基于串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的芍甘附子湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制研究

董琳琳，石璐，苗豐，豐晨然，靖衛(wèi)霞，賈占紅，趙一穎，孫文燕*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 0488；.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 0009）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性自身免疫性疾病，患病人群多為中老年人，且女性患病率高于男性。臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、骨質(zhì)破壞，嚴(yán)重者可致關(guān)節(jié)畸形，還可累及全身多個(gè)器官。該病病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前尚無根治藥物。

芍甘附子湯出自《傷寒論》，全方由白芍、附子、甘草組成，臨床治療RA 有確切療效[1]。本課題組前期研究結(jié)果表明，芍甘附子湯對(duì)牛Ⅱ型膠原（C Ⅱ）誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠有明確的治療作用，可顯著改善大鼠關(guān)節(jié)腫脹，減輕關(guān)節(jié)病理損傷，但作用機(jī)制尚不明確。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是近年來新興的一種實(shí)驗(yàn)方法。串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（tandem mass tag，TMT）是利用化學(xué)標(biāo)簽通過串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)不同樣品中的蛋白同時(shí)進(jìn)行鑒定和定量的研究方法，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究[2-3]。本研究通過建立CIA 大鼠模型，以足跖腫脹度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分評(píng)價(jià)芍甘附子湯的藥效，采用TMT 定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)芍甘附子湯對(duì)CIA大鼠滑膜組織蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步應(yīng)用生物信息學(xué)手段對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，初步探究芍甘附子湯防治RA 的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)Wistar 大 鼠，雄 性，體 質(zhì) 量170 ～190 g[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006]。

1.2 試藥

芍甘附子湯（黑順片3 g、白芍9 g、甘草9 g）配方顆粒（北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，由北京康仁堂藥業(yè)制成，以確保藥品質(zhì)量），給藥時(shí)以生理鹽水充分溶解，按照人日用量換算大鼠的等效劑量為2.1 g（生藥）·kg－1。

牛Ⅱ型膠原（Chondrex 公司，批號(hào)：190306），不完全弗氏佐劑（IFA，Sigma 公司，批號(hào)：SLBZ0619），A955-4 質(zhì)譜級(jí)乙腈（Fisher 公司），尿素、Tris（AMRESCO 公司），氨水（Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：318612），二硫蘇糖醇（AMRESCO 公司，批號(hào)：M109-25G），碘乙酰胺（Bio-Rad 公司，批號(hào)：163-2109），甲酸（Sigma-Aldrich 公司，批號(hào)：A117-50），考馬斯亮藍(lán)R-250（Thermo Fisher Scientific 公司），V5111 質(zhì)譜級(jí)胰蛋白酶（Promega公司），去離子水（Milipore 公司），蛋白Marker（Thermo Fisher Scientific 公司，批號(hào)：26616），無水乙醇（北京化工廠），硫脲（Sigma-Aldrich），TMT試劑（Thermo Fisher Scientific 公司，批號(hào)：90110），CHAPS（AMRESCO 公司），Protease Inhibitor Cocktail（Roche 公司，批號(hào)：11836170001）。

1.3 儀器

YLS-7B 型足跖容積測(cè)量?jī)x（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司），分析天平（賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），可調(diào)量程移液器（德國(guó)Eppendorf 公司），pH計(jì)（瑞士Mettler Toledo 公司），MultiskanGO1510酶標(biāo)儀、超低溫冰箱、超速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），制冰機(jī)（日本Sanyo 公司），渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），金屬浴（英國(guó)Stuart 公司），電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司），Powerpac1000 電泳儀、脫色搖床（北京新技術(shù)應(yīng)用研究所），恒溫水浴鍋（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司），RIGOLL-3000 高效液相色譜（北京普源精電科技有限公司），Orbitrap Fusion Lumos 質(zhì)譜儀、SAVANT 系列真空干燥儀（美國(guó)Thermo 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 動(dòng)物分組、造模與給藥[4]

