清肺化痰顆粒對慢性阻塞性肺疾病急性加重期大鼠相關(guān)炎癥因子及氧化應激反應的影響研究

王 妍,朱虹江,和春芳,徐 瑩,明 溪,李 曉

(云南省中醫(yī)醫(yī)院， 云南 昆明 650021)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系統(tǒng)的常見疾病之一，其特點為不完全可逆和進行性的氣流受限，臨床主要表現(xiàn)為咳嗽、咳痰和喘息。目前每年因COPD死亡的人數(shù)約600萬人，占總死亡人數(shù)的6%[1]。慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者病情重，65歲以上AECOPD患者的病死率高達30%[2]。目前西醫(yī)治療方案只能部分緩解患者的癥狀，不能改變COPD的自然病程，因此如何有效治療該病一直是臨床研究的熱點問題。清肺化痰顆粒是由第二批全國名師帶徒專家、云南省名中醫(yī)陳喬林教授之經(jīng)驗方“清肺化痰湯”依據(jù)中醫(yī)藥理論而制成的合劑。郭昉等[3]研究表明，清肺化痰湯可能通過調(diào)節(jié)固有免疫中TLR4-MyD88/TRIF-NF-κB信號傳導通路及Th17介導的獲得性免疫而干預AECOPD患者炎癥反應，從而更好地改善患者臨床癥狀。動物實驗研究表明，清肺化痰湯能調(diào)節(jié)COPD大鼠氧化/抗氧化失衡,增強抗氧化能力,從而抑制氣道炎癥反應,保護肺組織[4]。本課題組通過建立大鼠AECOPD模型，觀察了清肺化痰顆粒對AECOPD的干預作用及可能作用機制，旨在為清肺化痰顆粒的臨床應用提供更多科學依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 成年SPF級健康雄性Wistar大鼠60只，體重180～220 g，購自昆明醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(滇)2011-0004。所有動物均適應性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)室溫度20～24 ℃，濕度43%～48%。

1.2藥物及試劑 清肺化痰顆粒(院內(nèi)制劑，由槲寄生30 g、金蕎麥30 g、魚腥草30 g組成)，琥乙紅霉素片(賽諾菲杭州制藥有限公司，國藥準字H33022279，0.125 g/片)，內(nèi)毒素(美國Sigma-Aldrich公司)，金黃色葡萄球菌(昆明醫(yī)科大學醫(yī)學病原學與免疫實驗室)，戊巴比妥鈉(北京普博斯生物科技有限公司)，紫云煙(云南紅云集團，焦油量14 mg、煙氣煙堿量1.2 mg、煙氣化碳量15 mg)，白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)試劑盒(深圳晶美生物技術(shù)有限公司)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、組織金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3儀器 臺式高速離心機(深圳市賽泰克生物科技有限公司)，-80 ℃超低溫冰箱(德國Eppendorf 公司)，石蠟切片機(德國SLEE公司)，倒置光學顯微鏡(日本Nikon公司)，Multiskan Mk3型酶標儀(美國Thermo公司)。自制動物熏吸箱(規(guī)格：60 cm×50 cm×40 cm)。

1.4實驗方法 將60只大鼠隨機分為正常組、模型組、琥乙紅霉素組及清肺化痰顆粒高、中、低劑量組，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠參照文獻[5]方法，采用被動吸煙加氣管內(nèi)注入內(nèi)毒素的方法復制COPD大鼠模型。在實驗的第7，14，28天，腹腔注射l%的戊巴比妥鈉溶液40 mg/kg麻醉大鼠，之后取仰臥位固定并暴露聲門，用1 mL注射器向氣管內(nèi)注入1 mg/mL的內(nèi)毒素0.2 mL，然后將大鼠置入自制的熏吸箱內(nèi)(注入濃度為5%的香煙煙霧)30 min。在實驗的第29天經(jīng)鼻腔滴入金黃色葡萄球菌0.3 mL，2次/d，連續(xù)3 d，制備AECOPD大鼠模型。造模成功后，琥乙紅霉素組給予3.15 g/kg琥乙紅霉素溶液灌胃，清肺化痰顆粒高、中、低劑量組給予清肺化痰顆粒溶液9.94 g/kg、4.97 g/kg、2.49 g/kg灌胃，正常組、模型組給予生理鹽水灌胃，灌胃體積均為1 mL/100g，1次/d，連續(xù)14 d。給藥劑量根據(jù)《中藥藥理研究方法學》[6]中人與大鼠按體表面積轉(zhuǎn)換系數(shù)換算。

