調(diào)控生物鐘的小分子化合物的研究進(jìn)展

凡杰夫 何穎 王偉忠 譚興 張建 王楊凱

摘 要 目的：了解調(diào)控生物鐘的小分子化合物的研究進(jìn)展，為生物節(jié)律干預(yù)策略的研究和相關(guān)藥物的研發(fā)提供參考。方法：對鐘基因的調(diào)控機(jī)制、調(diào)控生物鐘的小分子化合物[如靶向蛋白激酶、靶向核受體、靶向隱花色素蛋白（CRY）、靶向時(shí)鐘蛋白（CLOCK）]的作用機(jī)制及其篩選和鑒定方法進(jìn)行綜述。結(jié)果與結(jié)論：生物體內(nèi)與生物鐘的發(fā)生和維持相關(guān)的基因被稱為節(jié)律基因，包含鐘基因和鐘控基因兩類。鐘基因是維持生物鐘節(jié)律的關(guān)鍵，其表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路的調(diào)控。鐘基因表達(dá)失調(diào)將導(dǎo)致生物鐘節(jié)律的減弱或紊亂，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。生物鐘相關(guān)蛋白調(diào)控小分子化合物可靶向蛋白激酶參與的翻譯后修飾，在生物鐘的調(diào)控中具有重要作用，其突變可能參與了多種由生物鐘紊亂所致的疾病;靶向核受體的小分子化合物可對癌細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性效果，可為多效抗癌藥的研發(fā)提供幫助;靶向CRY的小分子化合物可增強(qiáng)CRY穩(wěn)定性和CRY-周期基因（PER）蛋白復(fù)合體對核轉(zhuǎn)運(yùn)類似蛋白1（BMAL1）-CLOCK的抑制作用，減少關(guān)鍵鐘基因的表達(dá)，從而使患者膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞發(fā)生周期停滯，引起凋亡增加;靶向CLOCK的小分子化合物是調(diào)控鐘基因轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路的重要組成部分，其含量和活性能顯著影響生物鐘的穩(wěn)定性和振幅強(qiáng)度。目前，對大多數(shù)小分子調(diào)節(jié)物質(zhì)的研究仍停留在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段，還存在對鐘蛋白的精確調(diào)控存在困難，對BMAL1和PERs等關(guān)鍵鐘蛋白的調(diào)節(jié)物的研究仍處于盲區(qū)等不足;而對已知調(diào)控生物鐘的小分子化合物，進(jìn)一步的修飾與改造、優(yōu)化其藥動學(xué)特性、減輕其不良反應(yīng)，是該領(lǐng)域重要的研究方向。

關(guān)鍵詞 生物節(jié)律;鐘基因;小分子化合物;表型篩選;靶向篩選;生物鐘調(diào)控

中圖分類號 R966 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）07-0890-07

生物鐘（Circadian clock）是生物適應(yīng)外界環(huán)境規(guī)律性變化的一種內(nèi)在機(jī)制，控制著生命活動的節(jié)律性，而多種鐘基因及其蛋白產(chǎn)物所構(gòu)成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)保證了生物鐘節(jié)律與環(huán)境節(jié)律的一致性[1-2]。生物鐘受到外源性和內(nèi)源性信號的調(diào)節(jié)，從而產(chǎn)生適應(yīng)性變化。其中，光照和溫度是調(diào)控生物鐘的重要外源性信號，生物鐘中樞區(qū)域下丘腦視交叉上核輸出的神經(jīng)和體液信號是調(diào)控生物鐘的內(nèi)源性因素[2]。生物鐘節(jié)律的減弱或紊亂與睡眠障礙、代謝失調(diào)、腫瘤等多種疾病息息相關(guān)[3]。研究表明，多種小分子化合物具有對生物鐘的調(diào)控作用，篩選并鑒定調(diào)控生物鐘的小分子化合物并闡明其藥理作用，對相關(guān)疾病的藥物研發(fā)具有重要的意義，也為新型靶向藥物的研發(fā)提供了可能?；诖?，筆者就調(diào)控生物鐘的小分子化合物的篩選方法和作用機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為生物節(jié)律干預(yù)策略的研究和相關(guān)藥物的研發(fā)提供參考。

