基于血小板衍生生長因子信號通路的伏力諾他抗肝纖維化作用機制研究

黎權方，李龍寬，顧軍榮，趙月涵，陳應強（.貴州醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，貴陽 550004；.貴州醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院藥學科，貴州 都勻 558000；3.貴州醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院感染科，貴州 都勻 558000）

肝纖維化（liver fibrosis，LF）是慢性肝病發(fā)生發(fā)展過程中肝內細胞外基質（extracellular matrix，ECM）合成增加、降解相對不足引起異常沉積所發(fā)生的一種病理改變[1]。肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)是肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）的激活[2]。多種細胞因子可促進肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，其中血小板衍生生長因子（PDGF）是一種關鍵的促HSC 激活和遷移的纖維化細胞因子，介導肝纖維化的進程。隨著組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑廣泛應用于器官纖維化及癌癥的治療[3-4]，肝纖維化的組蛋白修飾也成為了當前研究的熱點。研究發(fā)現HDAC 抑制劑可延緩肺纖維化的發(fā)生及發(fā)展，調控肌纖維細胞活化、增殖和ECM 蛋白的生成，通過染色質重塑等減輕腎臟纖維化的發(fā)生[5-7]。伏立諾他（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA），是一種廣譜HDAC 抑制劑，本實驗擬通過觀察伏立諾他對PDGF 刺激的HSC-T6 的增殖、遷移及細胞周期相關基因、蛋白和COLⅠ的影響，考察其抗肝纖維化作用。

1 材料

1.1 細胞

大鼠肝星狀細胞HSC-T6 [Merck（中國），貨號：SCC069]。

1.2 試藥

DMEM/高糖培養(yǎng)基及胎牛血清（FBS）（美國Gibco 公司）；PDGF-BB（日本Takara 公司）；伏立諾他（貨號：SML0061，規(guī)格：5 mg，白色粉末，分子量：264.32，Sigma 公司）；胰蛋白酶、RIPA緩沖液（美國Sigma 公司）；CCK-8 試劑盒（日本Dojindo 公司）；甲醇（國家標準溶液定制中心）；Trizol（日本Takara 公司）；Bestar RT-qPCR kit 及Bestar RT-qPCR MasterMix（DBI 公司）；一抗稀釋液、二抗稀釋液、SDS-PAGE、PVDF 膜（美國Millipore 公司）；COLⅠ抗體、CyclinD1、CyclinE1 抗體（美國Abcam 公司）；GAPDH 抗體（美國 Santa Cruz Biotechnology 公司）。

1.3 儀器

離心機（廣州吉帝儀器有限公司）；－80 ℃超低溫冰箱（海信容聲冰箱有限公司）；化學發(fā)光成像系統(tǒng)、電泳槽（美國BIO-RAD）；酶標儀（華泰和合商貿有限公司）；恒溫振蕩器（日本Asone）；電泳儀（六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 實驗分組

取對數生長期的HSC-T6 分為3 組：空白對照組（不做任何處理）、模型組（加入10 ng·mL－1PDGF-BB）[8]、伏立諾他組（先以10 ng·mL－1PDGF-BB 刺激30 min，再加入100 nmol·L－1伏立諾他作用72 h[9]）。

2.2 CCK-8 法檢測細胞增殖能力

將“2.1”項下不同組HSC-T6 接種于96 孔板中培養(yǎng)過夜。在24、48 和72 h 在酶孔中加入10 μL CCK-8 溶液10 min 后，在450 nm 測定吸光度。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡能力

收集經“2.1”項下方法處理后的HSC-T6，加入80%的冷乙醇。洗滌后，用50 μL·mL－1PI在4 ℃暗光下染色過夜。用流式細胞儀檢測處理后的HSC-T6 的細胞周期。

2.4 Western blot 法檢測蛋白表達水平

收集經“2.1”項下方法處理后的細胞，加入RIPA 緩沖液分離總蛋白，并轉移至聚偏氟乙烯膜上。用含5%脫脂牛奶封閉后，把膜與相應的一抗4 ℃ 溫育過夜。最后與二抗在室溫下孵育1 h，用增強化學發(fā)光法顯影蛋白質。以GAPDH 作為內參蛋白對各蛋白進行定量，蛋白表達水平以各組COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的灰度值除以對應的內參蛋白灰度值表示。

2.5 RT-qPCR 檢測基因表達量

將對數生長期的HST-6 細胞接種于75 mL 培養(yǎng)瓶中，細胞生長至90%融合度時，加入PDGF-BB誘導30 min，加入含有伏立諾他100 nmol·L－1的DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用Trizol 提取總RNA，用Bestar RT-qPCR 試劑盒合成cDNA，最后用Bestar RT-qPCR Master Mix 測定基因表達，用2－△△Ct法確定基因的相對表達量。

2.6 數據處理

所有數據用 SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行分析，以均數±標準差（±s）表示，采用重復檢測方差分析、單因素方差分析或t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 伏立諾他對PDGF-BB 誘導的HSC-T6 增殖作用的影響

與空白對照組相比，加入PDGF-BB 對HSC-T6 的增殖有明顯刺激作用；與模型組比較，伏立諾他能抑制PDGF-BB 刺激的HSC-T6 增殖，結果見表1。

表1 伏立諾他對PDGF-BB 刺激的HSC-T6增殖的影響(±s，n＝3)Tab 1 Effect of vorinostat on HSC-T6 proliferation stimulated by PDGF-BB (±s，n ＝3)

表1 伏立諾他對PDGF-BB 刺激的HSC-T6增殖的影響(±s，n＝3)Tab 1 Effect of vorinostat on HSC-T6 proliferation stimulated by PDGF-BB (±s，n ＝3)

注：與空白對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。Note：Compared with the blank control group，aP ＜0.05；compared with the model group，bP ＜0.05.

