2種芳香化酶抑制劑和3種5型磷酸二酯酶抑制劑的電噴霧四極桿飛行時間質(zhì)譜裂解規(guī)律研究

賴雅琳，武正華，繆文清，陳明，劉慶香，段華健，范國榮*，范琦*（.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 40006；.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，上海 00080）

治療男性不育癥是一個世界性的醫(yī)學(xué)難題，目前缺乏療效顯著的藥物?！吨袊锌萍膊≡\斷治療指南與專家共識》（2016年版）推薦芳香化酶抑制劑（aromatase inhibitors，AIs）作為男性不育癥的治療藥物，常用的AIs 為阿那曲唑和來曲唑[1]。近年來，5 型磷酸二酯酶抑制劑（phosphodiesterase-5 inhibitors，PDE5Is）西地那非和他達(dá)拉非也被用于經(jīng)驗性治療男性不育癥[2-4]。其中，西地那非的體內(nèi)代謝產(chǎn)物N-去甲基西地那非也具有藥理活性。上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院泌尿男科李崢教授團隊研究發(fā)現(xiàn)一次性按需口服西地那非可改善特發(fā)性少弱精子癥患者的前向運動精子百分比和前向精子運動總數(shù)[5]。目前，該團隊正在嘗試聯(lián)合使用AIs 與PDE5Is，以期改善男性不育癥的療效。

采用高分辨電噴霧四極桿飛行時間質(zhì)譜（ESIQ-TOF/MS）法探究AIs 與PDE5Is 聯(lián)合使用的體內(nèi)過程，需要先研究這兩類酶抑制劑的質(zhì)譜裂解規(guī)律，以進一步開展其藥效動力學(xué)研究。迄今為止，關(guān)于AIs 的質(zhì)譜裂解規(guī)律，未見文獻(xiàn)報道；關(guān)于PDE5Is 的質(zhì)譜分析，文獻(xiàn)報道主要集中于中藥[6-7]或保健品[8-10]中非法添加物的快速鑒定，即僅限于對高離子強度特征碎片離子的歸屬分析。

本文采用ESI-Q-TOF/MS 正離子檢測模式，對AIs（阿那曲唑和來曲唑）以及PDE5Is（西地那非、N-去甲基西地那非和他達(dá)拉非）共5 個化合物的特征碎片離子進行分析，并闡述它們的裂解過程，對已發(fā)現(xiàn)的特征碎片離子進行確證，對新發(fā)現(xiàn)的碎片離子進行歸屬分析，以探索新的裂解途徑，總結(jié)質(zhì)譜裂解規(guī)律，為AIs 與PDE5Is聯(lián)合使用的體內(nèi)過程以及藥效動力學(xué)研究提供基礎(chǔ)，并為兩類酶抑制劑的結(jié)構(gòu)解析及藥效評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 Infinity 超高效液相色譜系統(tǒng)（配有二元泵、在線脫氣機、自動進樣器和柱溫箱）、Agilent 6545 Q-TOF 質(zhì)譜儀[配有電噴霧離子（ESI）源及Mass Hunter 在線分析軟件]（美國Agilent 公司）；AUW220D 電子分析天平（日本Shimadzu公司）；MX-S 渦旋混合器（美國Scilogex 公司）；SK7200H 超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；Hitech 水純化系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）。

1.2 試藥

阿那曲唑?qū)φ掌罚ㄅ枺?00770-201302，純度：99.7%，中國食品藥品檢定研究院）；來曲唑?qū)φ掌罚ㄅ枺篈0610AS，純度＞98%，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；西地那非（批號：X23A8Y42189，純度≥98%）、N-去甲基西地那非（批號：J16A10H95420，純度：95%）、他達(dá)拉非（批號：Y20F8C29468，純度≥99%）對照品（上海源葉生物科技有限公司），化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。