動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將2.0 g·L－1的CⅡ醋酸溶液與IFA 等體積混勻，在冰浴條件下充分乳化，并于實(shí)驗(yàn)第1日（d 1）（初次免疫0.2 mL/只）及第7日（d 7）（加強(qiáng)免疫0.1 mL/只）進(jìn)行尾根部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，正常組給予同等劑量的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第21日（d 21），將造模成功即關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）評(píng)分≥2 的大鼠按照分層隨機(jī)分配法分成模型組與芍甘附子湯組[2.1 g（生藥）/（kg·d）]，并設(shè)置正常組，每組16 只。實(shí)驗(yàn)第21日（d 21）開始給藥干預(yù)，正常組和模型組均給予生理鹽水灌胃，治療組則給予2.1 g（生藥）·kg－1芍甘附子湯配方顆粒灌胃，每日1 次，連續(xù)4 周。

2.2 足跖腫脹度測(cè)定及AI 評(píng)分

于實(shí)驗(yàn)前（d 0）、d 7、d 14、d 21、d 28、d 35、d 42、d 49 采用足跖容積測(cè)量?jī)x測(cè)定，足跖腫脹度計(jì)算公式為：腫脹度＝致炎后足跖體積－致炎前足跖體積。于實(shí)驗(yàn)d 14、d 21、d 28、d 35、d 42、d 49 對(duì)模型組和芍甘附子湯組大鼠進(jìn)行AI 評(píng)分[5]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為無關(guān)節(jié)紅腫，0 分；足小趾關(guān)節(jié)紅腫，1分；趾關(guān)節(jié)及足跖關(guān)節(jié)腫脹，2 分；踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹，3 分；包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹，4分。

2.3 TMT 定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析

2.3.1 蛋白提取 于d 49 取各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，每組隨機(jī)選取3 只。將研磨使用的物品用液氮預(yù)冷，樣本研磨成粉，按照1∶10（W/V）加入裂解液（7 mol·L－1尿素，1%蛋白酶抑制劑），渦旋混勻。樣本管中加入鋼珠，置于組織研磨儀中勻漿，冰上靜置30 min。13 000 r·min－1，4℃離心15 min，吸取上清液，分裝后凍存于－80℃冰箱。Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。

2.3.2 蛋白酶解 每個(gè)樣品分別取等量蛋白加入終濃度為25 mmol·L－1的二硫蘇糖醇，渦旋混勻，37 ℃水浴1 h，取出放至室溫。加入終濃度為50 mmol·L－1的碘乙酰胺，渦旋混勻，避光室溫放置30 min。加入0.2 mol·L－1的三乙基碳酸氫銨300 μL，12 000 r·min－1離心10 min，棄掉收集管底部溶液，重復(fù)3 次，再加入0.5 mol·L－1的三乙基碳酸氫銨300 μL，12 000 r·min－1離心10 min。按照胰蛋白酶與蛋白1∶50 的比例，加入胰蛋白酶50 μL，37℃反應(yīng)過夜。次日，加入0.2 mol·L－1的三乙基碳酸氫銨100 μL，12 000 r·min－1離心10 min，重復(fù)3 次，酶解消化后的肽段溶液離心于收集管底部。

2.3.3 TMT 標(biāo)記及除鹽 從冰箱中取出TMT 試劑，平衡到室溫，將TMT 試劑離心至管底。每管加入41 μL 無水乙腈，渦旋振蕩至完全溶解，離心至管底。加入100 μL 的100 mmol·L－1三乙基碳酸氫銨復(fù)溶樣本（25 ～100 μg 蛋白），渦旋振蕩，離心至管底。將41 μL TMT 試劑按順序加入樣品中，渦旋振蕩，離心至管底，室溫反應(yīng)1 h。標(biāo)記樣品加入8 μL 5%羥胺，室溫孵育15 min 終止標(biāo)記反應(yīng)。HLB固相萃取柱除鹽，置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.4 離線高pH 反相高效液相色譜分離 將TMT 的多肽樣品重溶于A 液（98% ddH2O，2%乙腈，氨水調(diào)pH 至10.0）中。經(jīng)離線XBridge?peptide BEH C18高效液相色譜柱（130?，3.5 μm，4.6 mm×150 mm）分離，洗脫緩沖液B 液為98.0%乙腈，2.0%去離子水（pH 10.0）。每隔1 min 收集一管組分，共收集40 管，按順序?qū)悠泛喜?0 管組分。將收集的組分置于旋轉(zhuǎn)真空干燥儀中真空干燥，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.5 LC-MS/MS 分析 使用Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀分析鑒定多肽混合物。使用高靈敏度模式，參數(shù)設(shè)置：每個(gè)全掃描為高速信號(hào)依賴掃描，掃描75 min。一級(jí)全掃描分辨度12 000，掃描范圍為350 ～1550m/z，AGC5e5，最大注射時(shí)間為50 ms，碰撞能量為35%，二級(jí)掃描分辨度15 000，電荷狀態(tài)篩選（包含＋2 至＋6 電荷的前體），動(dòng)態(tài)消除30 s，AGC5e4，最大注射時(shí)間為22 ms。

