藥用植物內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物藥理作用研究進(jìn)展

張國(guó)榮 翟麗霞 王燕萍 周燕

摘 要 目的：了解藥用植物內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的藥理作用，以期為藥用植物保護(hù)、天然藥物資源擴(kuò)展及新藥研發(fā)提供參考。方法：對(duì)近年來(lái)藥用植物內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物藥理作用的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)分析。結(jié)果與結(jié)論：內(nèi)生菌從寄主植物中吸取營(yíng)養(yǎng)并通過(guò)新陳代謝等生命活動(dòng)產(chǎn)生的物質(zhì)即為次級(jí)代謝產(chǎn)物。藥用植物內(nèi)生菌的次級(jí)代謝物含有許多與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)，例如從川芎中分離的枯草芽孢桿菌可產(chǎn)生川芎嗪，從雷公藤內(nèi)生曲霉屬真菌中可分離新的丁烯酸內(nèi)酯，從內(nèi)生放線菌可分離產(chǎn)生生物堿、多肽、聚酮類、萜類等多種生物活性物質(zhì)。這些產(chǎn)物的活性甚至要強(qiáng)于宿主植物的活性物質(zhì)，而且其還含有許多具有新的生物活性的物質(zhì);其藥理活性主要包括抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗高血糖、抗寄生蟲(chóng)等。藥用植物內(nèi)生菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物是龐大的潛在藥用物質(zhì)資源庫(kù)，具有良好的開(kāi)發(fā)前景，但目前內(nèi)生菌離開(kāi)宿主藥用植物后的培養(yǎng)問(wèn)題極大地限制了其次級(jí)代謝產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)。

關(guān)鍵詞 藥用植物;內(nèi)生菌;次級(jí)代謝產(chǎn)物;藥理活性

中圖分類號(hào) R932 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）07-0880-05

植物內(nèi)生菌（Endophytes）是寄生于活體植物各組織和器官內(nèi)的寄生菌，其不會(huì)引起明顯的宿主植物外在感染癥狀，且種類豐富，主要包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌等[1-2]。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，一些內(nèi)生菌與其宿主植物間建立了互惠共生關(guān)系：內(nèi)生菌從植物中吸取營(yíng)養(yǎng)，其次級(jí)代謝產(chǎn)物又可調(diào)節(jié)植物的免疫系統(tǒng)、促進(jìn)植物的生長(zhǎng)、增加植物對(duì)生物（病原體、害蟲(chóng)和動(dòng)物等）或非生物（溫度、pH值、鹽、堿、重金屬、滲透壓、紫外和海拔等）脅迫的耐受性[3-9]。研究指出，內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物不僅能抑制病原微生物，還可以激活宿主植物的免疫應(yīng)答系統(tǒng)，增強(qiáng)植物防御相關(guān)基因的表達(dá)譜[10-11]。1993年，Stierle等[12]從短葉紫杉中分離到1株內(nèi)生真菌，并發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)生與宿主植物一樣的抗腫瘤物質(zhì)紫杉醇，提示藥用植物內(nèi)生菌具有合成和宿主植物相同或相似活性成分的能力，從此也啟發(fā)了國(guó)內(nèi)外研究者從植物內(nèi)生菌中尋找生物活性物質(zhì)的思路。近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)，藥用植物內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物不但具有與宿主植物相同或相似的藥理作用，而且具有其他新的生物活性?；诖耍P者擬對(duì)藥用植物內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的藥理作用研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)分析，以期為藥用植物保護(hù)、天然藥物資源擴(kuò)展及新藥研發(fā)提供參考。