1 鐘基因的調(diào)控機(jī)制

生物體內(nèi)與生物鐘的發(fā)生和維持相關(guān)的基因被稱為節(jié)律基因，包含鐘基因（Clock genes）和鐘控基因兩類，前者對維持生物節(jié)律起關(guān)鍵作用。哺乳動物體內(nèi)存在多種鐘基因，包括時(shí)鐘基因（Clock）、腦和肌肉組織芳香羥受體核轉(zhuǎn)運(yùn)類似蛋白1基因（Bmal1）、周期基因1-3（Per1-3）、隱花色素基因（Cry）等[4]。鐘控基因廣泛分布于全身的組織、細(xì)胞，位于鐘基因下游并受其調(diào)控，使得相關(guān)生理活動呈現(xiàn)節(jié)律性;同時(shí)，核受體亞家族1 D組成員1基因（NR1D1，又稱Rev-erbα）、白蛋白D位點(diǎn)結(jié)合蛋白基因（Dbp）和腺病毒E4啟動子結(jié)合蛋白4基因（E4bp4）等鐘控基因?qū)︾娀虻谋磉_(dá)具有反饋調(diào)節(jié)作用[5-7]。多種節(jié)律基因及其蛋白產(chǎn)物構(gòu)成了復(fù)雜的生物鐘調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其轉(zhuǎn)錄、翻譯、磷酸化等分子調(diào)控機(jī)制是維持生物鐘周期性振蕩的關(guān)鍵。小分子對鐘基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制見圖1。

1.1 鐘基因的自主調(diào)控機(jī)制

鐘基因的表達(dá)受到節(jié)律基因轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路的調(diào)控，其中鐘基因及其蛋白產(chǎn)物構(gòu)成核心調(diào)控環(huán)路，鐘控基因參與構(gòu)成兩條調(diào)控鐘基因的輔助環(huán)路[8]。在核心環(huán)路中，Clock和Bmal1基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物CLOCK和BMAL1構(gòu)成異二聚體，激活鐘基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮正向調(diào)控作用;而Per和Cry基因的蛋白產(chǎn)物PER、CRY入核形成穩(wěn)定的復(fù)合物，抑制CLOCK-BMAL1異二聚體的作用，起負(fù)性調(diào)控作用[8]。兩條輔助環(huán)路中的第一條包括2個(gè)核受體家族，即REV-ERBα/β和RORα/β/γ，它們競爭結(jié)合Bmal1順式作用元件RORE，分別對Bmal1轉(zhuǎn)錄起抑制和促進(jìn)作用[5]。在另一條輔助環(huán)路中，CLOCK- BMAL1異二聚體促進(jìn)下游鐘控蛋白DBP和E4BP4生成，DBP參與構(gòu)成的蛋白復(fù)合體可增強(qiáng)CLOCK-BMAL異二聚體對Per的誘導(dǎo)作用;相反，E4BP4則使其誘導(dǎo)作用減弱[9]。研究發(fā)現(xiàn)，DBP濃度在清晨達(dá)到高峰，在夜晚降至低谷，且與PER的濃度變化相符[4]。這3條反饋環(huán)路是調(diào)控鐘基因的主要途徑，使鐘基因的表達(dá)發(fā)生自主振蕩，在生物體內(nèi)穩(wěn)定地運(yùn)行，將生物節(jié)律維持在24 h左右[4]。

