麻黃細(xì)辛附子湯對腎陽虛外感證模型小鼠TLRs應(yīng)答及Cyt-CO介導(dǎo)的凋亡調(diào)控的影響

邢淑雁 范珊珊 于欽輝 馬青云 孫啟慧 楊勇 容蓉

摘 要 目的：研究麻黃細(xì)辛附子湯對腎陽虛外感證模型小鼠Toll樣受體（TLRs）應(yīng)答及細(xì)胞色素C氧化酶（Cyt-CO）介導(dǎo)的凋亡調(diào)控的影響。方法：將48只雄性Balb/c小鼠隨機分為正常組（n=12）和造模組（n=36）。造模組小鼠采用腹腔注射苯甲酸雌二醇溶液（8 mg/kg）+滴鼻接種甲型H1N1流感病毒（20 μL/只）的方法建立腎陽虛外感復(fù)合模型。然后將造模成功的小鼠隨機分為模型組、陽性藥組（磷酸奧司他韋膠囊，0.195 g/kg）和麻黃細(xì)辛附子湯組（1.802 g/kg，以生藥總量計），每組12只。各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥液，正常組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水;灌胃體積均為20 mL/kg，每天1次，連續(xù)給藥6天。給藥期間，每天測量小鼠體質(zhì)量、肛溫，并計算其初始體質(zhì)量百分率;末次給藥后，計算其臟器（脾、胸腺、肺）指數(shù)，觀察其肺組織病理學(xué)變化，檢測其肺組織中甲型H1N1流感病毒的病毒載量（以M基因mRNA表達水平反映）以及心臟組織中TLR3、TLR7、髓樣分化因子（MyD88）、胱天蛋白酶3（Caspase-3） mRNA表達水平和Cyt-CO活性、細(xì)胞色素C（Cyt-C）含量。結(jié)果：與正常組比較，模型組小鼠的初始體質(zhì)量百分率、肛溫持續(xù)降低（P<0.05）;脾指數(shù)、胸腺指數(shù)均顯著降低（P<0.05），肺指數(shù)顯著升高（P<0.05）;肺組織病變嚴(yán)重;肺組織中病毒載量和心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88、Caspase-3 mRNA表達水平及Cyt-C含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），心臟組織中Cyt-CO活性顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，麻黃細(xì)辛附子湯組小鼠的初始體質(zhì)量百分率、肛溫自給藥第4天起呈上升趨勢（P<0.05或P<0.01）;脾指數(shù)、胸腺指數(shù)均顯著升高（P<0.05），肺指數(shù)均顯著降低（P<0.05）;肺組織病理損傷明顯改善;肺組織中病毒載量和心臟組織中TLR3、Caspase-3 mRNA表達水平和Cyt-C含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），心臟組織中Cyt-CO活性顯著升高（P<0.01）。結(jié)論：麻黃細(xì)辛附子湯對腎陽虛外感病證模型小鼠具有改善作用，這可能與其可抑制TLRs應(yīng)答和Cyt-CO介導(dǎo)的凋亡調(diào)控途徑有關(guān)。

