中藥爵床抗血小板聚集的活性物質(zhì)及作用機制研究

陳鵬宇，姚云峰，張瑩，柯辛格，余兵，吳和珍，3，楊艷芳，3，肖學成（1.湖北中醫(yī)藥大學藥學院，武漢 430065；2.中藥資源與中藥化學湖北省重點實驗室，武漢 430061；3.老年病中藥新產(chǎn)品湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430061）

血栓形成是由于血管或心臟內(nèi)流動的血液變?yōu)楣虘B(tài)。血栓會導致血流阻塞，引發(fā)心肌梗死或者中風等血栓性疾病，對人們的健康產(chǎn)生嚴重危害[1]；血小板是一種無核細胞，來自于骨髓巨核細胞，它的黏附、聚集、釋放對于血管內(nèi)血栓的形成具有重要作用。影響血小板的黏附、聚集等過程也是抗血栓藥物研發(fā)的主流靶點[2-4]。阿司匹林、氯吡格雷等化學藥物具有抗血小板聚集的作用，是目前臨床上常用的血小板聚集抑制劑，其被廣泛運用于治療血栓性疾病[5]。但這些藥物往往存在著作用機制單一、不良反應較大的缺點，難以被需要長期服藥的患者所接受。故篩選安全有效的新的抗血小板聚集藥物有著十分重要的意義。整合素β3主要在血小板中表達，是抗血小板治療的首要靶點。根據(jù)課題組前期實驗，初步確定爵床提取物抗血小板聚集的可能靶蛋白為整合素β3。

中藥是新藥研發(fā)的寶庫，其安全性和有效性在幾千年的藥用歷史中得到了檢驗?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》最早收錄了爵床，記載其味辛苦咸，性寒，入肝、肺、膀胱經(jīng)，主治清熱解毒、利尿消腫、截瘧[6]。爵床中主要含有黃酮、生物堿、木脂素以及三萜類等成分，根據(jù)現(xiàn)代藥理學研究，爵床具有鎮(zhèn)痛、抑菌、抗炎以及抗腫瘤的作用[7-9]。課題組前期研究證實，爵床中的活性物質(zhì)可以抑制血小板聚集，但具體的藥效物質(zhì)基礎、作用機制還不完全清楚[10]。本文通過大孔吸附樹脂法、制備性液相色譜法等分離純化爵床中的活性成分，得到單體成分；構建動物模型來篩選活性物質(zhì)，通過體外血小板實驗和體內(nèi)實驗驗證其藥效，并初步探索抗血小板聚集的作用機制，為爵床進一步研究提供理論基礎和實驗數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

爵床藥材采于湖北宜昌，由湖北中醫(yī)藥大學藥學院的吳和珍教授鑒定為爵床科植物爵床[Rostellularia procumbens（Lin.）Nees]的干燥全草。

D101 大孔吸附樹脂（M0041）、角叉菜膠（C8830）（Solarbio 公 司）；LDH 試劑盒（批 號：A019-2-2，南京建成生物醫(yī)藥有限公司）；凝血酶（Thrombin，THR，規(guī)格：100 units，批號：T6884）、膠原（Collagen，COL，規(guī)格：25 mg，批號：C7661）及二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP，規(guī)格：100 mg，批號：A2754）（美國Sigma公司）；阿司匹林腸溶片（Aspirin，ASP，規(guī)格：100 mg/片，批號：J20171021，拜耳醫(yī)藥）；復方丹參片（規(guī)格：0.32 g/片，批號：Z41021966，仲景宛西制藥）；羅丹明鬼筆環(huán)肽300T（批號：CA1610，上海YEASEN 公司）；RIPA 裂解液（批號：P0013B，碧云天）；Integrinβ3抗體（批號：13166）、GAPDH 抗體（批號：5174）和二抗（批號：7074）（美國Cell Signaling Technology 公司）。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（安捷倫1200）、Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱、Eclipse XDB-C18（9.4 mm×250 mm，5 μm）色譜柱（美國Agilent 公司）；LX51-F22FL/PH 熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；LBY-NJ4 血小板聚集儀（北京泰利康信科技公司）；電泳儀EPS600、微型垂直電泳槽VE180（上海天能科技有限公司）；化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)Fluor Chem FC3（美國ProteinSimple 公司）。