1.2 鐘蛋白修飾對鐘基因調(diào)控的影響

鐘蛋白的翻譯后修飾在鐘基因的調(diào)控過程中起重要作用，多種蛋白激酶如CK1、CK2、JNK、MAPK和GSK-3參與了鐘蛋白的磷酸化過程，例如JNK可介導(dǎo)CLOCK和BMAL1的磷酸化、干擾其入核轉(zhuǎn)運(yùn)的過程并抑制CLOCK-BMAL1異二聚體的功能[10];CK1和MAPK則可介導(dǎo)PER和CRY的磷酸化，并增強(qiáng)其對CLOCK- BMAL1異二聚體的抑制作用[11];泛素化影響鐘蛋白的穩(wěn)定性，如F-box蛋白介導(dǎo)PER和CRY單體發(fā)生泛素化，而后被蛋白酶體降解[12]。翻譯后修飾過程可顯著影響生物鐘自主調(diào)控過程中的關(guān)鍵蛋白的活性和功能，對于生理或病理情況下生物鐘的調(diào)節(jié)與重置具有重要意義，異常的翻譯后修飾將導(dǎo)致生物鐘節(jié)律的紊亂，例如在家族性晚期睡眠綜合征中，PER蛋白磷酸化的缺失會導(dǎo)致節(jié)律周期前移4 h[13]。

2 調(diào)控生物鐘的小分子化合物的篩選和鑒定方法

生物化學(xué)和高通量篩選技術(shù)的發(fā)展使得從成千上萬的小分子物質(zhì)中篩選出影響生物鐘節(jié)律的小分子化合物成為可能。目前，表型篩選法和靶向篩選法是篩選與鑒定調(diào)控生物鐘的小分子化合物的主要方法。

2.1 基于細(xì)胞表型的高通量篩選法

基于細(xì)胞表型的高通量篩選方法以無偏差方式篩選影響生物鐘節(jié)律的小分子化合物，該方法依賴高通量篩選技術(shù)和信息技術(shù)從眾多特征良好的化合物中挑選出能顯著改變細(xì)胞節(jié)律表型的小分子化合物[14]。

該方法對小分子化合物的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制沒有限制，能更全面地篩選出影響生物鐘的小分子化合物;并且在確定候選化合物的作用靶點(diǎn)時(shí)，有可能發(fā)現(xiàn)新的節(jié)律相關(guān)蛋白和作用機(jī)制。表型篩選法還能直接篩選出強(qiáng)烈影響生物鐘動態(tài)的小分子化合物，并能對化合物的功能表現(xiàn)進(jìn)行明確的鑒定與選擇。但廣泛而全面的篩選也造成了該方法的局限性，由于篩選容量龐大，對實(shí)驗(yàn)處理的精確性、一致性要求高，因此較難獲得高質(zhì)量和高準(zhǔn)確度的數(shù)據(jù)。

2.2 靶向篩選法

X射線晶體學(xué)的發(fā)展對蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析起到了巨大的推動作用，而對鐘蛋白結(jié)構(gòu)的認(rèn)識又使得篩選靶向特定蛋白的小分子化合物成為可能[15]。

該方法可有針對性地尋找作用于目的蛋白的小分子化合物，避免了無偏差篩選的盲目性和偶然性，保證了篩選出的活性小分子能直接作用于調(diào)節(jié)生物鐘的核心蛋白，而不是通過其他途徑間接影響生物鐘的節(jié)律。這些優(yōu)點(diǎn)使靶向篩選法對于篩選鑒定調(diào)節(jié)生物鐘的小分子化合物具有十分重要的意義。目前，還沒有發(fā)現(xiàn)作用于PERs、BMAL1等鐘蛋白的小分子化合物，且已知的生物鐘調(diào)節(jié)物也大多缺乏對蛋白亞型的選擇性，因此更具針對性的靶向篩選法將在進(jìn)一步的研究中起到重要作用。靶向篩選法的局限性主要表現(xiàn)在其研究范圍僅限于直接作用于已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的小分子化合物，而無法篩選其他作用方式的化合物，例如影響鐘蛋白的亞細(xì)胞定位的小分子物質(zhì)[4]。