關(guān)鍵詞 麻黃細(xì)辛附子湯;腎陽虛外感證;細(xì)胞色素C氧化酶;細(xì)胞色素C;凋亡;Toll樣受體;小鼠

中圖分類號 R285 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）06-0669-07

ABSTRACT? ?OBJECTIVE：To study the effects of Mahuang xixin fuzi decoction on Toll-like receptors （TLRs） response and cytochrome C oxidase （Cyt-CO）-mediated apoptosis regulation in mice with? influenza disease of kidney-yang deficiency. METHODS： Totally 48 male Balb/c mice were randomly divided into normal group （n=12） and modeling group （n=36）. The modeling group was intraperitoneally injected with estradiol benzoate solution （8 mg/kg） and intranasally injected with influenza virus H1N1 （20 μL/mice） to establish the influenza disease compound model of kidney-yang deficiency. After modeling， the mice were randomly divided into model group， positive drug group （Oseltamivir phosphate capsules， 0.195 g/kg）， Mahuang xixin fuzi decoction group （1.802 g/kg， by crude drug）， with 12 mice in each group. Each group was given relevant medicine intragastrically， normal group and model group were given corresponding volume of normal saline intragastrically 20 mL/kg， once a day， for consecutive 6 days. During admi- nistration， body weight and anal temperature of mice were measured daily; the percentage of initial body weight was calculated. After last medication， the organ （spleen， thymus and lung） indexes were calculated; the pathological changes of lung tissue were observed. The viral load of influenza A virus H1N1 in lung tissue was detected （reflected by M gene mRNA expression）; mRNA expressions of TLR3， TLR7， myeloid differentiation factor （MyD88） and Caspase-3 in cardiac tissue as well as the activity of Cyt-CO and the content of cytochrome C （Cyt-C） were also determined. RESULTS： Compared with normal group， initial body weight percentage and anal temperature of the model group continued to decrease （P<0.05）;the spleen and thymus indexes were decreased significantly （P<0.05）， while lung index was increased significantly （P<0.05）; the lung tissue lesions were serious. Viral load in lung tissue， mRNA expressions of TLR3， TLR7， MyD88 and Caspase-3 in cardiac tissue as well as the content of Cyt-C were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while the activity of Cyt-CO in cardiac tissue was significantly decreased （P<0.01）. Compared with model group， initial body weight percentage and anal temperature of mice in Mahuang xixin fuzi decoction group showed an increasing trend from the fourth day of administration （P<0.05 or P<0.01）. The spleen and thymus indexes were increased significantly （P<0.05）， while the lung index was significantly decreased （P<0.05）;the pathological injury of lung tissue was significantly improved; viral load in lung tissue， mRNA expressions of TLR3 and Caspase-3 as well as the content of Cyt-C in cardiac tissue were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while the activity of Cyt-CO was increased significantly in cardiac tissue （P<0.01）. CONCLUSIONS： Mahuang xixin fuzi decoction can improve influenza disease of kidney-yang deficiency in mice， the effect may related to inhibit TLRs response and apoptosis regulation pathway mediated by Cyt-CO.

KEYWORDS? ?Mahuang xixin fuzi decoction; Influenza disease of kidney-yang deficiency; Cytochrome C oxidase; Cytochrome C; Apoptosis; Toll-like receptors; Mice

麻黃細(xì)辛附子湯始載于《傷寒論》，是治療陽虛兼外感的經(jīng)方，具有助陽解表、溫經(jīng)散寒的功效，用于治療素體陽虛、復(fù)感寒邪、惡寒發(fā)熱等癥，療效顯著[1]。該方由麻黃、細(xì)辛、制附子等3味中藥材組成。其中，麻黃辛、溫，入太陽散表寒，為君藥;附子辛熱、溫，補少陰之陽，為臣藥;細(xì)辛辛溫，入太陽、少陰，在表可助麻黃發(fā)散風(fēng)寒，在內(nèi)可助附子扶陽溫腎，為佐藥[2-3]。三藥合用，補散兼施，使外感風(fēng)寒得以表散，在內(nèi)陽氣得以溫補，陽虛外感可愈[4-5]。在臨床上，該方主治少陰兼太陽表證，即在陽氣虧虛狀態(tài)下感受寒邪出現(xiàn)邪正相爭而導(dǎo)致的發(fā)熱（即太少兩感證），是治療陽虛外感寒邪的經(jīng)典方劑[6]。

Toll樣受體（TLRs）為Ⅰ型跨膜蛋白，是先天免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵因子，也是炎癥反應(yīng)通路的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體[7]。據(jù)相關(guān)研究報道，甲型H1N1流感病毒感染心肌組織后，心肌細(xì)胞中TLRs表達量增加，然后通過激活TLRs先天免疫應(yīng)答，引發(fā)機體炎癥反應(yīng)。在致炎因子的刺激下，炎癥介質(zhì)可誘導(dǎo)線粒體結(jié)構(gòu)功能損傷，使線粒體膜電位降低，并激活胱天蛋白酶（Caspase）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使該途徑中作為始動因子的細(xì)胞色素C氧化酶（Cyt-CO）活性下降，致使細(xì)胞色素C（Cyt-C）被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，然后激活凋亡執(zhí)行因子Caspase-3，進而引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[8-11]。此外，作為機體能量代謝中心的線粒體，其自身功能障礙也會直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。