2.3.6 數(shù)據(jù)分析 所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過Mascot（version 2.5.1）檢索，Scaffold Q ＋（version 4.6.2）軟件進(jìn)行蛋白定量定性分析，運(yùn)用UNIPROT_Rat_29954_20181130.fasta（序列總數(shù)：29954）（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫對(duì)蛋白進(jìn)行初步分類。對(duì)蛋白定量數(shù)據(jù)進(jìn)行成對(duì)t檢驗(yàn)，篩選P≤0.05 的蛋白質(zhì)，為顯著差異蛋白質(zhì)。利用Omics Box 軟件（版本：1.2.4）對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行GO（http：//geneontology.org/）功能注釋分析，并利用KEGG（https：//www.kegg.jp/）富集分析可能的通路。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

足跖腫脹度及AI 評(píng)分均采用SAS 9.2 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為連續(xù)變量以±s表示，使用方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 結(jié)果

2.5.1 芍甘附子湯對(duì)CIA 大鼠足跖腫脹度的影響 自初次免疫后d 14 ～d 49，模型組大鼠相對(duì)于正常組左后足明顯腫脹（P＜0.01）。芍甘附子湯組與模型組比較，左后足跖腫脹度自初次免疫后d 35 ～d 49 明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），見表1。初次免疫后d 14 ～d 49，模型組大鼠相對(duì)于正常組右后足跖腫脹度升高（P＜0.01）。芍甘附子湯組與模型組比較，自初次免疫后d 35 ～d 49，右后足跖腫脹度明顯減輕（P＜0.01）（見圖1 及表2）。

圖1 各組大鼠后足腫脹情況Fig 1 Swelling of the hind foot of rats in each group A.正常組（normal group）；B.模型組（model group）；C.芍甘附子湯組（Shaogan Fuzi decoction group）；1.給藥前（before the administration）；2.給藥后（after the administration）

表1 芍甘附子湯對(duì)CIA 大鼠左后足跖腫脹度的影響(±s，n ＝16)Tab 1 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the swelling of the left hind foot of CIA rats (±s，n ＝16)

表1 芍甘附子湯對(duì)CIA 大鼠左后足跖腫脹度的影響(±s，n ＝16)Tab 1 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the swelling of the left hind foot of CIA rats (±s，n ＝16)

注：與正常組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。Note：Compared with the normal group，**P ＜0.01；compared with the model group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01.

組別 左后足跖腫脹度/mL d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d 49正常組 0.11±0.07 0.21±0.12 0.24±0.13 0.30±0.14 0.36±0.11 0.43±0.13 0.42±0.12模型組 0.10±0.09 0.66±0.35** 1.16±0.55** 1.44±0.61** 1.30±0.48** 1.31±0.49** 1.25±0.59**芍甘附子湯組 0.09±0.10 0.65±0.50 1.11±0.43 1.34±0.44 0.93±0.48△ 0.88±0.55△△ 0.82±0.42△

表2 芍甘附子湯對(duì)CIA 大鼠右后足跖腫脹度的影響(±s，n ＝16)Tab 2 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the swelling of the right hind foot of CIA rats (±s，n ＝16)

表2 芍甘附子湯對(duì)CIA 大鼠右后足跖腫脹度的影響(±s，n ＝16)Tab 2 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the swelling of the right hind foot of CIA rats (±s，n ＝16)

注：與正常組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01。Note：Compared with the normal group，*P ＜0.05，**P ＜0.01；compared with the model group，△△P ＜0.01.