甲醇（德國Merck 公司）、乙腈（美國TEDIA公司）、甲酸（美國ACS 公司）均為色譜純，水為去離子水（自制）。質(zhì)譜所用參比液與調(diào)諧液均由美國Agilent 公司提供。

圖1 阿那曲唑、來曲唑、西地那非、N-去甲基西地那非和他達(dá)拉非的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structures of anastrozole，letrozole，sildenafil，N-desmethylsildenafil and tadalafil

2 方法

2.1 UPLC-ESI-Q-TOF/MS 法

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱（1.8 μm，2.1 mm×50 mm）；柱溫為25℃；流動相為0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min，20%～90%B；1～2 min，90%B；2～2.1 min，90%～20%B；2.1～3 min，20%B）；流速為0.4 mL·min－1；進樣量為5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子（ESI）源，正離子模式，毛細(xì)管電壓為4000 V，霧化器壓力為35 psi，干燥氣（N2）流速為8 L·min－1、溫度為320 ℃，鞘氣（N2）流速為11 L·min－1、溫度為350℃；碎裂電壓為175 V；錐孔電壓為65 V；噴嘴電壓為500 V。掃描范圍為m/z100 ～500；掃描方式為自動一級質(zhì)譜全掃描和手動二級質(zhì)譜提取離子掃描；碰撞電壓為20 ～60 eV。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取阿那曲唑、來曲唑、西地那非、N-去甲基西地那非和他達(dá)拉非對照品各適量，分別用甲醇溶解并稀釋制得1 mg·mL－1的對照品儲備液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＞芰咳∩鲜龈鲗φ掌穬湟哼m量，分別用50%甲醇溶液稀釋即得50 ng·mL－1的對照品溶液。

3 結(jié)果與分析

3.1 一級質(zhì)譜分析

在正離子一級全掃描質(zhì)譜中，5 個化合物均以[M ＋H]＋準(zhǔn)分子離子峰為基峰，且均有較強的響應(yīng)，其一級提取離子流色譜圖如圖2 所示。

3.2 二級質(zhì)譜分析

對于阿那曲唑和來曲唑，將碰撞電壓優(yōu)化至20 ～50 eV；對于西地那非、N-去甲基西地那非和他達(dá)拉非，將碰撞電壓優(yōu)化至30 ～60 eV。分別對5 個化合物的準(zhǔn)分子離子進行碰撞誘導(dǎo)解離（collisional-induced dissociation，CID），利用質(zhì)譜圖累加采集（multiple cycle accumulation，MCA）技術(shù)將不同碰撞電壓下產(chǎn)生的系列碎片離子峰疊加為一張質(zhì)譜圖，以直觀觀察二級質(zhì)譜碎片離子峰，從而獲得精確質(zhì)量的質(zhì)譜碎片信息。

圖2 阿那曲唑、來曲唑、西地那非、N-去甲基西地那非和他達(dá)拉非的一級提取離子流色譜圖Fig 2 Extracted ion chromatograms of anastrozole，letrozole，sildenafil，N-desmethylsildenafil and tadalafil