3 生物鐘相關(guān)蛋白調(diào)控小分子化合物對鐘基因的調(diào)控及應(yīng)用

生物鐘與睡眠、代謝、情緒反應(yīng)等多種生理活動息息相關(guān)，研究人員也一直致力于探索生物鐘調(diào)控藥物對這些生理功能障礙引起的疾病的作用。數(shù)量眾多的符合Lipinski規(guī)則的小分子化合物是具有潛力的生物鐘調(diào)控藥物，這些小分子化合物可結(jié)合生物鐘相關(guān)蛋白并改變其生物活性，從而影響鐘基因的表達(dá)以起到調(diào)控生物鐘的作用[3，16]。最初，研究人員使用基于表型的高通量篩選法鑒定出多種影響鐘蛋白翻譯后修飾過程的小分子化合物，發(fā)現(xiàn)蛋白激酶（如CK1、CK2、GSK-3）為其主要的作用靶點(diǎn);最近，研究人員嘗試使用小分子化合物直接靶向調(diào)控鐘基因的核心蛋白，包括CRY、核受體（REV-ERB、ROR）和CLOCK。下文將分別描述靶向多種生物鐘相關(guān)蛋白的小分子化合物對鐘基因和生物鐘的影響，及其在相關(guān)疾病中的應(yīng)用。

3.1 靶向蛋白激酶

蛋白激酶參與的翻譯后修飾在生物鐘的調(diào)控中具有重要作用，蛋白激酶的突變可能參與了多種由于生物鐘紊亂所致的疾病的發(fā)生、發(fā)展，因此蛋白激酶是小分子藥物研發(fā)中備受關(guān)注的調(diào)控靶點(diǎn)。靶向蛋白激酶的生物鐘調(diào)控小分子化合物見表1。

蛋白激酶CK1在鐘基因的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，PER蛋白是其主要作用靶點(diǎn)[11]。小分子化合物L(fēng)ongdaysin是最先被鑒定出的CK1抑制劑，具有延長周期的作用[16]。虛擬分子對接研究顯示，Longdaysin的嘌呤環(huán)和亞胺基與CK1亮氨酸殘基間形成氫鍵，介導(dǎo)兩者結(jié)合;抑制CK1活性將導(dǎo)致PER磷酸化減弱，并使PER-CRY復(fù)合物對CLOCK-BMAL1異二聚體的抑制作用減弱，從而增強(qiáng)鐘基因的表達(dá)[17]。在人類的家族性晚期睡眠綜合征中發(fā)現(xiàn)Per或CK1δ基因的單點(diǎn)突變，使PER蛋白的磷酸化受到影響，導(dǎo)致睡眠等行為提前4 h出現(xiàn);使用CK1抑制劑Longdaysin后，節(jié)律周期得以延長，顯示出Longdaysin對于該綜合征有良好的治療潛力[12]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Longdaysin衍生物NCC007與CK1結(jié)合更穩(wěn)定，并顯示出更強(qiáng)的抑制作用[17]。另外，IC261、SP600125等小分子化合物也具有對CK1的抑制作用，并通過相似過程延長節(jié)律周期[18]。值得關(guān)注的是，CK1有7種亞型，其中CK1α/δ/?被證實(shí)參與鐘基因的調(diào)節(jié)，這3種不同亞型的CK1具有相似的功能，而研究顯示CK1δ的作用最重要[11]。針對不同亞型的CK1的小分子物質(zhì)也會產(chǎn)生不同的結(jié)果，如特異的CK1?抑制劑PF-4800567只輕度延長周期，而CK1δ的特異性抑制劑PF-670462則具有顯著延長節(jié)律周期的作用[19]。這些更具針對性的小分子抑制劑是研究各CK1亞型具體功能的基礎(chǔ)，也將為藥物的開發(fā)提供更多的可能。

CK2也是一種重要的蛋白激酶，其抑制劑DMAT、CX-4945等表現(xiàn)出周期延長的效果，但這些抑制劑的特異性不強(qiáng)，會同時(shí)對多種激酶產(chǎn)生抑制作用[20-21]。GO289是最新被鑒定的CK2抑制劑，其對CK2的選擇性很強(qiáng)且能高效地抑制CK2活性[半數(shù)抑制濃度（IC50）=7 nmol/L]，能顯著延長細(xì)胞周期;其能通過溴代愈創(chuàng)木酚基團(tuán)與CK2中Glu114、Val116和Lys68這3個(gè)在其他激酶中不保守的氨基酸殘基形成氫鍵，這是其具有強(qiáng)烈選擇性的分子基礎(chǔ)[22]。該研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CK2的可能磷酸化位點(diǎn)很多，涉及BMAL1、CLOCK、PER2、CRY1等多種鐘蛋白，其具體作用仍有待進(jìn)一步研究。CK2功能失調(diào)常見于癌癥，抑制劑GO289對人腎癌細(xì)胞系和小鼠MLL-AF9急性髓系白血病細(xì)胞的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用[20，22]。因此，選擇性的CK2抑制劑為治療生物鐘相關(guān)的癌癥提供了一種可能的候選化合物。