組別 右后足跖腫脹度/mL d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d 49正常組 0.08±0.07 0.17±0.09 0.21±0.09 0.29±0.11 0.32±0.12 0.42±0.12 0.41±0.14模型組 0.11±0.12 0.69±0.43** 1.00±0.52** 1.44±0.44* 1.52±0.57** 1.52±0.54** 1.37±0.56**芍甘附子湯組 0.05±0.16 0.48±0.34 1.01±0.37 1.21±0.57 0.94±0.54△△ 0.86±0.56△△ 0.78±0.42△△

2.5.2 芍甘附子湯對(duì)CIA 大鼠AI 評(píng)分的影響 正常組AI 評(píng)分為0 分，芍甘附子湯組自初次免疫d 28 ～d 49，AI 評(píng)分較模型組明顯下降（P＜0.05），見表3。

表3 芍甘附子湯對(duì)CIA 大鼠AI 評(píng)分的影響(±s，n ＝16)Tab 3 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the AI score of CIA rats (±s，n ＝16)

表3 芍甘附子湯對(duì)CIA 大鼠AI 評(píng)分的影響(±s，n ＝16)Tab 3 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the AI score of CIA rats (±s，n ＝16)

注：與模型組比較，△P ＜0.05。Note：Compared with the model group，△P ＜0.05.

組別 AI 評(píng)分/分d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d 49模型組 4.38±1.89 5.53±1.78 7.72±1.37 6.00±2.71 5.56±2.45 5.81±2.45芍甘附子湯組 5.38±1.59 6.00±3.01△ 3.81±1.91△ 3.47±2.05△ 3.94±2.05△ 3.94±2.05△

2.5.3 蛋白質(zhì)組學(xué)差異蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果 以Ratio ＞1.2 或Ratio ＜0.833 且P＜0.05 為篩選條件，模型組與正常組相比較，共鑒定出85 個(gè)差異蛋白質(zhì)；芍甘附子湯組與模型組相比較，共鑒定出49 個(gè)差異蛋白質(zhì)（見表4 及5）。

2.5.4 GO 富集分析結(jié)果 GO 富集分析包括對(duì)芍甘附子湯組與模型組差異蛋白質(zhì)的分子功能（molecular function，MF）、生物學(xué)過程（biological Process，BP）和細(xì)胞組分（cellular component，CC）的分析。圖2 為MF、BP、CC 三類富集分析差異顯著性前10 的條目。其中，MF 共涉及45 個(gè)功能，主要包括O-?；D(zhuǎn)移酶活性、碳水化合物結(jié)合、β淀粉樣蛋白結(jié)合、L-抗壞血酸結(jié)合、AU 堿基富集結(jié)合、3'-UTR 和AU 堿基富集結(jié)合、泛素結(jié)合酶活性、2-氧代戊二酸依賴性雙加氧酶活性、泛素樣蛋白結(jié)合酶活性、脫氧核糖核苷酸結(jié)合等（見表6）；BP 涉及到104 個(gè)生物過程，主要有RNA 剪接的負(fù)調(diào)控、通過剪接體對(duì)mRNA 剪接的負(fù)調(diào)控、肽賴氨酸羥化、mRNA 加工的負(fù)調(diào)控、干細(xì)胞分裂、有絲分裂細(xì)胞周期相變的負(fù)調(diào)控、通過剪接體調(diào)控mRNA 剪接、細(xì)胞周期相變的負(fù)調(diào)控、RNA 剪接的調(diào)控等（見表7）；CC 涉及到富含四跨素的微結(jié)構(gòu)域、紡錘體基質(zhì)、NatC 復(fù)合體、Rb-E2F 復(fù)合物、突觸前膜的錨固成分、突觸后膜的錨固成分、突觸膜的錨固成分、AMPA 谷氨酸受體復(fù)合物、補(bǔ)體成分C1 復(fù)合物、BRCA1-A 復(fù)合物等（見表8）。

表4 模型組與正常組的差異蛋白質(zhì)(n ＝3)Tab 4 Differential protein between model group and normal group (n ＝3)

續(xù)表4

2.5.5 KEGG 通路富集結(jié)果 芍甘附子湯組與模型組差異蛋白質(zhì)的KEGG 通路富集分析涉及到剪接體、細(xì)胞衰老、人類免疫缺陷病毒1 感染、賴氨酸降解、RNA 降解、百日咳、FcγR 介導(dǎo)的吞噬作用、病毒性心肌炎、TGF-β信號(hào)通路、細(xì)胞周期、Apelin 信號(hào)通路等18 條相關(guān)通路，其中與RA 相關(guān)的有TGF-β信號(hào)通路、Apelin 信號(hào)通路等（見圖3 及表9）。