近年來，對麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)腎陽虛外感證的研究多集中于藥效及物質(zhì)基礎(chǔ)方面，已證實了該方對腎陽虛外感證有效，且存在量效關(guān)系[5]。因流感病毒侵染機體后，首先激活心肌細(xì)胞內(nèi)TLRs先天免疫應(yīng)答，進而激活Caspase信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起Cyt-CO介導(dǎo)的線粒體調(diào)控通路發(fā)生變化，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。而麻黃細(xì)辛附子湯中的附子生物堿成分能影響心肌細(xì)胞的線粒體凋亡途徑[13-16]。由此，筆者推測麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)腎陽虛外感證的機制可能與緩解炎癥損傷及調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。因此，本研究擬建立病證結(jié)合的腎陽虛外感復(fù)合小鼠模型，并從TLRs應(yīng)答和Cyt-CO介導(dǎo)的凋亡調(diào)控作用出發(fā)，通過對其病毒載量、炎癥因子、凋亡基因表達等指標(biāo)進行測定和評價，探討麻黃細(xì)辛附子湯改善腎陽虛外感證模型小鼠的作用機制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有BX53型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）、CPA225D型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）、NJ 08818型渦旋儀（美國SI公司）、SCIENTZ-50型高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）、ZIL-2型小鼠自主活動儀（北京醫(yī)科院藥研究所）、1510型酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]、TDZ5-WS型醫(yī)用離心機（湖南平凡科技有限公司）、XP型基因擴增儀（杭州博日科技有限公司）、CFX Connect Real-Time System熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）和UV-1780型紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

麻黃飲片（批號130315）購自泰山中藥有限公司，細(xì)辛飲片（批號16050202）購自安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，制附子飲片（批號151008）購自四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，以上飲片經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授鑒定均為真品;AB-8大孔樹脂（粒徑0.3～1.25 mm，批號20190311）購自東鴻化工有限公司;β-環(huán)糊精（批號181029）購自曲阜市天利藥用輔料有限公司;雞胚（批號20190123）購自濟南斯派福瑞禽業(yè)科技有限公司;苯甲酸雌二醇（批號151102）購自寧波第二激素廠;磷酸奧司他韋膠囊（批號J20140121，規(guī)格75 mg）購自上海羅氏制藥有限公司;二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（批號120219200908）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;動物組織總RNA提取試劑盒（批號R6927）、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（批號S7806）、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑-增強版試劑盒（批號S7918）均購自天根生化科技有限公司;小鼠Cyt-C酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（批號20191130）、Cyt-CO活性測定試劑盒（批號20191202）均購自南京建成生物工程研究所;PCR擴增引物由北京六合華大基因科技有限公司設(shè)計、合成;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為超純水。

1.3 動物

健康SPF級雄性Balb/c小鼠共48只，體質(zhì)量為（18±2） g，由山東朋悅實驗動物繁育有限公司提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK（魯）2014-0007。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±2） ℃、相對濕度為40%～60%，飼以普通飼料和無菌水。本研究中的動物實驗方案均符合山東中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 病毒

甲型H1N1流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所提供。

2 方法

2.1 麻黃細(xì)辛附子湯的制備

參照本課題組前期建立的提取方法制備麻黃細(xì)辛附子湯[17-18]。稱取細(xì)辛30 g（最粗粉），加水240 mL浸泡30 min后，進行回流提取，提取液經(jīng)八層紗布濾過，收集濾液，記為細(xì)辛單煎液;同時收集蒸餾餾分，將餾分上樣到AB-8大孔樹脂柱上進行富集純化，以50%乙醇洗脫，洗脫液經(jīng)濃縮后，加入等體積乙醚萃取，收集萃取部位，然后用β-環(huán)糊精包合（每1 mL揮發(fā)油用β-環(huán)糊精6 g包合）得到細(xì)辛揮發(fā)油環(huán)糊精包合物0.72 g。取麻黃30 g、附子60 g，加水360 mL浸泡30 min，然后與細(xì)辛單煎液合并，煎煮3次，3次煎煮的加水量分別為360、300、300 mL，煎煮時間分別為60、30、30 min，分別以八層紗布濾過，收集濾液。合并3次濾液，減壓濃縮至340 mL，凍干成粉末13.77 g。將凍干粉末13.77 g與細(xì)辛揮發(fā)油環(huán)糊精包合物0.72 g溶于水24 mL中，即得麻黃細(xì)辛附子湯，4 ℃保存，備用。