1 藥用植物內(nèi)生菌的分離及鑒定

寄生于藥用植物的內(nèi)生菌種屬繁多，其次級(jí)代謝產(chǎn)物的種類更是龐雜，因此在進(jìn)行藥用植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的藥理活性研究前，首先要進(jìn)行內(nèi)生菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離、提取和鑒定。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法（如組織塊法、平板劃線法）可分離出內(nèi)生菌株實(shí)體，是分離植物內(nèi)生菌最主要且不可替代的方法。其主要步驟包括采集新鮮植物材料、選取擬研究的部位清洗干凈、用75%乙醇等滅菌后用無(wú)菌水沖洗并晾干、去除植物外部組織、用無(wú)菌刀片將內(nèi)部組織切成薄片后植入培養(yǎng)基中，當(dāng)有菌絲長(zhǎng)出后，挑出菌絲于新的培養(yǎng)基上做進(jìn)一步培養(yǎng)分離純化，直至得到純化的菌株，然后通過(guò)分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定[13]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，寄生于藥用植物的內(nèi)生菌種屬可通過(guò)非培養(yǎng)方法進(jìn)行高通量快速鑒定，如采用分子雜交、DNA指紋技術(shù)、rDNA序列分析、宏基因組方法等，但這些方法無(wú)法得到內(nèi)生菌株實(shí)體，從而限制了對(duì)其代謝產(chǎn)物的進(jìn)一步研究[14]。

2 藥用植物內(nèi)生菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物概況

內(nèi)生菌從寄主植物中吸取營(yíng)養(yǎng)，通過(guò)新陳代謝產(chǎn)生的物質(zhì)稱為次級(jí)代謝產(chǎn)物[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，藥用植物內(nèi)生菌不僅可以產(chǎn)生與宿主植物活性成分相同或相似的次級(jí)代謝產(chǎn)物，而且還能合成具有生物活性的新代謝產(chǎn)物。例如Yin等[15]從川芎中分離出5株可產(chǎn)生川芎嗪的枯草芽孢桿菌，其中1株在發(fā)酵144 h后的產(chǎn)量高達(dá)10.69 g/L。Qi等[16]從雷公藤內(nèi)生曲霉屬真菌，分離發(fā)現(xiàn)了4種新的丁烯酸內(nèi)酯（Terrusnolides A-D），可顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、 腫瘤壞死因子α（TNF-α）和一氧化氮（NO），且其抑制活性與臨床抗炎藥物吲哚美辛的活性無(wú)顯著差異。Kim等[17]從魁蒿的內(nèi)生真菌Phoma sp.PF2分離出了2個(gè)新的異色酮和6個(gè)已知化合物，這8個(gè)物質(zhì)均可中等強(qiáng)度地抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO的釋放，且其中4個(gè)化合物無(wú)明顯的細(xì)胞毒性。另外，內(nèi)生放線菌也可產(chǎn)生生物堿、多肽、聚酮類、萜類等多種生物活性物質(zhì)[18]。

3 藥用植物內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的藥理活性

3.1 抗菌

青霉菌是抗生素（青霉素）最著名的真菌屬，研究者們?cè)诙喾N藥用植物中分離出了內(nèi)生青霉菌，這些內(nèi)生菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有良好的抗菌活性[19]。除青霉菌屬外，其他很多內(nèi)生菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物也具有抗菌活性。Shah等[20]從光果甘草中分離的內(nèi)生菌Fusarium? ?solani可產(chǎn)生具有抗菌作用的化合物。Arora等[21]從甘草真菌培養(yǎng)物GG1F1中萃取的提取物具有顯著的抗菌活性，經(jīng)鑒定為硫代二酮哌嗪衍生物;其中的2種化合物均能抑制多種細(xì)菌的生長(zhǎng)，特別是金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌的生長(zhǎng)，其半數(shù)抑制濃度（IC50）值小于10? ? ?μmol/L;體外殺菌動(dòng)力學(xué)研究表明，這些化合物具有良好的殺菌活性，其在體外可抑制細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯，也可抑制金黃色葡萄球菌中葡萄球菌黃素的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，甘肅野生與栽培品甘草內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和大腸埃希菌均具有抑制活性，且JTZB005菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)肺炎鏈球菌的抑菌活性強(qiáng)于栽培甘草水煎液和總皂苷，而JTZB018菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)大腸埃希菌的抑菌活性強(qiáng)于栽培甘草水煎液和總黃酮[22-23]。Pansanit等[24]發(fā)現(xiàn)，卡薩蒙納姜內(nèi)生真菌Arthrinium sp. MFLUCC16-1053的次級(jí)代謝產(chǎn)物的乙酸乙酯提取物具有抗革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的作用，對(duì)葡萄球菌和大腸埃希菌的最小抑菌濃度（MIC）分別為31.25、7.81 ?g/mL;氣相色譜分析發(fā)現(xiàn)，其乙酸乙酯粗提物中含有β-環(huán)檸檬醛、3E-西柏烯、Laurenan-2-one、香紫蘇醇、2，6-金合歡醇、β-isocomene和γ-姜黃烯等化合物。從藥用植物Euphorbia geniculate中分離的內(nèi)生真菌可產(chǎn)生生物堿和萜類，具有抗真菌活性[6]。黃花蒿極少被植物致病性真菌所侵染，提示其可能具有抗真菌的活性，Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，從黃花蒿種分離出的39株內(nèi)生菌的發(fā)酵液具有良好的抗植物真菌作用，但其是否可抗人致病真菌，還有待進(jìn)一步研究。由此可見(jiàn)，內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物有助于宿主抵抗病原菌，亦可抗人致病真菌，是抗生素的資源庫(kù)[26]。