1.3 實驗動物

SPF 級雄性KM 小鼠60 只，體質(zhì)量 18 ～20 g[許可證號：SCXK（鄂）2017-0012]、普通級新西蘭雄兔2 只，體質(zhì)量 2 ～2.5 kg [許可證號：SCXK（鄂）2016-0011，湖北省疾病預防控制中心]；SPF級雄性SD 大鼠72 只，體質(zhì)量190 ～230 g [許可證號：SCXK（鄂）2017-0012，三峽大學實驗動物中心]。提供充足的水和飼料，環(huán)境溫度保持在20 ～22℃，相對濕度30%～50%，每日控制照明12 h，適應性喂養(yǎng)7 d 后開始試驗。

2 方法

2.1 篩選爵床抗血小板聚集活性部位

2.1.1 爵床活性部位的分離 取25 kg 爵床藥材，粉碎，過2 號篩（24 目），按料液比1∶10（g/mL）加入80%乙醇滲漉提取后將滲漉液合并，溶劑減壓回收至無醇味，即得總提取液。以D101大孔吸附樹脂上樣總提取液，以30%～90%乙醇梯度洗脫，得到A 組322.4 g（30%乙醇洗脫流分）、B 組107.4 g（45%乙醇洗脫流分）以及C 組160.8 g（90%乙醇洗脫流分）。將各組的洗脫液減壓濃縮至近干。將適量的無水乙醇加入C 組浸膏中并超聲15 min 溶解，抽濾。重復數(shù)次以除去色素，將沉淀（RPE）樣品記為C1組（21.0 g），濾液記為C2組（126.6 g）。

2.1.2 爵床活性部位的篩選 將KM 雄性小鼠隨機分成溶劑組、模型組、A 組、B 組、RPE 組、C2組，每組小鼠10 只。每日用0.5%CMC-Na 溶液給溶劑組和模型組小鼠灌胃，不同質(zhì)量濃度的藥液給A 組、B 組、C1組、C2組小鼠灌胃，藥物以0.5%的CMC-Na 溶液制成混懸液。具體給藥劑量由前期的急性毒性實驗、預實驗結果以及各組分的含量確定。A 組、B 組、C1組和C2組的藥物質(zhì)量濃度分別是16.1、5.4、1.1、6.3 mg·mL－1，分別相當于生藥量1.25、1.26、1.3、1.24 g·mL－1。每日灌胃一次并持續(xù)7 d。最后一次給藥前12 h禁食，自由飲水，給藥1 h 后腹腔注射0.2%的角叉菜膠溶液將給藥組與模型組小鼠造模，溶劑組腹腔注射等量生理鹽水。室溫控制為20℃。A 組、B 組、C1組、C2組小鼠給藥的體積為0.2 mL/10 g，腹腔注射角叉菜膠溶液的體積為0.1 mL/10 g。造模12 h 后根據(jù)小鼠黑尾程度計算黑尾率，黑尾率（%）＝小鼠黑尾部分長度/小鼠尾全長×100%

2.1.3 爵床活性部位的成分檢測 稱取RPE 50 mg 置于10 mL 量瓶中，以一定量的乙腈超聲30 min 使之溶解，冷卻后用乙腈定容，充分搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液進樣檢測。

液相分析采用Eclipse XDB-C18色譜柱；以水（A）-乙腈（B）作為流動相，梯度洗脫（0 ～8 min，45%B；8 ～12 min，45%～65%B；12 ～20 min，65%B；20 ～25 min，65%～45%B）；流速0.6 mL·min－1；柱溫30℃；紫外檢測波長256 nm；進樣量10 μL。

2.1.4 爵床活性部位化學成分的分離純化 用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱進一步從 RPE 中制備單體化合物。乙腈溶解RPE 樣品，流動相為50%乙腈，等度洗脫，柱溫30℃，流速4 mL·min－1，紫外檢測波長 256 nm。將5 個色譜峰的溶液對應收集后，濃縮并回收溶劑，干燥。

2.2 體外的爵床活性物質(zhì)抗血小板聚集實驗

2.2.1 爵床活性物質(zhì)的細胞毒性實驗 取新西蘭兔耳緣靜脈處血，收集到含3.8%枸櫞酸鈉的真空采血管中，得抗凝血液。將其在1800 g 下離心10 min 后取上清液，為富血小板血漿（PRP）。下層液體用1800 g 離心18 min 后取上清液制備貧血小板血漿（PPP），將PRP 調(diào)整為3.5×108個·mL－1，與空白溶劑、PRE 溶液（0.25 ～4.00 mg·mL－1）、爵床脂定B（JDB）溶液（0.05 ～0.80 mg·mL－1）、金不換甲醚（CME）溶液（0.06 ～0.96 mg·mL－1）分別在37℃下孵育10 min，然后500 g 離心10 min 后，取上清液，試劑盒檢測各組LDH 含量。同時直接將PRP 離心，取上清液測血小板的總LDH 含 量。計算LDH 釋放率，LDH 釋放率（%）＝待測樣品LDH 含量/總LDH 含量×100%