2.2 分組與造模

將小鼠隨機分為正常組（12只）和造模組（36只）。造模組小鼠先腹腔注射苯甲酸雌二醇溶液（8 mg/kg）7天（每天1次）以復(fù)制腎陽虛模型[19]。于造模第7天時，從造模的36只小鼠中隨機選擇12只檢測其自主活動次數(shù)和5%負(fù)重游泳時間，以判斷腎陽虛造模是否成功[20]。然后，參照文獻[21]中滴鼻方法并結(jié)合實際調(diào)整劑量后，對造模組小鼠按20 μL/只滴鼻接種甲型H1N1流感病毒雞胚尿囊液（血凝滴1 ∶ 640）以建立腎陽虛外感復(fù)合模型，并以其出現(xiàn)精神萎靡、畏寒肢冷、形體消瘦、體質(zhì)量和肛溫明顯降低以及呼吸短促、打噴嚏等癥狀為造模成功的外在表現(xiàn)。將造模成功的小鼠按體質(zhì)量和腎陽虛外感程度均分為3組，即模型組、陽性藥組和麻黃細(xì)辛附子湯組，每組12只。

2.3 給藥

腎陽虛外感復(fù)合模型建立24 h后，進行給藥干預(yù)。陽性藥組小鼠給予磷酸奧司他韋膠囊0.195 g/kg（人臨床等效劑量，以水為溶劑溶解），麻黃細(xì)辛附子湯組小鼠給予麻黃細(xì)辛附子湯1.802 g/kg（以生藥總量計，人臨床等效劑量），正常組和模型組小鼠給予等體積生理鹽水。各組小鼠均灌胃相應(yīng)藥液或生理鹽水，灌胃體積均為20 mL/kg，每天1次，連續(xù)6天。

2.4 小鼠一般情況觀察

造模期間，每天觀察小鼠的精神狀況、活動狀態(tài)，并測定其自主活動次數(shù)和5%負(fù)重游泳時間[19]。給藥期間，每日測量小鼠體質(zhì)量、肛溫，記錄其一般體征變化。將給藥前小鼠的體質(zhì)量定義為初始體質(zhì)量，計算初始體質(zhì)量百分率：初始體質(zhì)量百分率（%）=體質(zhì)量（g）/初始體質(zhì)量（g）×100%。

2.5 小鼠臟器指數(shù)測定

末次給藥24 h后，脫頸椎處死小鼠，取其脾、胸腺、肺組織，稱定質(zhì)量，計算各臟器指數(shù)：臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（10 g）。

2.6 小鼠肺組織病理學(xué)觀察

取小鼠肺組織適量于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片（約4 μm），進行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肺組織病理學(xué)變化。

2.7 小鼠肺組織中病毒載量和心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88、Caspase-3 mRNA表達水平測定

采用實時熒光定量PCR法進行測定。取小鼠肺組織和心臟組織各15～20 mg，分別按動物組織總RNA提取試劑盒說明書方法進行總RNA提取。采用紫外-可見分光光度計測定RNA的濃度和純度后，取光密度比值（OD260 nm/OD280 nm）在1.8～2.1之間的樣品，根據(jù)FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行操作，在基因擴增儀中（42 ℃孵育15 min;95 ℃孵育3 min;4 ℃冷卻）逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板采用兩步法進行PCR擴增。反應(yīng)體系（共20 μL）包括2×SuperReal PreMix Plus（含SYBR Green I）10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.6 μL，RNase-free ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性15 min;95 ℃變性10 s，60 ℃延伸32 s，共40個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各組小鼠肺組織中甲型H1N1流感病毒M基因mRNA表達水平以及心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88、Caspase-3 mRNA表達水平。以甲型H1N1流感病毒感染小鼠后其肺組織中M基因mRNA的表達水平反映各組小鼠肺組織中的病毒載量。各基因的引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

2.8 小鼠心臟組織中Cyt-CO活性和Cyt-C含量測定

2.8.1 Cyt-CO活性 取小鼠心臟組織10 mg，加入60 μL清理液（Reagent A）清洗1次，移入液氮罐過夜，次日取出并研磨，然后加入預(yù)冷的500 μL裂解液（Reagent B），在4 ℃下以13 000 r/min離心5 min，吸取上清液。采用BCA法測定蛋白濃度后，按照Cyt-CO活性測定試劑盒方法以紫外-可見分光光度計檢測小鼠心臟組織中Cyt-CO的活性。