3.2 抗炎

雷公藤是治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的常用中藥，Qi等[16]從其內(nèi)生曲霉屬真菌次級(jí)代謝物中分離發(fā)現(xiàn)了具有抗炎活性的物質(zhì)，且與臨床抗炎藥物吲哚美辛的活性比較無(wú)顯著差異。Maharjan等[27]從黃芩根中分離出內(nèi)生真菌鐮孢菌Fusarium sp. QF001，并在其次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了對(duì)光敏感的同分異構(gòu)體，這些化合物可抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NO的產(chǎn)生、抑制促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，提示其可能是潛在的抗炎藥物。楊志軍等[28]分離的甘草內(nèi)生細(xì)菌JTYB006和JTYB029屬于芽孢桿菌Bacillus.屬、內(nèi)生真菌JTYF023屬于曲霉屬，其發(fā)酵液提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹、冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高均具有緩解作用;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，甘草內(nèi)生菌JTZB005、JTZB006和JTZB063的次級(jí)代謝產(chǎn)物可使痰濁阻肺模型大鼠肺組織中NO、TNF-α、細(xì)胞間黏附分子1的含量及環(huán)氧化酶2的活性均顯著降低，并顯著升高水通道蛋白AQP1、AQP5的表達(dá)水平，提示甘草內(nèi)生菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有良好的抗炎祛痰作用[29-30]。

3.3 抗腫瘤

1993年，Stierle等[12]從短葉紫杉中分離到1株內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae，其可產(chǎn)生與宿主植物一樣的腫瘤治療劑紫杉醇及相關(guān)物質(zhì)，并在微生物中找到了紫杉醇的合成路徑。美登素（Maytansine）是一種強(qiáng)烈的微管蛋白抑制劑，其抗腫瘤活性為阿霉素的150～300倍，是比較理想的靶向化療藥物，該物質(zhì)最初被認(rèn)為是植物中的化合物，但其基本結(jié)構(gòu)與一系列被稱為安薩米托素的細(xì)菌產(chǎn)品類似[31]。Kusari等[32]研究指出，寄生于美登木根部皮質(zhì)區(qū)的內(nèi)生菌是產(chǎn)生美登素的主要來(lái)源，其可將安薩米托素P3轉(zhuǎn)化為美登素，被植物攝取以抵御病原體侵入。Eyberger等[33]從足葉草的根莖中分離出2株真菌，在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后發(fā)現(xiàn)，其可產(chǎn)生0.5～189 mg/L的鬼臼毒素（Podophyllotoxin），這是一種具有顯著的抗腫瘤作用和抗病毒作用的芳基四氫萘木脂素。Martinez-klimova等[26]從某種植物內(nèi)生青霉屬菌Penicillium sp. sh18.中發(fā)現(xiàn)了1種雜萜化合物，其可通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路、Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的耐藥，是介導(dǎo)組織癌變的關(guān)鍵通路，提示該雜萜化合物可能具有潛在抗腫瘤活性。腺苷脫氨酶（ADA）是治療淋巴組織增生紊亂和癌癥（如肺癌、結(jié)腸癌等）的潛在靶點(diǎn)，Zhang等[34]從20種藥用植物的種子中分離出128種內(nèi)生菌，并通過(guò)光譜測(cè)定法檢測(cè)其次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)ADA的抑制作用，其中旋孢腔菌Cochliobolus sp.的次級(jí)代謝產(chǎn)物5-hydroxy-2-hydroxymethyl-4H-pyran-4-one顯示出最強(qiáng)的抑制作用;分子對(duì)接結(jié)果表明，該化合物與ADA的活性口袋能非特異性結(jié)合，是ADA的抑制劑，具有潛在的抗腫瘤活性。麥克歐文文殊蘭的內(nèi)生不動(dòng)桿菌Guillouiae的粗提物在12.5、6.25、3.13 ?g/mL的濃度下均可抑制50%惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG的生長(zhǎng)[35]。Yang等[36]從鉤藤的內(nèi)生真菌Colletotrichum gloeosporioides的次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離出9種化合物，其中Cyclo（L-leucyl-L-leucyl）和Breviana-mide F可顯著抑制磷脂酰肌醇3-激酶α（PI3Kα）的活性，其IC50值分別為38.1、4.8 μmol/L。PI3Ks是脂激酶家族成員，在細(xì)胞的增殖、存活和遷移中扮演了重要角色，其中PI3Kα是抗腫瘤藥物的重要靶點(diǎn)[37]。申麗等[38]從山麻黃內(nèi)生真菌Myrothecium roridum LLY固體發(fā)酵中分離得到9種化合物，其中化合物3能誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡（化合物3的IC50為38.0 μg/mL，順鉑的IC50為11.5 μg/mL），且其對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用與S期細(xì)胞周期阻滯相關(guān)。