GSK-3（α/β）可介導(dǎo)100多種底物的磷酸化，涉及多條細(xì)胞通路并與大量疾病相關(guān)，其作用包括加強(qiáng)EEV-ERBα穩(wěn)定性以抑制Bmal1基因轉(zhuǎn)錄、直接降低BMAL1蛋白穩(wěn)定性等[23]。Lithium、CHIR99021和Lazakenpaullone是目前已知的GSK-3抑制劑，但其生物學(xué)效應(yīng)則完全相反，其中Lithium可延長節(jié)律周期，而CHIR99021、Lazakenpaullone則可縮短節(jié)律周期[3，24]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Lithium可廣泛抑制多種激酶的活性，但對GSK-3的特異性不強(qiáng);而CHIR99021、Lazakenpaullone對GSK-3具有較強(qiáng)的選擇性[25]。研究還發(fā)現(xiàn)，Lithium等非特異性抑制劑對于雙相情感障礙、抑郁癥等心理疾病具有良好的療效，而CHIR99021等GSK-3特異性抑制劑則可以解除GSK-3抑制糖原合成的作用，從而對2型糖尿病產(chǎn)生治療效果[23]。

3.2 靶向核受體

REV-ERB和ROR兩個(gè)核受體家族參與構(gòu)成的輔助環(huán)路在鐘基因的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，也是生物鐘調(diào)控藥物的主要靶點(diǎn)[2]。目前，已發(fā)現(xiàn)多種靶向核受體的小分子化合物，其功能多樣，在代謝障礙、精神和睡眠疾病等多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮作用。但其大多缺乏對受體亞型的特異性作用，因而療效有限、不良反應(yīng)多[3]。同時(shí)，對于REV-ERB、ROR的受體-配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)的研究，目前只報(bào)道了REV-ERB、ROR分別與其天然配體血紅素、膽固醇結(jié)合形成的復(fù)合體結(jié)構(gòu)[26-27]。闡明其與人工合成或天然提取的小分子化合物構(gòu)成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)將有助于開發(fā)更有效的小分子調(diào)節(jié)物。靶向核受體的生物鐘調(diào)控小分子化合物見表2。

3.2.1 靶向REV-ERB REV-ERB是一種核激素受體，以血紅素為天然配體，抑制Bmal1基因轉(zhuǎn)錄[3]。首先發(fā)現(xiàn)的REV-ERB小分子化合物激動劑是GSK4112[28]。對HepG2肝細(xì)胞系的研究表明，GSK4112可增強(qiáng)REV- ERB對Bmal1轉(zhuǎn)錄的抑制作用，減弱糖異生相關(guān)基因的表達(dá)，減少小鼠原代肝細(xì)胞合成葡萄糖[28]。

GSK4112衍生物SR9009和SR9011作為REV-ERB激動劑，可影響下丘腦視交叉上核鐘基因的表達(dá)，增強(qiáng)Pers基因的表達(dá)振幅，減弱Crys基因的表達(dá)振幅并使Bmal1基因的表達(dá)周期前移，引起肝臟、骨骼肌和脂肪組織中一系列代謝相關(guān)基因的節(jié)律表達(dá)模式發(fā)生改變，增加能量消耗，顯著減輕肥胖模型小鼠的體質(zhì)量[29-30]。代謝物檢測發(fā)現(xiàn)，SR9009和SR9011還具有減少焦慮、誘發(fā)覺醒的作用，具有治療相關(guān)疾病的潛力[31]。后續(xù)研究表明，多種GSK4112衍生物具有更好藥動學(xué)特性，例如GSK2945顯示出較長的半衰期和良好的口服利用度;而Compound 10、16、23的半衰期較短，適用于短期急性注射治療[32]。