1.5樣本采集方法 末次灌胃后24 h，以3%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，腹主動脈取血，常溫靜置2 h，3 000 r/min離心5 min，分離血清，置于-80 ℃ 冰箱待測。取血完畢后，迅速取出左肺葉組織，一部分肺組織勻漿后，3 000 r/min離心5 min，分離上清液，-80 ℃冰箱凍存待測。另一部分置入4%多聚甲醛溶液中固定備用。

1.6觀察指標

1.6.1大鼠癥狀行為學表現(xiàn) 實驗過程中對各組大鼠進行癥狀行為學觀察，包括咳嗽、精神狀態(tài)、活動、食欲、黏膜顏色，皮毛顏色、體重變化等。

1.6.2病理形態(tài)學觀察 取4%多聚甲醛溶液固定好的左肺葉組織，常規(guī)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成5 μm厚的切片，備做HE染色。光鏡下觀察肺組織炎癥反應、氣管和肺泡改變、血管平滑肌增殖等病理學情況。

1.6.3血清和肺組織中相關(guān)指標水平 采用ELLSA 法檢測血清和肺組織上清液中IL-6、TNF-α、MMP-9、TIMP-1水平，采用化學比色法檢測血清和肺組織上清液中SOD、MDA水平，嚴格按照試劑盒說明進行操作。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠癥狀行為學變化 各造模組大鼠于造模第7天出現(xiàn)咳嗽，第15天咳嗽加重，食量和活動減少，精神狀態(tài)變差，睡眠變多，口唇出現(xiàn)發(fā)紺。第20天體重開始減輕，鼠尾變?yōu)榛野瞪?。清肺化痰顆粒高、中劑量組大鼠用藥5 d，咳嗽減輕，食量和活動增加，用藥9 d后精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，睡眠減少。琥乙紅霉素組和清肺化痰顆粒低劑量組于用藥8 d后咳嗽緩解，食量好轉(zhuǎn)，12 d后精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，活動量增加，毛色變白。

2.2各組大鼠肺組織病理學變化 正常組大鼠肺組織僅有少量炎性細胞，氣管壁完整，肺泡正常，見圖1；模型組大鼠氣管和肺泡中可見大量炎性細胞浸潤，纖毛柱狀細胞部分剝脫，黏膜充血，杯狀細胞增生，血管壁和支氣管平滑肌增厚，肺泡破壞，融合為肺大泡，見圖2；琥乙紅霉素組和清肺化痰顆粒低劑量組大鼠肺組織中炎性細胞浸潤和黏膜充血略有改善，肺泡破壞和融合較少，見圖3及圖4；清肺化痰顆粒高、中劑量組大鼠肺組織中炎性細胞明顯減少，黏膜充血和管壁增厚情況明顯改善，肺泡破壞和融合少，見圖5及圖6。正常組、模型組、琥乙紅霉素組及清肺化痰顆粒高、中、低劑量組肺組織病理半定量評分分別為(1.04±0.09)分、(2.02±0.53)分、(1.56±0.17)分、(1.25±0.11)分、(1.27±0.12)分、(1.58±0.19)分，模型組顯著高于正常組 (P<0.05)，琥乙紅霉素組和清肺化痰顆粒各組均顯著低于模型組(P均<0.05)，且清肺化痰顆粒高、中劑量組顯著低于琥乙紅霉素組(P均<0.05)。