2.2.2 血小板黏附實驗 將圓形蓋玻片清洗干凈后放至24 孔板中，每孔加入200 μL 的COL（5 μg·mL－1）或1% BSA 溶液對照，4℃過夜后吸出包被液，加入200 μL 的1% BSA 溶液，封閉60 min 后棄去液體，用1×PBS 液清洗3 次，每孔加入200 μL“2.2.1”項下制備好的PRP，各濃度的藥液以及空白溶劑同樣分別加200 μL 復方丹參片（55.0 mg·mL－1）、ASP（2.0 mg·mL－1）、JDB（0.20 mg·mL－1）、CME（0.24 mg·mL－1）、RPE-L（低濃度，0.25 mg·mL－1）、RPE-M（中濃度，0.50 mg·mL－1）、RPE-H（高濃度，1.0 mg·mL－1）溶液，37℃孵育90 min，之后吸棄培養(yǎng)液并漂洗3 次，用4%的多聚甲醛溶液固定20 min，棄去液體并漂洗3 次，以羅丹明鬼筆環(huán)肽250 μL 避光染色30 min 后吸棄染色劑。用熒光顯微鏡在暗室觀察，熒光染色百分比通過Image pro plus 6.0 軟件計算。單體化合物JDB 和CME 的給藥濃度計算由兩者在RPE 中的含量換算而來。

2.2.3 體外抗血小板聚集率的測定 待血小板聚集儀測試孔中的溫度達37℃，將PPP 和PRP置入測量杯中，以PPP 為對照，透光率調(diào)節(jié)為100%，然后取下PPP，將PRP 放入，向PRP 加入空白溶劑或各溶度的藥物（濃度與“2.2.2”項下一致），反應5 min，透光率調(diào)節(jié)為0%，加入ADP、THR、COL 3 種不同的誘導劑使其與血小板結合，進而使血小板聚集，濁度下降，透光率上升，即可測得血小板聚集率。讀取300 s 內(nèi)的血小板最大聚集率。

2.3 體內(nèi)的爵床活性物質(zhì)抗血小板聚集實驗

2.3.1 大鼠尾血栓模型實驗 實驗分為9 組，模型組和溶劑組灌胃0.5%的CMC-Na 溶液，ASP（2.0 mg·mL－1）、復方丹參片（570 mg·kg－1）、JDB（4.2 mg·kg－1）、CME（5.1 mg·kg－1）、RPE-L（低劑量，5.0 mg·kg－1）、RPE-M（中劑量，10.0 mg·kg－1）、RPE-H（高劑量，20.0 mg·kg－1）組以對應濃度藥液灌胃，不間斷灌胃7 d，每日一次，最后一次給藥前12 h 停止喂食，自由飲水，并且于給藥后1 h 造模。溶劑組腹腔注射等量的生理鹽水，模型組和各濃度給藥組每只以0.5 mL/100 g 的0.4%角叉菜膠溶液腹腔注射造模。造模12 h 后觀察各組大鼠尾部的血栓情況，計算黑尾率；以7%水合氯醛將大鼠麻醉后，通過腹主動脈取血8 mL，取其中6 mL 與抗凝劑混勻后離心，剩余2 mL 不加抗凝劑，待凝固后離心，取上層液即為血清。并計算肝系數(shù)，肝系數(shù)（%）＝大鼠肝質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%

2.3.2 體內(nèi)給藥抑制血小板聚集率實驗 將“2.3.1”項下得到的抗凝血用“2.2.1”項下方法得到PRP 和PPP，按“2.2.3”項下方法檢測血小板聚集率。

2.4 Western blot 實驗

將PRP 低速離心，獲得血小板沉淀物?？偟鞍滋崛〔捎肦IPA 裂解緩沖液。樣品用SDSPAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)至NC 膜上，將NC 膜與一抗在4 ℃下孵育過夜，然后用TBST 洗膜3 次，每次10 min。洗滌后，用HRP 抗偶聯(lián)二抗孵育1 h。以相同的方式清洗膜。用FluorChem FC3 系統(tǒng)進行顯影。

