大戟脂藥材中四環(huán)三萜類成分大戟二烯醇、大戟醇的含量測定及提取工藝優(yōu)化

劉婧 李晨陽 趙軍 顧政一

摘 要 目的：建立同時測定大戟脂藥材中大戟二烯醇和大戟醇含量的方法，并優(yōu)化其提取工藝。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8，流動相為乙腈-水（90 ∶ 10，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。以大戟二烯醇、大戟醇含量、出膏率為評價指標(biāo)進(jìn)行綜合評分，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、溶劑用量為考察因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝并進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：大戟二烯醇、大戟醇檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.030 4～1.216 mg/mL（r=0.999 6）、0.01～0.4 mg/mL（r=0.999 9）;精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2%，平均加樣回收率分別為100.46%（RSD=1.03%，n=6）、99.36%（RSD=0.91%，n=6）。最優(yōu)提取工藝為40 mL的95%乙醇回流提取1 h。經(jīng)3次試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果顯示，大戟二烯醇的平均含量為94.43 mg/g（RSD=0.92%，n=3），大戟醇的平均含量為25.42 mg/g（RSD=0.98%，n=3），平均出膏率為51.42%，（RSD=1.95%，n=3），平均綜合評分為98.87（RSD=0.92%，n=3）。結(jié)論：所建含量測定方法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于大戟脂的質(zhì)量控制;優(yōu)化所得提取工藝穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞 大戟脂;大戟二烯醇;大戟醇;高效液相色譜法;含量測定;提取工藝優(yōu)化

中圖分類號 R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）06-0708-05

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for the simultaneous determination of euphol and euphorbol in Euphorbium resinifera， and to optimize the extraction technology. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8 column with mobile phase consisted of acetonitrile-water （90 ∶ 10，V/V） at the flow rate of 1.0? mL/min. The detection wavelength was set at 210 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. Using the contents of euphol and euphorbol， yield of the extract as evaluation index， comprehensive score was conducted. The extraction technology was optimized by L9（34） orthogonal tests， with ethanol volume fraction， extraction time and solvent dosage as factors. RESULTS： The linear ranges of euphol and euphorbol were 0.030 4-1.216 mg/mL （r=0.999 6） and 0.01-0.4 mg/mL （r=0.999 9）， respectively. RSDs of precision， stability （24 h） and producibility tests were all lower than 2%. Average recoveries were 100.46% （RSD=1.03%，n=6） and 99.36%（RSD=0.91%，n=6）. The optimized technology was extracting with 40 mL 95% ethanol for 1 h. After 3 times of validation tests showed that average content of euphol was 94.43 mg/g （RSD=0.92%，n=3）， and that of euphorbol was 25.42? ?mg/g（RSD=0.98%，n=3）;average yield of the extract was 51.42% （RSD=1.95%，n=3）， and average comprehensive score was 98.87（RSD=0.92%，n=3）. CONCLUSIONS： Established method is simple， accurate and reproducible， which can be used for the quality control of E. resinifera. The optimized extraction technology is simple and stable.

KEYWORDS? ?Euphorbium resinifera; Euphol; Euphorbol; HPLC; Content determination; Extraction technolohy optimization

大戟脂為大戟科植物多脂大戟Euphorbia resinifera Berg的樹脂狀分泌物，又名火秧力、排日非云，別名艾非爾比云，主要分布于歐洲、非洲北部及中亞地區(qū)[1]。大戟脂在我國新疆等地區(qū)也有分布，是維吾爾族常用藥材，具有強(qiáng)筋健骨、散寒止痛、燥濕退腫、通利腸阻、除白內(nèi)障等功效，常用于臨床治療白癜風(fēng)、癱瘓、面癱、關(guān)節(jié)骨痛等疾病[2]。該藥材在驅(qū)白派甫云片、艾比派爾非云丸、買日合米派爾非云軟膏等維吾爾族復(fù)方制劑中應(yīng)用廣泛。大戟脂中含有豐富的二萜、三萜類化合物，其中以大戟二烯醇和大戟醇為代表的四環(huán)三萜類化合物是其主要特征性活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、降血壓等作用[3-6]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于大戟脂的研究較少，且現(xiàn)有研究多集中在化學(xué)成分分離方面[7-10]。雖然，有學(xué)者采用乙醇回流法和甲醇超聲法提取大戟脂[9-10]，但提取效率不高，且缺乏具體的提取工藝研究，同時亦未見指標(biāo)性成分的定量分析?；诖耍狙芯坎捎酶咝б合嗌V法（HPLC）測定了大戟脂中四環(huán)三萜類成分大戟二烯醇和大戟醇的含量;同時以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、溶劑用量為考察因素，大戟二烯醇、大戟醇含量和出膏率為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化大戟脂的提取工藝，旨在為該藥材及其有效成分的深入研究提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Agilent 1260型全波長HPLC儀[包括真空脫氣機(jī)、四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、OPENLAB CDS 2.1色譜工作站，安捷倫科技（中國）有限公司]、Sartorius BP211型十萬分之一分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]、KW-1000DC型恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司）、DZF-6090型真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、TGL-16M臺式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要試劑有大戟二烯醇對照品（成都普思生物科技股份有限公司，批號PS010984，純度≥98.0%）、大戟醇對照品（新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，批號20200622，純度>98%，經(jīng)核磁共振氫譜和核磁共振碳譜鑒定）等;乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