3 討論

RA 具有慢性、進(jìn)行性、侵蝕性和破壞性的特點(diǎn)，致殘率高，對(duì)工作及生活影響極大。CIA模型是公認(rèn)的RA 模型，其關(guān)節(jié)腫脹、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、關(guān)節(jié)滑膜增生、血管翳形成、關(guān)節(jié)軟骨組織病變等臨床特征與RA 患者相似。并且CIA 模型的發(fā)生依賴于T、B 細(xì)胞的激活增殖，其發(fā)病機(jī)制也與RA 患者相似[6]。本研究選用Wistar 大鼠，采用CⅡ與IFA 尾根部皮內(nèi)注射法復(fù)制CIA模型，注射后動(dòng)物出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫、活動(dòng)受限等關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，表明模型復(fù)制成功。

芍甘附子湯中白芍具有養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛功效。甘草作為補(bǔ)益藥，具有調(diào)和諸藥、緩急止痛功效；附子性味辛、甘，大熱，具有散寒止痛功效；諸藥共用可散寒祛濕、通絡(luò)止痛[7]。藥理研究表明，白芍有效成分白芍總苷具有明顯的抗炎作用，對(duì)于RA 療效確切，而芍藥苷占白芍總苷的90%以上，多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可顯著降低RA 模型大鼠的關(guān)節(jié)腫脹[8]。甘草具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用[9-10]。附子具有增強(qiáng)免疫、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[11]。本研究表明芍甘附子湯能顯著降低CIA 大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度及AI 評(píng)分，即對(duì)RA具有治療作用，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]。

表5 芍甘附子湯組與模型組的差異蛋白質(zhì)(n ＝3)Tab 5 Differential protein between Shaogan Fuzi decoction group and model group (n ＝3)

圖2 生物信息學(xué)分析結(jié)果Fig 2 Bioinformatics analysis results

圖3 KEGG 通路富集結(jié)果Fig 3 KEGG pathway enrichment results

表6 差異蛋白質(zhì)的主要分子功能分析Tab 6 Analysis of the main molecular functions of differential proteins

表7 差異蛋白質(zhì)的主要生物過程分析Tab 7 Analysis of the main biological processes of differential proteins

表8 差異蛋白質(zhì)的主要細(xì)胞組分分析Tab 8 Analysis of main cell components of differential proteins

中藥復(fù)方通過多靶點(diǎn)、多成分治療疾病，在整體層面上起效。蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)生物體內(nèi)所有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、相互作用以及在體內(nèi)的變化進(jìn)行研究，進(jìn)而對(duì)變化的蛋白質(zhì)進(jìn)行追蹤，尋找潛在的生物標(biāo)志物，提示疾病可能的發(fā)病機(jī)制，從而更好地為臨床診斷及預(yù)后提供依據(jù)。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究手段與中藥復(fù)方的作用特點(diǎn)不謀而合。因此，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法初步探究芍甘附子湯治療RA 的作用機(jī)制。

蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，與正常組相比，模型組IL1RAP、Cntn1、Copz1 等85 個(gè)蛋白表達(dá)出現(xiàn)顯著性差異。與模型組相比，芍甘附子湯組有49 個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)出現(xiàn)顯著性差異。GO 富集分析表明這49 個(gè)差異蛋白質(zhì)主要參與免疫及炎癥調(diào)控等過程，大多分布于細(xì)胞質(zhì)中，多具有結(jié)合及催化活性。KEGG 分析表明差異蛋白質(zhì)主要涉及18 條信號(hào)通路，其中與RA 顯著相關(guān)的為Apelin 信號(hào)通路以及TGF-β信號(hào)通路，提示芍甘附子湯可通過多種途徑發(fā)揮治療RA 的作用。

表9 差異蛋白質(zhì)的主要KEGG 信號(hào)通路分析Tab 9 Analysis of the main KEGG signaling pathways of differential proteins