圖1 正常組大鼠肺臟組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖2 模型組大鼠肺臟組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖3 琥乙紅霉素組大鼠肺臟組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖4 清肺化痰顆粒低劑量組大鼠肺臟組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖5 清肺化痰顆粒高劑量組大鼠肺臟組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖6 清肺化痰顆粒中劑量組大鼠肺臟組織HE染色表現(xiàn)(×100)

2.3各組大鼠血清和肺組織中IL-6、TNF-α及IFN-γ水平比較 模型組大鼠血清和肺組織中IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均顯著高于正常組(P均<0.05)；琥乙紅霉素組及清肺化痰顆粒各劑量組大鼠血清和肺組織中IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均顯著低于模型組(P均<0.05)，且清肺化痰顆粒高、中劑量組均顯著低于琥乙紅霉素組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清和肺組織中IL-6、TNF-α及IFN-γ水平比較

2.4各組大鼠血清和肺組織中MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1比較 模型組大鼠血清和肺組織中MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1均顯著高于正常組(P均<0.05)；琥乙紅霉素組及清肺化痰顆粒各劑量組大鼠血清和肺組織中MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1均顯著低于模型組(P均<0.05)，且清肺化痰顆粒高、中劑量組均顯著低于琥乙紅霉素組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清和肺組織中MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1比較

2.5各組大鼠血清和肺組織中MDA、SOD水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清和肺組織中MDA水平顯著增高(P<0.05)，SOD水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，琥乙紅霉素組及清肺化痰顆粒各劑量組大鼠血清和肺組織中MDA水平顯著降低(P均<0.05)，SOD水平顯著增高(P均<0.05)；與琥乙紅霉素組比較，清肺化痰顆粒高、中劑量組MDA水平更低(P均<0.05)，SOD水平更高(P均<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清和肺組織中MDA、SOD水平比較

3 討 論

COPD的發(fā)病與環(huán)境因素關(guān)系較為密切，吸煙、粉塵和空氣污染都可以刺激支氣管黏膜，引起支氣管痙攣，降低氣道黏膜的抵抗力和氣管黏膜纖毛的活動度，損傷清除功能，且呼吸道感染在COPD的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要角色[7-8]。COPD的病理特征為氣道重塑、彈性消失，肺泡破壞，從而引起氣流受限和過度充氣，氣流受限主要發(fā)生于直徑在2 mm以下的氣道[9]。COPD急性加重的主要原因是細菌或病毒感染，其病理表現(xiàn)主要為通氣-血流比例失調(diào)，引起氣體交換障礙，導致低氧血癥[10]。

氣道的慢性炎癥反應是COPD的主要發(fā)病機制之一，并且在急性加重期尤為明顯。研究表明，COPD患者的慢性炎癥反應波及氣道、肺泡和肺實質(zhì)，涉及IL-6、 IL-8、 IL-13、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF等50多種炎癥和細胞因子[11]。IL-6可以促進B細胞增殖和分化，引起中性粒細胞的趨化和激活，參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展，損傷肺組織[12]。TNF-α主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生，在炎癥反應和免疫應答中起著重要作用，是機體炎癥反應的敏感指標，其可以加強中性粒細胞的炎性作用，促進中性粒細胞向肺組織趨化、黏附和滲出，釋放彈性蛋白酶，增強氧化反應，從而損傷上皮細胞，導致肺氣腫[13]。IFN-γ主要由T細胞和NK細胞產(chǎn)生，并增強其活力，參與免疫調(diào)節(jié)反應，增加免疫細胞的殺傷活性[14]。