3.2.1 芳香化酶抑制劑的質(zhì)譜裂解規(guī)律分析 阿那曲唑的準(zhǔn)分子離子[M ＋H]＋m/z為294.1726，對其進行CID 得到二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，如圖3 所示。可以觀察到m/z225.1400 碎片離子強度最高，與準(zhǔn)分子離子在質(zhì)量數(shù)上相差69.0326，根據(jù)精確質(zhì)量計算結(jié)合結(jié)構(gòu)分析，可以確定是H＋離子加合在三氮唑的一個堿性N 原子上，C-N 鍵發(fā)生斷裂的同時正電荷中心轉(zhuǎn)移脫三氮唑中性碎片而形成，該碎片離子結(jié)構(gòu)中的芐基正離子會通過擴環(huán)異構(gòu)化形成共振雜化體的七元環(huán)?鎓離子使體系趨于穩(wěn)定[11]，因此成為離子強度最高的碎片。當(dāng)碰撞電壓增大時，觀察到其他碎片離子的出現(xiàn)，認(rèn)為是七元環(huán)?鎓離子縮環(huán)重排構(gòu)成一個芐基連接叔碳的結(jié)構(gòu)，以此結(jié)構(gòu)繼續(xù)裂解?？傮w存在兩條裂解途徑，第一條途徑是依次脫叔碳上的取代基，取代基中優(yōu)勢脫CH3，連接CH3的C-C 鍵均發(fā)生均裂脫CH3自由基，其次是芐基H 原子經(jīng)五元環(huán)過渡態(tài)重排至N 原子上后脫HCN，從而得到m/z210.1157、m/z195.0924、m/z168.0813 碎片離子；m/z209.1082 碎片離子與m/z210.1157碎片離子在質(zhì)量數(shù)上相差1.0075，推測是后者脫H 自由基形成的共軛結(jié)構(gòu)。第二條途徑是芐基與叔碳之間的C-C 鍵發(fā)生均裂脫C4H6N 自由基得到m/z157.0889 碎片離子，此時形成的芐基結(jié)構(gòu)同前述原理擴環(huán)重排后進而裂解得到m/z142.0657、m/z130.0779、m/z115.0547 碎片離子；觀察到m/z129.0703 碎片離子與m/z130.0779 碎片離子強度相同，質(zhì)量數(shù)上相差1.0076，推測是后者發(fā)生分子內(nèi)重排并脫H 自由基而形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。阿那曲唑可能的裂解途徑如圖4 所示。

圖3 阿那曲唑的二級質(zhì)譜圖Fig 3 MS/MS spectrum of anastrozole

來曲唑的準(zhǔn)分子離子[M ＋H]＋m/z為286.1089，對其進行CID 得到二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，如圖5 所示?？梢杂^察到準(zhǔn)分子離子峰消失，反而出現(xiàn)m/z為288.2897 的離子峰，推測是來曲唑結(jié)構(gòu)中的三氮唑易受碰撞誘導(dǎo)影響發(fā)生加氫反應(yīng)，進而出現(xiàn)的[M ＋2 ＋H]＋峰，隨后以此結(jié)構(gòu)進行裂解。同阿那曲唑相似，來曲唑先脫三氮唑中性碎片得到m/z217.0757 碎片離子；隨后苯環(huán)鄰位H 原子經(jīng)五元環(huán)過渡態(tài)重排至N 原子上脫HCN 得到m/z190.0647 碎片離子；另外，觀察到m/z215.0598 碎片離子，與m/z217.0757碎片離子在質(zhì)量數(shù)上相差2.0159，認(rèn)為是兩個苯環(huán)相鄰H 原子以自由基的形式脫落進而形成“芴”的結(jié)構(gòu)。除此之外，從圖5 中還觀察到m/z106.0862 碎片離子強度最高，推測是[M ＋2 ＋H]＋m/z288.2897離子C-C 鍵發(fā)生異裂后經(jīng)[C7H4N＋/C10H10N4]離子/中性復(fù)合物介導(dǎo)氫遷移反應(yīng)丟失C10H6N4中性碎片而形成[12]。來曲唑可能的裂解途徑如圖6 所示。

圖4 阿那曲唑可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig 4 Possible fragmentation pathway of anastrozole