組別 光密度值24 h 48 h 72 h空白對照組 0.432±0.054 0.555±0.168 0.817±0.365模型組 0.508±0.136 a 0.821±0.277 a 1.311±0.156 a伏立諾他組 0.423±0.182 b 0.601±0.136 b 0.792±0.207 b

3.2 流式細胞儀的檢測結果

PDGF-BB 的激活顯著降低了G0/G1期HSC-T6，增加了S 期HSC-T6，而伏立諾他治療可以顯著逆轉G0/G1期和S 期HSC-T6 數量的變化，提示伏立諾他通過調節(jié)細胞周期來抑制PDGF-BB 誘導的HSC-T6的增殖（見圖1）。

圖1 各組HSC-T6 細胞中細胞凋亡的情況Fig 1 Apoptosis of HSC-T6 cells in each group

3.3 Western blot 結果

與空白對照組相比，模型組中COLⅠ、CyclinD1和CyclinE1 的蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；伏立諾他干預后，COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的蛋白表達明顯降低（P＜0.05）（見表2 及圖2）。提示伏立諾他能顯著下調PDGF-BB 激活的HSC-T6 細胞中COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的表達。

表2 HSC-T6 細胞中COLⅠ，CyclinD1 和CyclinE1 的蛋白相對灰度值(±s，n ＝3)Tab 2 Relative gray value of COLⅠ，CyclinD1 and CyclinE1 in HSC-T6 cells (±s，n ＝3)

表2 HSC-T6 細胞中COLⅠ，CyclinD1 和CyclinE1 的蛋白相對灰度值(±s，n ＝3)Tab 2 Relative gray value of COLⅠ，CyclinD1 and CyclinE1 in HSC-T6 cells (±s，n ＝3)

注：與空白對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。Note：Compared with the blank control group，aP ＜0.05；compared with the model group，bP ＜0.05.

組別 相對灰度值COLⅠ CyclinD1 CyclinE1空白對照組 0.2980±0.0022 0.1961±0.0050 0.2154±0.0196模型組 0.7323±0.0264a 0.7433±0.1003a 0.5386±0.1940a伏立諾他組 0.5700±0.2053b 0.4972±0.1746b 0.3861±0.2132b

圖2 HSC-T6 細胞中COLⅠ，CyclinD1 和CyclinE1 的蛋白表達情況Fig 2 Expression of COLⅠ，CyclinD1 and CyclinE1 in HSC-T6 cells

3.4 RT-qPCR 結果

所有引物的序列如表3 所示。與空白對照組相比，模型組中COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1的表達明顯升高（P＜0.05）；加入伏立諾他后，COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的表達明顯降低（P＜0.05）（見表3 及圖3），提示伏立諾他可以抑制PDGF-BB 誘導的HSC-T6 表 達COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1。

圖3 HSC-T6 細胞中COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的mRNA 的表達情況Fig 3 Expression of COLⅠ，CyclinD1 and CyclinE1 mRNA in HSC-T6 cells

4 討論

肝纖維化的主要特征是長期慢性肝臟損傷，導致靜息狀態(tài)下HSC 的活化并轉變成肌成纖維樣細胞，獲得增殖并表達PDGF 等相關細胞因子的能力，使大量ECM 過度沉積。HSC 的活化受多種因素影響，其中PDGF 被認為是最強的促有絲分裂因子[10-11]。PDGF 可以與HSC 表面的PDGF 受體結合，促進HSC 的活化、增殖，介導肝纖維化的發(fā)生[12]。細胞增殖是通過細胞周期實現的，細胞在生長因子的刺激下，G1期CyclinD表達增多，CyclinE 可促進細胞通過G1/S 期的限制點進入S 期[13]。ECM 的合成主要以Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原為主，其中Ⅰ型膠原約占60%，因此Ⅰ型膠原的表達水平可視為判斷ECM 合成的重要指標[12]。所以，抑制HSC 的活化、增殖，促進凋亡，抑制過多的ECM 沉積成為肝纖維化防治的重要思路。組蛋白乙酰化與肝纖維化的發(fā)生關系密切，組蛋白乙?；瘏⑴c在轉錄后HSCs 的活化、增殖和凋亡的調控。盡管目前已開發(fā)出大量HDAC 抑制劑，但還沒有有效的藥物治療人類肝纖維化。本課題以激活型的HSC-T6 為研究對象，PDGF 作為誘導因子，觀察伏立諾他抑制HSC-T6 的作用，發(fā)現伏立諾他可顯著逆轉G0/G1期和S 期HSC-T6 數量的變化，提示伏立諾他可通過調節(jié)細胞周期來抑制PDGF-BB 誘導的HSC-T6 的增殖，促進HSC-T6 的凋亡，抑制HSC-T6 細胞中COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的蛋白及mRNA 的表達。這為伏立諾他臨床抗肝纖維化的研究提供實驗基礎。

表3 COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的引物序列Tab 3 Primer sequences of COLⅠ，CyclinD1 and CyclinE1