3.4 抗高血糖

α-葡糖苷酶是一種水解葡萄糖的酶，其抑制劑在糖尿病的治療中被廣泛應(yīng)用，且α-葡糖苷酶抑制劑具有抗病毒和抗菌活性[39]。Kaur等[39]從牛角瓜內(nèi)生真菌Allternaria destruens中分離出既可抗菌、又可抑制α-葡糖苷酶的次級(jí)代謝產(chǎn)物;該研究還指出，糖尿病患者紊亂的高血糖性免疫系統(tǒng)極易受到感染，故而具有抗菌活性的降血糖藥可能會(huì)是更好的治療藥物 。波葉青牛膽及其內(nèi)生放線菌BWA65均可產(chǎn)生α-葡糖苷酶抑制劑，且BWA65所產(chǎn)生的α-葡糖苷酶抑制劑的活性是其宿主植物的2倍，而無(wú)內(nèi)生菌的組織培養(yǎng)植株幾乎不產(chǎn)生可抑制α-葡糖苷酶的化合物，故提示波葉青牛膽中放線菌是產(chǎn)生α-葡糖苷酶抑制劑的主要來(lái)源[40]。Akshatha等[41]從抗糖尿病藥用植物繡球防風(fēng)和蘿芙木的內(nèi)生放線菌S. longisporoflavus和Streptomyces sp.次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離出了α-淀粉酶抑制劑。

3.5 抗寄生蟲(chóng)

內(nèi)生菌作為天然產(chǎn)物藥物開(kāi)發(fā)的重要組成部分，研究者對(duì)2 700多種內(nèi)生真菌提取物進(jìn)行了抗利什曼原蟲(chóng)活性篩選，結(jié)果表明，高達(dá)17%的菌株具有抗寄生蟲(chóng)活性，其中活性最強(qiáng)的菌株屬于蜜環(huán)菌科、毛球菌科和羊駝科[42]。從巴西植物中分離的內(nèi)生真菌可抵抗亞馬遜利什曼蟲(chóng)，其中11種真菌提取物能抵抗亞馬遜利什曼蟲(chóng)，其IC50為4.6～24.4 μg/mL[43]。金雞納樹(shù)含有的喹啉類衍生物，能與瘧原蟲(chóng)的DNA結(jié)合，抑制DNA的復(fù)制和RNA的轉(zhuǎn)錄，從而抑制瘧原蟲(chóng)的蛋白合成，可用來(lái)治療瘧疾[44]。Maehara等[45]研究指出，在日本和印度栽培的金雞納樹(shù)中的內(nèi)生菌在屬水平上有顯著差異，而日本金雞納幼莖中分離出的3株內(nèi)生絲狀真菌可產(chǎn)生金雞納生物堿，但其產(chǎn)量較印度金雞納內(nèi)生菌少很多，且日本金雞納植物中產(chǎn)生的生物堿的含量，特別是奎寧的含量也顯著低于印度金雞納?？梢?jiàn)，內(nèi)生菌可產(chǎn)生與藥用植物相似的成分，且與藥用植物活性成分的含量密切相關(guān)。