大戟脂藥材（批號201706001）于2018年8月購自新疆濟(jì)人藥業(yè)有限公司，經(jīng)新疆藥物研究所何江副研究員鑒定為大戟科植物多脂大戟E. resinifera Berg的樹脂狀分泌物。藥材使用前粉碎，過40目篩，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 大戟二烯醇和大戟醇的含量測定

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取大戟二烯醇、大戟醇對照品適量，加甲醇，制成兩者質(zhì)量濃度分別為3.04、1.0 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取大戟脂藥材粉末約0.1 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加95%乙醇40 mL，加熱回流提取3次，每次1 h，濾液用95%乙醇定容至250 mL;精密量取20 mL，蒸干后加甲醇溶解并定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.1.3 空白對照溶液的制備 取甲醇適量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，作為空白對照溶液。

2.1.4 色譜條件 以Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8（150 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-水（90 ∶ 10，V/V）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述混合對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液適量，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，理論板數(shù)按大戟醇峰計(jì)均不低于7 000，分離度均大于1.5，空白對照溶液對測定無干擾，詳見圖1。

2.1.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，分別置于10 mL量瓶，加甲醇定容，即得大戟二烯醇質(zhì)量濃度分別為0.030 4、0.060 8、0.152、0.304、0.608、1.216 mg/mL和大戟醇質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL的線性工作溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以待測成分的質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，大戟二烯醇的回歸方程為Y=13 000.770 3X-398.181 6（r=0.999 6），大戟醇的回歸方程為Y=8 534.192 9X+4.055 6（r=0.999 9），表明大戟二烯醇、大戟醇檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.030 4～1.216、0.01～0.4 mg/mL。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 取“2.1.6”項(xiàng)下大戟二烯醇、大戟醇質(zhì)量濃度分別為0.152、0.05 mg/mL的線性工作溶液適量，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，大戟二烯醇、大戟醇峰面積的RSD分別為0.39%、0.57%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，大戟二烯醇、大戟醇峰面積的RSD分別為0.39%、1.05%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取大戟脂藥材粉末，約0.1 g，共6份，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果，大戟二烯醇、大戟醇的平均含量分別為93.30、24.70 mg/g，RSD分別為1.11%、1.59%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的大戟脂藥材粉末，約0.05 g，共6份，精密稱定，加入混合對照品溶液1.0 mL（按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備大戟二烯醇、大戟醇質(zhì)量濃度分別為4.7、1.3 mg/mL的混合對照品溶液），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.1.11 樣品含量測定 取大戟脂藥材粉末適量，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量，平行操作3次。結(jié)果，大戟二烯醇、大戟醇的平均含量分別為94.03 mg/g（RSD=0.51%，n=3）、25.19 mg/g（RSD=0.89%，n=3）。

2.2 出膏率測定

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液20.0 mL，置于已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，于80 ℃水浴蒸干，再于105 ℃干燥至恒定質(zhì)量后，置于干燥器中，冷卻至室溫，迅速精密稱定所得干膏質(zhì)量，計(jì)算出膏率：出膏率=干膏質(zhì)量×12.5/藥材質(zhì)量×100%[11-12]。

2.3 提取工藝優(yōu)化

2.3.1 因素與水平 本課題組前期單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，提取1次時大戟二烯醇和大戟醇已基本提取完全，故確定提取次數(shù)為1次。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為15%～55%時，綜合評分（以大戟二烯醇、大戟醇含量和出膏率加權(quán)計(jì)算所得，見“2.3.2”項(xiàng)）呈上升趨勢;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%～95%時，綜合評分上升趨于平緩。當(dāng)提取時間為0.5～1.0 h時，綜合評分呈上升趨勢;當(dāng)提取時間>1.0 h后，綜合評分上升趨于平緩。當(dāng)溶劑用量為10～40 mL時，綜合評分呈上升趨勢;當(dāng)溶劑用量為40～50 mL時，綜合評分上升趨于平緩。因此，本研究選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時間（B）、溶劑用量（C）為考察因素，以大戟二烯醇、大戟醇含量和出膏率為指標(biāo)，采用L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化，其因素與水平見表2。