RA 作為一種免疫性疾病，多種免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的參與促進(jìn)了其發(fā)生發(fā)展。而IL1RAP在RA 的發(fā)病過程中也發(fā)揮了重要作用。IL1RAP具有白細(xì)胞介素-1（IL-1）受體活性及白細(xì)胞介素-13（IL-13）受體活性，能夠加速IL-1、IL-13等促炎因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，還可激活I(lǐng)L-1β、NF-κB 和MAPK 信號(hào)通路[12-13]，促進(jìn)疾病的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組與正常組相比，IL1RAP 表達(dá)上調(diào)，而芍甘附子湯組IL1RAP 表達(dá)下調(diào)，提示芍甘附子湯可能通過下調(diào)IL1RAP表達(dá)，調(diào)節(jié)相應(yīng)炎性細(xì)胞因子水平，緩解CIA 大鼠的關(guān)節(jié)腫脹情況。但是，芍甘附子湯是直接還是間接降低IL1RAP 的水平從而調(diào)控IL-1β信號(hào)通路，仍需進(jìn)一步研究。

Ctsl 在多種疾病中都有重要作用，可通過調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化改善炎癥情況，還可促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨中基質(zhì)的下調(diào)，從而促進(jìn)疾病的發(fā)展[14-15]。多項(xiàng)研究表明Ctsl 與RA 相關(guān)，通過靶向抑制Ctsl的產(chǎn)生可有效降低RA 關(guān)節(jié)軟骨侵蝕[16]，Ctsl 缺失的AIA（antigen-induced arthritis）小鼠較野生型AIA 小鼠關(guān)節(jié)腫脹顯著好轉(zhuǎn)[17]。本研究中，芍甘附子湯干預(yù)組Ctsl 表達(dá)下調(diào)，提示芍甘附子湯可能通過抑制Ctsl 的產(chǎn)生而改善RA 的病變。

ABHD5 具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性，可催化溶血磷脂酸（LPA）轉(zhuǎn)化為磷脂酸（PA）[18]。LPA 不僅參與脂質(zhì)代謝，還是一種重要的脂質(zhì)信號(hào)分子，參與細(xì)胞分化、凋亡等過程。在RA 患者中，LPA 還可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，加重炎癥反應(yīng)，促進(jìn)RA 的發(fā)展。研究表明，RA 患者滑液中LPA 含量明顯升高。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)顯示，LPA 可通過與G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，介導(dǎo)p38/ERK-MAPK信號(hào)通路，參與RA 的發(fā)生發(fā)展[19-20]。本研究表明，芍甘附子湯可能通過上調(diào)ABHD5，增加LPA向PA 的轉(zhuǎn)化過程，進(jìn)而下調(diào)LPA 的含量，緩解CIA 大鼠炎癥反應(yīng)。

Apelin 信號(hào)通路與RA 相關(guān)，該通路中核呼吸因子（nuclear respiratory factor 1，Nrfl）的上游因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α）為線粒體生物發(fā)生的關(guān)鍵因子。尚未有研究表明線粒體生物發(fā)生與RA的關(guān)系，但線粒體生物發(fā)生受到抑制會(huì)增加骨關(guān)節(jié)炎的代謝紊亂和炎癥，而促進(jìn)線粒體生物發(fā)生可以治療關(guān)節(jié)疾病[21-22]。也有研究表明，白藜蘆醇可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控減少炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，并推測(cè)Nrf1 和GA 結(jié)合蛋白α亞基（GABPA）作為下調(diào)基因與白藜蘆醇減輕炎癥有關(guān)。因此，需要進(jìn)一步研究芍甘附子湯干預(yù)RA 作用與抑制Apelin 信號(hào)通路及下調(diào)Nrf1 表達(dá)的關(guān)系。

研究表明，RA 發(fā)作期間TGF-β信號(hào)通路被激活，TGF-β1、Smad2 和Smad3 的表達(dá)增加，抑制TGF-β信號(hào)通路可降低白細(xì)胞介素-6（IL-6）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平達(dá)到治療RA 的目的[23]。E2F 轉(zhuǎn)錄因子4（E2f4）為Smad2 和Smad3的下游因子。本研究顯示，經(jīng)芍甘附子湯干預(yù)后，E2f4 的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，其具體原因有待進(jìn)一步分析。

綜上，芍甘附子湯干預(yù)后，CIA 大鼠共有49個(gè)蛋白表達(dá)出現(xiàn)顯著變化，其治療RA 作用可能主要與下調(diào)IL1RAP、Ctsl，上調(diào)Abhd5 的表達(dá)有關(guān)，但尚需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證實(shí)。