圖5 來曲唑的二級質(zhì)譜圖Fig 5 MS/MS spectrum of letrozole

3.2.2 5 型磷酸二酯酶抑制劑的質(zhì)譜裂解規(guī)律分析 西地那非與N-去甲基西地那非的準(zhǔn)分子離子[M ＋H]＋m/z分別為475.3250、461.1968，對其進行CID 得到二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，如圖7 所示?，F(xiàn)有文 獻(xiàn)[7，13]已 歸 屬m/z377、m/z311、m/z299、m/z283、m/z255、m/z227、m/z166、m/z99 特征碎片離子，本研究經(jīng)過高分辨質(zhì)譜還獲得了西地那非低質(zhì)量區(qū)其他特征碎片離子，尚未見文獻(xiàn)報道。從圖7 中可以觀察到西地那非與N-去甲基西地那非在中質(zhì)量區(qū)的特征碎片離子基本一致，但在低質(zhì)量區(qū)的碎片離子差異明顯。分析發(fā)現(xiàn)西地那非和N-去甲基西地那非總體存在3 條裂解途徑。由于結(jié)構(gòu)中的磺?；械膬蓚€O 原子具有很強的吸電子作用，導(dǎo)致 N-S 與C-S 鍵均不穩(wěn)定，易發(fā)生斷裂，因此第一條途徑為哌嗪環(huán)上的H 原子經(jīng)五元環(huán)過渡態(tài)重排至O 原子上并發(fā)生N-S 鍵斷裂脫哌嗪結(jié)構(gòu)得到m/z377.1273（m/z377.1292）碎片離子；緊接著C-S 鍵發(fā)生斷裂脫H2SO2得到m/z311.1498（m/z311.1508）碎片離子，這與二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)中m/z377 碎片離子強度較低相吻合；隨后苯環(huán)烷氧基末端H 原子經(jīng)四元環(huán)重排至O 原子上脫C2H4得到m/z283.1186（m/z283.1190）碎片離子；以此結(jié)構(gòu)脫CO 得到m/z255.1229（m/z255.1248）碎片離子，該脫落過程有兩種可能，梁祈[14]認(rèn)為是苯環(huán)開環(huán)脫CO，而高青等[15]認(rèn)為是C-7 位脫CO；從圖7 中觀察到西地那非m/z119.0853 碎片離子強度較高，推測是C-7 位脫CO 后接著C-N 鍵斷裂脫吡唑結(jié)構(gòu)得到m/z135.0801 碎片離子，此碎片離子不穩(wěn)定繼續(xù)脫NH2自由基而形成；m/z102.1275 碎片離子與m/z119.0853 在質(zhì)量數(shù)上相差16.9578，提示苯環(huán)上OH 自由基的脫落；還觀察到西地那非m/z107.0856 質(zhì)譜碎片信號，推測是苯環(huán)開環(huán)脫CO 后C-7 位繼續(xù)脫CO 和吡唑結(jié)構(gòu)而形成。第二條途徑為磺酰基上的O 原子經(jīng)四元環(huán)重排至苯環(huán)鄰位并發(fā)生C-S 鍵斷裂，接著O-S 鍵斷裂脫C5H12N2OS 中性碎片形成m/z為327 的過渡離子，隨即脫C2H4或CO 得到m/z299.1129（m/z299.1133）碎片離子，于泓等[13]認(rèn)為是苯環(huán)烷氧基重排脫C2H4，而梁祈[14]認(rèn)為是苯環(huán)開環(huán)脫CO。第三條途徑為C-5 與N-4位、C-7 與N-6 位之間均發(fā)生斷裂脫C14H19N3O3S（C13H17N3O3S）中性碎片得到m/z166.0972（m/z166.0975）碎片離子。除此之外，觀察到西地那非m/z100.0993 碎片離子，推測是N-S 鍵發(fā)生異裂后經(jīng)[C17H19N4O4S＋/C5H12N2]離子/中性復(fù)合物介導(dǎo)電子遷移丟失C17H19N4O4S 自由基而形成。西地那非和N-去甲基西地那非可能的裂解途徑如圖8 所示。

圖6 來曲唑可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig 6 Possible fragmentation pathway of letrozole

圖7 西地那非（A）和N-去甲基西地那非（B）的二級質(zhì)譜圖Fig 7 MS/MS spectra of sildenafil（A）and N-desmethylsildenafil（B）