2.8.2 Cyt-C含量 按每10 mg心臟組織加入磷酸鹽緩沖液（PBS）90 μL的量制備組織勻漿，充分研磨后，以3 000 r/min離心30 min，取上清液。按照Cyt-C ELISA試劑盒說明書方法以酶標(biāo)儀檢測小鼠心臟組織中Cyt-C的含量。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，造模期間正常組和造模組大鼠的自主活動次數(shù)和5%負(fù)重游泳時間的組間比較采用獨立樣本t檢驗;給藥后各指標(biāo)的組間比較采用單因素方差分析和LSD檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況觀察結(jié)果

3.1.1 一般體征 正常組小鼠活潑好動，皮毛光亮順滑，反應(yīng)靈敏，精神狀態(tài)良好。造模組小鼠行動遲緩，精神倦怠，皮毛濕軟，形體消瘦。與正常組比較，造模組小鼠自主活動次數(shù)顯著減少（P<0.05），5%負(fù)重游泳時間顯著縮短（P<0.05），詳見表2。接種病毒后，造模組小鼠初期表現(xiàn)為呼吸短促、偶爾打噴嚏，后期出現(xiàn)靜臥少動、呼吸困難等現(xiàn)象。

3.1.2 初始體質(zhì)量百分率和肛溫 給藥期間，與正常組比較，模型組小鼠初始體質(zhì)量百分率及肛溫持續(xù)降低（P<0.05），直至解剖時均未見回升的趨勢。自給藥第4天起，各給藥組小鼠的初始體質(zhì)量百分率、肛溫均出現(xiàn)回升的趨勢;與模型組比較，陽性藥組和麻黃細(xì)辛附子湯組小鼠初始體質(zhì)量百分率和肛溫均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。給藥期間各組小鼠的初始體質(zhì)量百分率、肛溫變化趨勢見圖1。

3.2 小鼠臟器指數(shù)測定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)均顯著降低（P<0.05），肺指數(shù)顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，陽性藥組、麻黃細(xì)辛附子湯組小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)均顯著升高（P<0.05），肺指數(shù)均顯著降低（P<0.05）。各組小鼠的體質(zhì)量和脾指數(shù)、肺指數(shù)、胸腺指數(shù)測定結(jié)果見表3。

3.3 小鼠肺組織病理學(xué)觀察結(jié)果

正常組小鼠肺組織形態(tài)正常，肺間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤及明顯的病理實變區(qū);模型組小鼠肺組織病變較嚴(yán)重，泡腔變小，肺泡數(shù)量明顯減少，肺泡間隔出現(xiàn)不同程度增寬，肺間質(zhì)內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤;給藥治療后，陽性藥組和麻黃細(xì)辛附子湯組小鼠的肺組織病變程度均有所改善，其泡腔較模型組均增大，間質(zhì)內(nèi)均可見少量炎性細(xì)胞，管腔內(nèi)僅有少量滲出物，肺泡數(shù)量增多，且已接近正常形態(tài)。各組小鼠肺組織病理切片圖見圖2（圖中箭頭所指為肺組織病變部位）。

3.4 小鼠肺組織中病毒載量和心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88、Caspase-3 mRNA表達水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠肺組織中病毒載量和心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88、Caspase-3 mRNA表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，陽性藥組小鼠肺組織中病毒載量和心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88、Caspase-3 mRNA表達水平以及麻黃細(xì)辛附子湯組小鼠肺組織中病毒載量和心臟組織中TLR3、Caspase-3 mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05）。各組小鼠肺組織中病毒載量和心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88、Caspase-3 mRNA表達水平測定結(jié)果見表4。

3.5 小鼠心臟組織中Cyt-CO活性和Cyt-C含量測定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠心臟組織中Cyt-CO活性顯著降低（P<0.01），Cyt-C含量顯著增加（P<0.01）;與模型組比較，陽性藥組和麻黃細(xì)辛附子湯組小鼠心臟組織中Cyt-CO活性均顯著升高（P<0.01），Cyt-C含量均顯著降低（P<0.01）。各組小鼠心臟組織中Cyt-CO活性和Cyt-C含量測定結(jié)果見表5。