2.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 以大戟二烯醇、大戟醇含量和出膏率為評價指標(biāo)進(jìn)行綜合評分。采用綜合加權(quán)評分法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，設(shè)定滿分為100分，大戟二烯醇、大戟醇含量和出膏率的權(quán)重系數(shù)分別為40%、40%、20%，以各個指標(biāo)成分含量的最大值為參照[13-14]，計(jì)算綜合評分：綜合評分=大戟脂樣品中大戟二烯醇含量/大戟二烯醇含量最大值×40%+大戟脂樣品中大戟醇含量/大戟醇含量最大值×40%+大戟脂樣品中出膏率/出膏率最大值×20%。以大戟二烯醇、大戟醇含量和出膏率為指標(biāo)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，綜合評分方差分析結(jié)果見表4。

2.3.3 最優(yōu)工藝的確定 由表3可知，大戟脂提取工藝的各因素影響大小依次為A>B>C，最優(yōu)方案為A3B2C2。由表4可知，因素A對試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響（P<0.05），而因素B、C對試驗(yàn)結(jié)果無顯著影響（P>0.05）。綜合考慮生產(chǎn)實(shí)際因素，最終確定最優(yōu)提取工藝為A3B2C2，即加入40 mL的95%乙醇回流提取1 h。

2.3.4 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證 稱取大戟脂藥材粉末，約0.1 g，精密稱定，按“2.3.3”項(xiàng)下最優(yōu)提取工藝條件平行操作3次，按“2.1.11”“2.2”項(xiàng)下方法測定大戟二烯醇、大戟醇含量和出膏率，并按“2.3.2”項(xiàng)下方法計(jì)算綜合評分。結(jié)果，大戟二烯醇的平均含量為94.43 mg/g（RSD=0.92%，n=3），大戟醇的平均含量為25.42 mg/g（RSD=0.98%，n=3），平均出膏率為51.42%（RSD=1.95%，n=3），平均綜合評分為98.87（RSD=0.92%，n=3），提示該最優(yōu)工藝穩(wěn)定、可行，詳見表5。

3 討論

在前期研究中，筆者對大戟二烯醇和大戟醇在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種成分均在210 nm波長處有最大吸收，且穩(wěn)定、干擾少，故選擇檢測波長為210 nm。同時，筆者考察了C18和C8反相硅膠色譜柱對大戟二烯醇和大戟醇的分離性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C18反相硅膠色譜柱吸附性較強(qiáng)，目標(biāo)峰前后雜峰較多，且無法實(shí)現(xiàn)基線分離;而使用C8色譜柱，雜峰少且分離效果好，故選擇C8色譜柱。此外，筆者還進(jìn)一步對乙腈-0.1%磷酸水溶液（85 ∶ 15、90 ∶ 10、95 ∶ 5， V/V）、乙腈-0.2%磷酸水溶液（85 ∶ 15、90 ∶ 10、95 ∶ 5，V/V）、乙腈-水（85 ∶ 15、90 ∶ 10、95 ∶ 5，V/V）等不同流動相體系進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-水（90 ∶ 10，V/V）為流動相時的分離效果較好且峰型對稱、出峰時間適宜，故選擇乙腈-水（90 ∶ 10，V/V）為流動相。

在供試品溶液的制備中，筆者根據(jù)文獻(xiàn)[9]方法并綜合考慮安全環(huán)保等因素，最終選擇乙醇作為提取溶劑。隨后，筆者還考察了乙醇浸提、超聲提取和加熱回流提取對大戟二烯醇和大戟醇含量的影響。結(jié)果顯示，加熱回流提取的效果優(yōu)于乙醇浸提和超聲提取，其原因可能為大戟二烯醇等四環(huán)三萜類成分極性較低，高溫回流有利于該類成分的溶出。

本研究經(jīng)正交試驗(yàn)所得的最優(yōu)提取工藝為40 mL的95%乙醇回流提取1 h。經(jīng)驗(yàn)證，大戟二烯醇和大戟醇的平均含量分別為94.43、25.42 mg/g，平均出膏率為51.42%，平均綜合評分為98.87，RSD均小于1%，提示所得最優(yōu)工藝穩(wěn)定、可行，可為大戟脂有效成分的提取及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供參考。在研究過程中筆者發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，出膏率降低，提示大戟脂藥材中水溶性成分多，但現(xiàn)有研究可能多集中在脂溶性部分[7-10]，加之藥效學(xué)研究相對薄弱，因此在后續(xù)試驗(yàn)中可開展對水溶性成分及有效成分的藥效學(xué)研究，以挖掘其潛在的藥用價值。

綜上所述，所建含量測定方法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于大戟脂的質(zhì)量控制;優(yōu)化所得提取工藝穩(wěn)定、可行。

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（收稿日期：2020-10-12 修回日期：2021-01-03）

（編輯：陳 宏）