SR8278是REV-ERB拮抗劑，通過抑制REV-ERB作用使其靶基因Bmal1、G6Pase和Pepck的表達(dá)增加;細(xì)胞試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，SR8278能有效抑制葡糖糖誘導(dǎo)的胰島素釋放，提示REV-ERB拮抗劑可在血糖調(diào)節(jié)方面發(fā)揮作用[33]。另一種小分子化合物ARN5187具有拮抗REV- ERB和抑制細(xì)胞自噬的雙重作用，對癌細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性效果，可為多效抗癌藥的研發(fā)提供幫助[34]。

3.2.2 靶向ROR ROR也是一種核受體，與REV-ERB有著相似的DNA結(jié)合區(qū)域（DBDs）和各異的配體結(jié)合域（LBDs），并能與膽固醇結(jié)合。ROR晶體結(jié)構(gòu)中還存在一個(gè)可與共激活因子結(jié)合的helix12結(jié)構(gòu)[35]。T0901317、SR1001及其多種衍生物被鑒定為ROR的可逆激動劑，對免疫、代謝等方面疾病模型的小鼠具有治療效果[4]，但尚未有研究報(bào)道這些ROR可逆激動劑對生物鐘功能的影響。

多種天然小分子化合物具有調(diào)節(jié)ROR的作用，其中新紅豆素（Neoruscogenin）被鑒定為ROR激動劑，其與ROR結(jié)合可增強(qiáng)Bmal1和代謝基因的表達(dá)，對動脈粥樣硬化的治療及脂糖代謝的改善具有潛在意義[36]。另一種天然化合物諾比利?。∟obiletin）在表型篩選實(shí)驗(yàn)中被確定為ROR激動劑，具有增強(qiáng)節(jié)律振幅的作用，可使糖尿病或肥胖模型小鼠的鐘基因（Bmal1、Npas2）和鐘控基因（Ucp1、Atp5d）表達(dá)顯著上調(diào)，起到維持小鼠血糖血脂穩(wěn)態(tài)、保護(hù)代謝功能等作用[37]。諾比利丁、新紅豆素及其代謝物質(zhì)天然存在，無毒性，且具有良好的改善代謝的能力，是具有潛力的候選藥物[38-39]。

3.3 靶向CRY的小分子化合物

鐘蛋白CRY是調(diào)控鐘基因的核心環(huán)路負(fù)反饋途徑中重要的組成部分，靶向CRY的生物鐘調(diào)控小分子化合物見表3。

最先被發(fā)現(xiàn)的CRY調(diào)節(jié)物是KL001，它是一種含有甲磺酰胺和呋喃結(jié)構(gòu)的咔唑類化合物[40]。KL001的甲磺酰胺結(jié)構(gòu)可與泛素化相關(guān)物質(zhì)F-box/LRR重復(fù)蛋白3（FBXL3）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）競爭CRY中FAD口袋處的結(jié)合位點(diǎn)，抑制CRY泛素化降解[41]。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞（GSCs）中，KL001增強(qiáng)了CRY穩(wěn)定性和CRY-PER蛋白復(fù)合體對CLOCK-BMAL1異二聚體的抑制作用，從而減少了關(guān)鍵鐘基因的表達(dá)，使患者GSCs發(fā)生了周期停滯，引起其凋亡增加[42]。口服KL001衍生物（Compound50、KL004）可延長GSCs移植小鼠的生存時(shí)間，提示KL001衍生物可能對腫瘤有抑制作用，同時(shí)也表明CRY蛋白對節(jié)律相關(guān)疾病的重要作用，為相關(guān)疾病的藥物開發(fā)提供了重要的靶點(diǎn)[42-43]。構(gòu)效關(guān)系研究表明，KL001的咔唑基是其保持活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，此外含有甲烷磺酰胺和呋喃結(jié)構(gòu)的KL001也比含有乙酰胺和氯氰基苯基的KL044效果強(qiáng)10倍[44]。