4 討論

本研究綜合中醫(yī)病證模型（腎陽虛）和西醫(yī)致病因素（甲型H1N1流感病毒感染）建立了病證結(jié)合的腎陽虛外感復(fù)合小鼠模型。造模組小鼠出現(xiàn)了皮毛濕軟、精神倦怠、形體消瘦等腎陽虛癥狀，表現(xiàn)出體質(zhì)量、肛溫持續(xù)下降和呼吸短促等外感癥狀，脾指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著降低，肺指數(shù)顯著升高，以上免疫功能低下的表現(xiàn)均提示腎陽虛外感復(fù)合模型復(fù)制成功[22]。磷酸奧司他韋可與甲型H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性位點結(jié)合，在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成對甲型H1N1流感病毒有抑制作用的活性代謝物，從而抑制病毒釋放[23]，且可在一定程度上改善體溫下降、體質(zhì)量降低、精神倦怠等腎陽虛癥狀[24]，最終達到治療腎陽虛外感的目的，故本研究以其作為陽性藥。前期已有多項研究證實，麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)腎陽虛外感證具有良好的藥效作用，且存在量效關(guān)系[5，19]。因此，本研究不再設(shè)置麻黃細(xì)辛附子湯多劑量組，而是重點探討其在臨床等效劑量下干預(yù)腎陽虛外感證可能的作用機制。經(jīng)給藥治療后，腎陽虛外感復(fù)合模型小鼠的體質(zhì)量、肛溫均出現(xiàn)明顯的回升趨勢;其脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著上升，肺指數(shù)均明顯降低;同時其肺組織病理切片顯示，肺泡形態(tài)明顯改善且趨近正常。以上結(jié)果表明，麻黃細(xì)辛附子湯對腎陽虛外感復(fù)合病證模型小鼠具有良好的改善作用，能夠有效改善小鼠的機能狀態(tài)，減輕其組織病理損傷。

TLRs是天然免疫系統(tǒng)中特異性的病原識別模式受體。其中，TLR3能夠特異性識別病毒雙鏈RNA，激活MyD88依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，介導(dǎo)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)[25];TLR7能夠識別病毒單鏈RNA，直接與下游的MyD88作用，從而激活天然免疫反應(yīng)，介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)[26-27]。甲型H1N1流感病毒感染小鼠后，存在于病毒第7節(jié)段編碼的M基因為特征基因，故本研究通過檢測肺組織中M基因mRNA表達水平來反映病毒載量。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肺組織中病毒載量以及心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88 mRNA表達水平均較正常組顯著升高，說明模型小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)強烈，TLRs信號通路被激活。給藥后，與模型組比較，麻黃細(xì)辛附子湯組小鼠肺組織中的病毒載量以及心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88 mRNA表達水平均不同程度降低，表明麻黃細(xì)辛附子湯可通過抑制TLRs先天免疫應(yīng)答信號通路而減輕炎癥反應(yīng)。

線粒體途徑作為細(xì)胞凋亡中最主要的傳導(dǎo)途徑，不僅受TLRs信號通路的調(diào)控，而且線粒體自身的功能障礙也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28-30]。Cyt-CO是線粒體電子傳遞鏈末端的氧化酶，其活性下降可導(dǎo)致線粒體內(nèi)跨膜電位下降，從而打開通透性轉(zhuǎn)換孔，釋放Cyt-C，進而激活凋亡執(zhí)行者Caspase-3，最終促進細(xì)胞凋亡[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠心臟組織中Cyt-CO活性顯著降低，Cyt-C含量顯著升高，且心臟組織中Caspase-3 mRNA表達水平亦顯著升高，表明造模小鼠出現(xiàn)了明顯的心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。給藥后，麻黃細(xì)辛附子湯組小鼠心臟組織中Cyt-CO活性顯著升高，Cyt-C含量顯著降低，且心臟組織中Caspase-3 mRNA表達水平亦顯著降低，表明麻黃細(xì)辛附子湯能夠通過有效調(diào)控線粒體凋亡信號通路而抑制心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，麻黃細(xì)辛附子湯可通過抑制TLRs先天免疫應(yīng)答信號通路中TLR3、TLR7、MyD88 mRNA的表達來抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕炎癥反應(yīng)所致的臟器損傷，并通過下調(diào)Cyt-CO介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子Caspase-3及Cyt-C的表達，進而抑制心肌細(xì)胞凋亡，這可能是麻黃細(xì)辛附子湯對腎陽虛外感病證模型小鼠具有良好的干預(yù)作用的機制之一。

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（收稿日期：2020-12-07 修回日期：2021-01-30）

（編輯：林 靜）