2.5 統(tǒng)計學分析

用SPSS 19.0 軟件分析，統(tǒng)計結果使用單因素方差分析，并以均值±標準差表示。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 爵床活性部位篩選情況

如圖1，溶劑組黑尾率為0，且小鼠尾部未形成血栓，模型組和給藥組都有血栓形成。與模型組相比，給藥各組黑尾率都顯著下降（P＜0.05），且C1組黑尾率最低，說明C1組的抗血小板聚集作用最強，因此將C1組作為活性部位（即RPE），進行后續(xù)研究。

3.2 活性部位成分分析結果

通過HPLC 檢測，并與對照品色譜峰對比，最終確定RPE 中的5 個潛在活性成分分別為6'-羥基爵床脂定B（6'-OH-JDB，1，純度：97.23%）、爵床脂定B（JDB，2，純度：96.50%）、金不換甲醚（CME，3，純度：98.18%）、新爵床脂定B（NJDB，4，純度：96.08%）和新爵床脂定A（NJDA，5，純度：95.45%）。圖2為HPLC 色譜圖，圖3 為化合物對應的結構式。

3.3 爵床活性物質(zhì)對細胞毒性研究

根據(jù)LDH 釋放率可知，血小板經(jīng)過不同濃度的PRE 處理后，各濃度PRE 的LDH 釋放率與溶劑組相比無明顯差異（P＞0.05），不同濃度的JDB 組和CME 組與溶劑組相比無明顯差異（P＞0.05），證明RPE、JDB 和CME 對血小板幾乎無毒性，其抗血小板活性可能不是由于對血小板的毒性引起的（見圖4）。

3.4 爵床活性物質(zhì)的抗血小板黏附作用

由圖5 可知，溶劑組幾乎無血小板黏附，而模型組有大量的血小板黏附；與模型組相比，給藥組的血小板黏附量減少（P＜0.05，P＜0.01），且RPE 的高劑量組以及復方丹參組、ASP 組的血小板黏附量最少，抗黏附作用最強，而RPE 低、中劑量組，JDB 組及CME 組抗黏附作用較ASP組弱，RPE 低劑量組作用最弱。

3.5 爵床活性物質(zhì)體外抗血小板聚集的作用

誘導劑為凝血酶的情況下，與溶劑組比較，各給藥組血小板聚集率（除RPE 低劑量組和CME組）都有所下降（P＜0.05，P＜0.01），而RPE高劑量組和ASP 組的血小板聚集率最低，對血小板聚集的抑制作用最強；誘導劑為ADP 時，與溶劑組比較，各給藥組均能顯著降低血小板聚集率（P＜0.05，P＜0.01），且RPE 高劑量組對血小板聚集率降低效果最明顯；誘導劑為COL 時，與溶劑組比較，各給藥組（除RPE 低劑量組）血小板集率都有所下降（P＜0.05，P＜0.01），且RPE高劑量組與復方丹參組、ASP 組的血小板聚集率更低，而CME 抗血小板聚集的作用較弱（見圖6）。

3.6 爵床活性物質(zhì)對大鼠尾血栓模型的保護作用

圖1 各組小鼠尾血栓（a）和黑尾率（b）比較Fig 1 Tail thrombus（a）and black tail rate（b）of mice in each group of mice

圖2 RPE 的HPLC 色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of RPE

圖3 化合物1 ～5 的結構式Fig 3 Chemical structure for compound 1 ～5

圖4 不同濃度的RPE（a）、JDB（b）及CME（c）的LDH 釋放率Fig 4 LDH release rate of RPE（a），JDB（b）and CME（c）at different concentrations

圖5 各給藥組對血小板黏附的作用（A）及熒光染色情況（B）Fig 5 Effect of each administration group on platelet adhesion（A）and fluorescence staining（B）

溶劑組大鼠在造模12 h 后尾部沒有形成血栓，而模型組和給藥組的大鼠尾部均有血栓形成。與模型組相比，給藥組大鼠的黑尾率均有所下降（P＜0.05，P＜0.01）。同時發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的肝臟腫脹、肝臟系數(shù)增高。而給藥組的大鼠肝臟系數(shù)與模型組對比均顯著降低（P＜0.05），說明所給藥物能夠減輕肝臟腫脹，降低炎癥反應，如圖7所示。