他達(dá)拉非的準(zhǔn)分子離子[M ＋H]＋m/z為390.1448，對其進行CID 得到二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，如圖9 所示?，F(xiàn)有文獻(xiàn)[6，9，15]已歸屬m/z268、m/z262、m/z250、m/z240、m/z224、m/z197、m/z169、m/z135 特征碎片離子，本研究經(jīng)過高分辨質(zhì)譜獲得的主要特征碎片離子集中在低質(zhì)量區(qū)，未見文獻(xiàn)報道。從圖9 中觀察到準(zhǔn)分子離子峰消失，出現(xiàn)m/z373.1857 碎片離子，提示酮式結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易發(fā)生酮式-烯醇式互變后脫OH 自由基，因此得到離子強度較高的m/z373.1857 質(zhì)譜碎片信號，隨后以此結(jié)構(gòu)進行裂解。首先，觀察到m/z173.0807 碎片離子強度最高，推測是C-6 位與苯環(huán)之間發(fā)生均裂脫C7H5O2自由基形成m/z252 的過渡離子，隨即發(fā)生分子內(nèi)重排脫CO 和丙炔腈中性碎片而形成。另外，C-6 位與N-5 位、吡咯環(huán)之間均發(fā)生斷裂脫C8H7O2自由基形成m/z238 的過渡離子，隨即發(fā)生分子內(nèi)重排脫CO 和丙腈中性碎片，與離子強度較高的m/z155.0702 碎片離子吻合；接著脫CN 自由基得到m/z129.0547 碎片離子；觀察到m/z101.0596 質(zhì)譜碎片信號，提示亞胺甲烷自由基的脫落。除此之外，還觀察到m/z111.0440 碎片離子，認(rèn)為是C-6 與N-5 位、C-12 與C-12a 位之間均發(fā)生斷裂脫C17H12NO2自由基而形成。他達(dá)拉非可能的質(zhì)譜裂解途徑如圖10 所示。

圖8 西地那非（R ＝CH3）和N-去甲基西地那非（R ＝H）可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig 8 Possible fragmentation pathways of sildenafil（R ＝CH3）and N-desmethylsildenafil（R ＝H）

圖9 他達(dá)拉非的二級質(zhì)譜圖Fig 9 MS/MS spectrum of tadalafil

4 討論

本文采用m/z100 ～500 的掃描范圍對2 種AIs（阿那曲唑和來曲唑）以及3 種PDE5Is（西地那非、N-去甲基西地那非和他達(dá)拉非）進行正負(fù)離子一級全掃描，結(jié)果顯示5 個化合物在正離子模式下響應(yīng)均較高，而在負(fù)離子模式下無響應(yīng)或響應(yīng)較低，推測其可能的原因是5 個化合物均含有未共軛的N 原子，這些N 原子上的孤對電子具有較強的供電子能力，易加合H＋離子，因此選擇正離子模式檢測。此外，優(yōu)化流動相時比較了水-乙腈、0.1%甲酸溶液-乙腈和2 mmol·L－1乙酸銨溶液-乙腈，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，流動相中加入酸可顯著提高離子化效率和靈敏度，最終選擇0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動相。

圖10 他達(dá)拉非可能的的質(zhì)譜裂解途徑Fig 10 Possible fragmentation pathways of tadalafil

本文得到的他達(dá)拉非的主要特征碎片離子信息與文獻(xiàn)[6，9，15]報道不一致，其準(zhǔn)分子離子不穩(wěn)定，易通過酮式-烯醇式互變后脫OH 自由基得到m/z373.1857 碎片離子，再繼續(xù)裂解，其可能的原因是酮式-烯醇式互變后，O 原子的孤對電子易使其加合H＋離子，誘導(dǎo)C-O 鍵異裂形成[C22H18N3O3＋/H2O]離子/中性復(fù)合物，進而介導(dǎo)氫遷移反應(yīng)脫OH 自由基。該新的裂解方式可為他達(dá)拉非的進一步研究提供參考。