通過表型篩選法確定了另一種CRY抑制劑——KS15。結(jié)合生物素的KS15能阻斷CRY對CLOCK- BMAL1異二聚體的抑制作用，在激活部分鐘控基因表達(dá)的同時(shí)可減弱細(xì)胞節(jié)律的振幅[45]。 Chun 等[46]對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，KS15可上調(diào)凋亡基因和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子（如p53和Bax）的表達(dá)量，并表現(xiàn)出對腫瘤細(xì)胞的抗增殖和促凋亡特性，但并不降低非癌細(xì)胞MCF-10A的活性。對KS15的構(gòu)效關(guān)系分析確定了其抑制CRY的關(guān)鍵位點(diǎn)，但其與CRY相互作用的分子機(jī)制仍不清楚[45]。

3.4 靶向CLOCK

CLOCK是調(diào)控鐘基因的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路中重要的組成部分，其含量和活性顯著影響生物鐘的穩(wěn)定性和振幅強(qiáng)度[3]。靶向CLOCK的生物鐘調(diào)控小分子化合物詳見表4。

對CLOCK-BMAL1異二聚體的晶體結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，這兩種關(guān)鍵鐘蛋白通過相似的結(jié)構(gòu)域（bHLH、PAS-A、PAS-B）結(jié)合，形成3個(gè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)接口以完成穩(wěn)定的相互作用，這也為各種小分子化合物的結(jié)合提供了可能。目前，CLK8是唯一鑒定出的靶向CLOCK的小分子化合物。分子對接研究發(fā)現(xiàn)，CLK8可與CLOCK蛋白的bHLH和PAS-A結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而減弱CLOCK和BMAL1的相互作用，并影響CLOCK蛋白的亞細(xì)胞定位，使其在細(xì)胞核內(nèi)的含量降低;同時(shí)CLK8可減弱轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路中正反饋環(huán)路的作用，卻不影響負(fù)反饋環(huán)路中CRY和PER的含量，導(dǎo)致生物節(jié)律振幅增強(qiáng)，但其具體機(jī)制仍不清楚[47]。CLK8作為一種新型生物鐘調(diào)節(jié)物，對于治療由病理情況或衰老引起的振幅衰減具有潛在意義，并且已證明核心鐘蛋白CLOCK是具有潛力的調(diào)控靶點(diǎn)，這也為鐘基因相關(guān)疾病的治療提供了更多的可能性。

4 結(jié)語

生物鐘失調(diào)參與了睡眠障礙、代謝紊亂、癌癥等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，而小分子化合物能通過調(diào)控鐘基因的表達(dá)影響生物鐘，從而改善病變機(jī)體的生理功能，具有治療生物鐘失調(diào)相關(guān)疾病的潛力[2-3]。蛋白激酶、核受體（REV-ERB、ROR）、CRY、CLOCK等在維持和調(diào)控生物節(jié)律中有著重要的作用，可作為小分子化合物的作用靶點(diǎn)。目前，鑒定出的小分子調(diào)節(jié)物大多缺乏針對不同亞型鐘蛋白的選擇性，這使得對鐘蛋白的精確調(diào)控存在困難。另外，對BMAL1和PERs等關(guān)鍵鐘蛋白的調(diào)節(jié)物的研究仍處于盲區(qū)，還有待于對蛋白晶體結(jié)構(gòu)的深入探索和進(jìn)一步的靶向篩選鑒定。而對已知調(diào)控生物鐘的小分子化合物，進(jìn)一步的修飾與改造、優(yōu)化其藥動學(xué)特性、減輕其不良反應(yīng)，是該領(lǐng)域重要的研究方向。目前，對大多數(shù)小分子調(diào)節(jié)物質(zhì)的研究仍停留在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段，對于已在動物模型上顯示出良好治療效果和藥學(xué)特性的生物鐘調(diào)節(jié)化合物也需進(jìn)入其下一階段的臨床試驗(yàn)。

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（收稿日期：2020-06-05 修回日期：2021-01-02）

（編輯：羅 瑞）