

通過(guò)處方分析，方中龍脷葉和射干作為君藥，故選擇其中的有效成分作為指標(biāo)性成分。在預(yù)試驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)龍脷葉的指標(biāo)性成分山柰酚-3-O-龍膽二糖苷缺乏特應(yīng)性的色譜條件（即陰性對(duì)照有干擾），故暫未選擇該成分作為止得咳顆粒劑的指標(biāo)性成分;而射干的另一指標(biāo)性成分次野鳶尾黃素在上述相同條件下不受陰性對(duì)照的干擾，因此選擇將其作為止得咳顆粒劑的指標(biāo)性成分，并建立了測(cè)定其含量的高效液相色譜法[11]。此外，筆者通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，該方中黃芩、射干和青天葵等多味藥材均含有黃酮類成分[12-20]，且黃酮類化合物在抗炎、鎮(zhèn)咳、抗菌、抗病毒等方面均具有一定的藥理活性[21]，因此本研究選擇總黃酮含量作為另一考察指標(biāo)，并建立了以蘆丁為對(duì)照、經(jīng)亞硝酸鈉-亞硝酸鋁-氫氧化鈉顯色的紫外-可見(jiàn)分光光度法。

3.3 止得咳顆粒提取工藝的篩選和優(yōu)化

為避免以化學(xué)成分為指標(biāo)所導(dǎo)致的評(píng)價(jià)片面性和局限性，本研究首先采用藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)初步篩選了該制劑的提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以水為溶劑所得提取物的藥效優(yōu)于乙醇提取和水提醇沉所得提取物，故選擇水提法。止得咳方中荊芥和薄荷的主要成分是揮發(fā)油，故參考其顆粒制備路線，本研究?jī)?yōu)化了荊芥、薄荷揮發(fā)油提取的水蒸氣蒸餾法：以揮發(fā)油得率為指標(biāo)，考察浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間等3個(gè)因素，優(yōu)選出揮發(fā)油最優(yōu)提取工藝，即加5倍量水，浸泡30 min后提取3 h。最后，本研究以次野鳶尾黃素和總黃酮含量為指標(biāo)，在單因素考察的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化水提工藝，最終確定其最優(yōu)水提工藝為加12倍量的水，浸泡50 min后提取3次，每次1 h;3次驗(yàn)證試驗(yàn)所得提取物中次鳶尾黃素、總黃酮的平均含量為76.47 μg/g、92.45 mg/g（RSD<2.2%，n=3）。

綜上所述，本研究所優(yōu)化的止得咳顆粒水提取工藝穩(wěn)定、可行，可為該制劑的后續(xù)研發(fā)提供參考。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 辛靜，李麗麗，凌愛(ài)思.止得咳沖劑治療支氣管哮喘急性發(fā)作期的臨床觀察[J].廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，16（1）：35-36.

[ 2 ] 黃敏，黃國(guó)東，韋瑀龍，等.止得咳顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2018，15（30）：106-110.

[ 3 ] 周昱杉，梁潔，黃光強(qiáng)，等.基于化學(xué)模式識(shí)別方法分析止得咳顆粒的抗炎譜效關(guān)系[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2020，26（22）：156-163.

[ 4 ] 楊紅梅，陳斯寧，潘玲，等.止得咳顆粒治療風(fēng)熱犯肺型咳嗽變異性哮喘合并支原體感染的臨床研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2020，31（5）：1150-1151.

[ 5 ] 王繼華，曹陽(yáng)，蔡時(shí)可.南藥龍脷葉的研究進(jìn)展[J].園藝與種苗，2018，38（1）：59-62.

[ 6 ] 王紅麗，張曉明，焦正花，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)化射干扶正口服液的提取工藝[J].西部中醫(yī)藥，2012，25（2）：23-24.

[ 7 ] 汪天青，張穎，姜鴻，等.中藥射干提取物改善豚鼠呼吸道合胞病毒感染后氣道炎癥的作用研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2019，37（9）：2128-2132、2313.

[ 8 ] 王船英.桔梗最優(yōu)提取工藝研究[J].九江學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018（3）：92-94、97.

[ 9 ] 李婷婷.柳葉白前化學(xué)成分及其抗氧化活性研究[D].延吉：延邊大學(xué)，2015.

[10] 牛成偉，藍(lán)建東，王童珍，等.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化黃芩中總黃酮的提取工藝[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2019，28（21）：39- 41.

[11] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：97、109-110、204- 205、232-233、277、280-281、285、301-302、377-378.

[12] 齊建紅.超聲細(xì)胞粉碎法提取射干總黃酮的工藝研究[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，65（8）：1-3.

[13] 謝雄雄，張遲，曾金祥，等.中藥桔梗的化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥通報(bào)，2018，17（5）：13、66-72.

[14] 劉洋，王四旺，唐志書(shū).白前的現(xiàn)代研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[J].西北藥學(xué)雜志，2015，30（6）：768-770.

[15] 朱芳，陳曉靚，鄧紅軍，等.黃芩的研究進(jìn)展[J].廣東化工，2020，47（12）：135-136.

[16] 蔡樂(lè).青天葵藥材生化成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，16（8）：244-246.

[17] 肖旭坤，王翰華，阮洪生.枇杷葉化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2019，25（21）：60-66.

[18] 王夢(mèng)迪，靳光乾.柴胡中藥資源研究進(jìn)展[J].山東林業(yè)科技，2019，49（3）：107-110、114.

[19] 徐軍，武毛毛，鄧芬，等.薄荷中黃酮的研究進(jìn)展[J].內(nèi)江科技，2012（1）：24、40.

[20] 黃曉巍，劉玥欣，劉軼薔，等.荊芥化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].吉林中醫(yī)藥，2017，37（8）：817-819.

[21] 汪海峰，劉沁源.黃酮類化合物藥理活性及其治療效果研究新進(jìn)展[J].西南國(guó)防醫(yī)藥，2020，30（6）：593-595.

[22] 廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局.廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：第2卷[S].南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2011：162-163.

[23] 匡淼，楊巧麗，王林林，等.蒿藍(lán)感冒顆?？寡?、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳及解熱作用研究[J].中藥藥理與臨床，2013，29（6）：144- 147.

[24] 劉海鋒，黃山，玄光善，等.復(fù)方桔梗合劑止咳及抗炎活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2017，23（4）：59-62.

[25] 陸賽衛(wèi)，玄振玉.風(fēng)葉止咳口服液止咳、平喘、化痰的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2015，17（5）：448-452.

[26] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[S]. 2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：374-377.

[27] 張丹參.誘發(fā)咳嗽動(dòng)物模型方法及評(píng)價(jià)[J].神經(jīng)藥理學(xué)報(bào)，2011，1（2）：35-42.

[28] 谷捷，李鑫，余黃合，等.二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型的建立[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，36（5）：32-35.

[29] 楊巧芳，孟慶剛.炎癥動(dòng)物模型探要[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（3）：516-517.

（收稿日期：2020-09-04 修回日期：2021-01-19）

（編輯：張?jiān)拢?/p>