COPD的發(fā)病機制還包括蛋白酶/抗蛋白酶的失衡，中性粒細胞和巨噬細胞都可以釋放多種蛋白酶對肺組織產(chǎn)生損傷。MMP-9是一種巨噬細胞來源的基質(zhì)金屬蛋白酶，參與氣道重構(gòu)和炎癥細胞浸潤，可以降解氣道和肺的細胞外基質(zhì)，降低肺泡彈性，使肺泡腔擴大，導致肺氣腫的形成[15]。TIMP-1等蛋白酶抑制物的作用正好相反，其由成纖維細胞等產(chǎn)生，可以抑制MMP-9的活性，減少細胞外基質(zhì)的降解，促進修復重塑。COPD發(fā)病過程中MMP-9和TIMP-1含量之比增高，說明炎性反應占優(yōu)勢，細胞外基質(zhì)的降解加快，反之則說明細胞外基質(zhì)以修復為主[16]。

氧化/抗氧化失衡在COPD的發(fā)生和發(fā)展過程中也發(fā)揮著重要作用[17]。MDA是一種過氧化產(chǎn)物，與氧自由基含量呈正相關(guān)，可以反映組織損傷的嚴重程度。SOD是一種具有細胞保護作用的金屬酶，可以使過氧化物分解為過氧化氫和氧，從而有效清除機體內(nèi)的氧自由基，對抗過氧化陰離子自由基，保護生物膜。COPD患者肺組織中由于炎癥細胞浸潤，產(chǎn)生大量的活性氧，氧化/抗氧化動態(tài)平衡被打破，損傷肺泡上皮細胞功能，導致滲出增加，氣流受限[18]。

COPD屬中醫(yī)學中“喘證”“肺脹”等范疇，痰熱壅肺證較為多見，其病位在肺，病機為肺本虛而氣不足，外邪犯肺引起肺失宣肅、痰邪郁阻，日久蘊熱，最終導致脾肺腎虛。因此治療上應采取扶正補虛、清肺化痰之策略[19]。清肺化痰顆粒的成分為槲寄生、野蕎麥和魚腥草，方中槲寄生為君藥，味辛苦溫，《陸川本草》言其功效為 “鎮(zhèn)咳，祛風濕”，《廣西藥植名錄》載其“治虛損勞傷咳嗽”等，肯定了該藥的止咳、祛痰作用。金蕎麥為臣藥，味酸苦寒，有清熱解毒、活血療瘡之功效，《綱目拾遺》云其能“治喉閉，喉風，喉毒”。魚腥草為佐藥，味辛、微寒，《本草經(jīng)疏》載其“治痰熱壅肺”。三藥合用共奏清熱解毒、宣肺消癰之功。現(xiàn)代藥理學研究表明槲寄生中的黃酮類化合物具有減輕炎癥反應，清除自由基和抗氧化的功能[20]。金蕎麥中的原花青素縮合性單寧混合物可以減輕呼吸道的炎癥反應，減少TNF-α表達，保護大鼠肺組織，其中的表兒茶素可以有效清除超氧陰離子自由基，具有抗氧化作用[21]。魚腥草中的揮發(fā)油和黃酮類物質(zhì)等有效成分可以調(diào)節(jié)多種細胞因子的mRNA表達，對抗炎癥反應和氧化反應，同時其對多種細菌和病毒有較強的殺傷能力[22]。

本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織病理半定量評分提高，血清和肺組織中IL-6、TNF-α、IFN-γ、MMP-9、TIMP-1、MDA水平及MMP-9/TIMP-1均顯著升高，SOD水平顯著降低，說明模型建立成功，模型大鼠體內(nèi)存在炎癥反應及氧化應激反應；琥乙紅霉素組及清肺化痰顆粒干預后，各組大鼠肺組織病理半定量評分和血清及肺組織中IL-6、TNF-α、IFN-γ、MMP-9、TIMP-1、MDA水平及MMP-9/TIMP-1均顯著降低，SOD水平顯著增高，尤其以肺化痰顆粒高、中劑量組作用顯著。提示清肺化痰顆粒可有效改善AECOPD大鼠的癥狀，減輕病理損傷，且其作用強度呈劑量依賴性，其作用機制可能與降低炎癥因子IL-6、TNF-α、IFN-γ水平，調(diào)節(jié)蛋白酶/抗蛋白酶失衡和氧化應激失衡有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。