3.6 其他活性

內(nèi)生真菌是多種生物活性天然產(chǎn)物的潛在來(lái)源，如Phongpaichit等[46]報(bào)道了從藤黃屬植物中分離的內(nèi)生真菌提取物具有抗分枝桿菌、抗病毒、抗氧化、抗增殖、抗細(xì)胞毒性等作用。Yuan等[47]從銀杏的根、莖、葉和皮中分離出多種內(nèi)生菌，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生多種植物化學(xué)成分，如黃酮類、萜類和其他新化合物（包括生物堿、小分子有機(jī)酸等），這些化合物具有抗病毒、抗心血管疾病、抗微生物等作用。抗氧化劑對(duì)于防治癌癥、心臟病、腦卒中、阿爾茨海默病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等具有重要的意義，而多種植物內(nèi)生菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有抗氧化活性[48]。研究者在多種藥用植物中分離出了內(nèi)生青霉菌，發(fā)現(xiàn)了280多種活性次級(jí)代謝產(chǎn)物;除抗菌活性外，還發(fā)現(xiàn)這些次級(jí)代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗寄生蟲(chóng)、免疫抑制劑、降糖、減肥、抗纖維化及神經(jīng)保護(hù)等作用[19]。Shah等[20]從光果甘草中分離的內(nèi)生菌Fusarium solani可產(chǎn)生抗結(jié)核作用的化合物。

4 結(jié)語(yǔ)

藥用植物中寄生的內(nèi)生菌具有多樣性特征，每個(gè)內(nèi)生菌又有豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，且相關(guān)學(xué)者已從內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了許多與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)，主要具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗高血糖、抗寄生蟲(chóng)等藥理活性，其活性甚至要強(qiáng)于宿主植物的活性物質(zhì)[16-18]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，最初被認(rèn)為是由宿主植物產(chǎn)生的“植物化學(xué)物質(zhì)”可能是由內(nèi)生菌產(chǎn)生，或與內(nèi)生菌密切相關(guān)[49]。Ancheeva等[4]指出，內(nèi)生菌相當(dāng)于一個(gè)取之不盡、用之不竭的天然化合物生產(chǎn)庫(kù)。因此，從藥用植物內(nèi)生菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中篩選新的活性成分和先導(dǎo)化合物是一個(gè)發(fā)現(xiàn)新型化合物和有價(jià)值天然藥物的重要途徑，其中抗生素和抗腫瘤活性物質(zhì)是一類最受關(guān)注的活性物質(zhì)[50]。

目前，植物內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究方法一般是基于菌種培養(yǎng)及天然產(chǎn)物分離純化的策略，然而內(nèi)生菌脫離宿主以后生長(zhǎng)很慢，再發(fā)酵時(shí)合成代謝物的能力很弱，且在傳數(shù)代后會(huì)發(fā)生變異，導(dǎo)致次級(jí)代謝產(chǎn)物的變化，給研究帶來(lái)很大的困難[31]。而且，植物中同時(shí)存在大量?jī)?nèi)生菌，內(nèi)生菌之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，體外很難模擬[7]，加之內(nèi)生菌與宿主的關(guān)系及其可能對(duì)內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生潛能有影響，內(nèi)生菌中存在與宿主無(wú)關(guān)的生物合成機(jī)制的證據(jù)也仍然不充分[51]。

綜上所述，內(nèi)生菌可從寄主植物中吸取營(yíng)養(yǎng)并通過(guò)新陳代謝等生命活動(dòng)產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些次級(jí)代謝物不但具有與宿主植物相同或相似的生物活性，而且其還具有許多新的生物活性，故藥用植物內(nèi)生菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物是龐大的潛在藥用物質(zhì)資源庫(kù)，具有良好的開(kāi)發(fā)前景。然而，目前內(nèi)生菌離開(kāi)宿主植物后的培養(yǎng)問(wèn)題極大地限制了其次級(jí)代謝產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)，還需要進(jìn)一步的研究不斷完善。

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（收稿日期：2020-11-29 修回日期：2021-01-08）