圖6 不同誘導劑對血小板聚集率的作用Fig 6 Effect of different inducer on platelet aggregation rate

圖7 藥物對大鼠黑尾率（a）和肝系數(shù)（b）的影響Fig 7 Effect of drug on rat black-tail rate（a）and liver coefficient（b）

3.7 爵床活性物質(zhì)對ADP、COL、THR 誘導的體內(nèi)血小板聚集的作用

與溶劑組相比，模型組的血小板聚集率顯著提高（P＜0.01）；當誘導劑是THR 和COL時，與模型組對比，RPE 高劑量組、復方丹參組、ASP 組、JDB 組血小板聚集率顯著降低（P＜0.05），說高劑量 的RPE，以 及ASP 和JDB 具有抗凝血酶、抗膠原誘導的血小板聚集的作用；而誘導劑是ADP 時，RPE 低劑量組與模型組對比無顯著性差異（P＞0.05），其他各給藥組對血小板聚集率均有降低作用（P＜0.05），結果見圖8。

圖8 不同誘導劑對大鼠血小板聚集率的作用Fig 8 Effect of different inducer in each administration group on platelet aggregation rate in rats

圖9 大鼠血小板中β3 蛋白的表達情況Fig 9 Expression of beta 3 protein in rat platelets

3.8 爵床活性物質(zhì)對角叉菜膠誘導的大鼠體內(nèi)β3蛋白的影響

如圖9 所示，與溶劑組比較，模型組尾血栓大鼠的血小板中β3蛋白表達量顯著增高（P＜0.01）；與模型組對比；ASP 組，RPE 高、中、低劑量組均能顯著下調(diào)β3蛋白的表達（P＜0.05，P＜0.01），而JDB 組 和CME 組 對β3蛋白的影響不明顯。

4 討論

在止血過程中血小板有很重要的作用，但血小板在異常時會形成血栓，進而誘發(fā)炎癥以及動脈粥樣硬化等病情[11-14]。相關研究認為針對血小板異常的靶向治療有助于緩解血管疾病，但當前抗血小板藥物對患者療效有限，且具有一定毒副作用[15]，例如長期使用阿司匹林會導致胃出血，因此有必要研究更加安全有效的抗血小板藥物[16]。

小鼠尾血栓實驗結果表明中C1組分（RPE）具有較好的抗尾血栓活性。通過HPLC 分析發(fā)現(xiàn)其由5 種木脂素類化合物組成，分別是CME、6'-OH-JDB、NJDB、JDB 和NJDA[17-19]；通過制備液相色譜法，獲得這5 種單體成分。JDB 和CME在活性部位中含量最高，是抗血小板聚集的主要活性物質(zhì)，因此選擇這兩種化合物和RPE 進行后續(xù)研究[20-21]。

藥物的毒性考察結果表明，LDH 釋放率均在3%以下，表明爵床活性物質(zhì)對血小板沒有明顯的細胞毒性。

體外實驗中，采用比濁法研究了爵床活性物質(zhì)對APP、THR 和COL 3 種誘導劑誘導的兔血小板聚集的抑制作用。發(fā)現(xiàn)爵床中的活性物質(zhì)能有效抑制血小板聚集。體內(nèi)實驗中，采用角叉菜膠大鼠尾血栓模型，同樣用上述3 種誘導劑誘導大鼠的血小板聚集，研究體內(nèi)條件下藥物對血小板聚集的影響。結果顯示爵床活性物質(zhì)表現(xiàn)出很好的體內(nèi)抗血小板聚集作用。

誘導劑激活血小板后，會促使膜蛋白整合素αⅡbβ3活化，與纖維蛋白結合，形成血小板聚集。整合素αⅡbβ3由兩個Ⅰ型跨膜糖蛋白αⅡb和β3通過二硫鍵連接而成。而血小板表面整合素β3作為主要受體影響血小板聚集并促進血栓形成[22]。實驗結果證實了爵床活性物質(zhì)可以下調(diào)尾血栓大鼠體內(nèi)的β3蛋白的表達，表明其抗血小板聚集的作用機制與下調(diào)整合素β3有關。

綜上所述，本實驗首次在體內(nèi)外兩個層面闡釋了爵床活性物質(zhì)RPE、JDB、CME 的抗血小板藥效，并初步研究了爵床抗血小板機制與降低整合素β3的表達有關，為進一步深入探討爵床抗血小板聚集作用機制提供了理論支撐，為爵床資源的開發(fā)提供幫助。