采用UHPLC-MS和質(zhì)量虧損過濾技術(shù)分析二苯乙烯苷在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物和代謝途徑

梁幼玲 史旭華 白俊其 黃志海 徐文 黃娟 丘小惠

摘 要 目的：分析二苯乙烯苷在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物并推測代謝途徑。方法：將雄性SD大鼠隨機(jī)分為血漿組（n=3）、尿液組（n=3）、膽汁組（n=3）和組織組（n=9），各組大鼠均單次灌胃二苯乙烯苷200 mg/kg，分別收集給藥后10、30 min和1、1.5、2、4 h的血漿，給藥后0～6 h的尿液，給藥后0～4 h的膽汁以及給藥后30 min和1、2 h（每個時間點3只）的心、肝、脾、肺、腎、胃組織樣品，經(jīng)甲醇沉淀蛋白后，采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和質(zhì)量虧損過濾技術(shù)聯(lián)合分析、鑒定各樣本中的代謝產(chǎn)物，推測代謝途徑。結(jié)果：從血漿、尿液、膽汁、心、肝、脾、肺、腎、胃樣品中分別檢出6、7、11、1、5、1、3、4、4個代謝產(chǎn)物，包括Ⅰ相代謝（如水解、加氫、羥化）產(chǎn)物2個、Ⅱ相代謝（如葡萄糖醛酸結(jié)合和硫酸化）產(chǎn)物18個，其中葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物有12個。結(jié)論：二苯乙烯苷在膽汁中的代謝產(chǎn)物種類居多，以Ⅱ相代謝產(chǎn)物二苯乙烯苷的葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物為主;代謝途徑主要涉及葡萄糖水解、加氫、羥化、葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸化反應(yīng)等。

關(guān)鍵詞 二苯乙烯苷;超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù);質(zhì)量虧損過濾技術(shù);代謝產(chǎn)物;大鼠

中圖分類號 R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）06-0675-07

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To analyze the metabolites of tetrahydroxystilbene glucoside （THSG） and speculate its metabolism pathway in rats. METHODS： Male SD rats were randomly divided into plasma group （n=3） ， urine group （n=3）， bile group （n=3）， and tissue group （n=9）. Each group was given single dose of THSG 200 mg/kg intragastrically. Plasma samples 10， 30 min and 1， 1.5， 2， 4 h after medication， the unrine 0-6 h after medication， the bile 0-4 h after medication， the tissue of heart， liver， spleen， lung， kidney and stomach 30 min and 1，2 h after medication （3 at each time point） were collected respectively. After precipitated with methanol， the metabolites of samples were analyzed and identified by UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS and mass loss filtration （MDF）. Its metabolism pathway was speculated. RESULTS： In the blood， urine， bile， heart， liver， spleen， lung， kidney， stomach samples， 6， 7， 11， 1， 5， 1， 3， 4， 4 metabolites were detected， including two phase Ⅰ （hydrolysis， hydrogenation and hydroxylation） metabolites， 18 phase Ⅱ （glucuronic acid binding and sulfation） metabolites. There were 12 glucuronic acid binding products. CONCLUSIONS： Most of the metabolites of THSG are found in bile， mainly glucuronic acid binding products of phase Ⅱ metabolite THSG; main metabolic pathways involve glucose hydrolysis， hydrogenation， hydroxylation， glucuronic acid binding and sulfation.

KEYWORDS? ?Tetrahydroxystilbene glucoside; UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS; Mass defect filter; Metabolite; Rats

二苯乙烯苷（Tetrahydroxystilbene glucoside，THSG）為多羥基茋類化合物，化學(xué)名為2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，是中藥何首烏中的特有成分[1]。現(xiàn)代研究表明，THSG具有抗衰老、降低膽固醇、提高免疫功能、防治動脈硬化、保肝、抗腫瘤等多重藥理作用[2-3]。但THSG單體的體內(nèi)代謝途徑尚不清晰，故有必要對其代謝產(chǎn)物和代謝途徑進(jìn)行分析鑒定，為THSG的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及代謝機(jī)制研究提供依據(jù)。

目前，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS/MS）在探討藥物代謝特征、確定藥物代謝物結(jié)構(gòu)和代謝途徑等領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，已成為藥物代謝分析研究的首選手段之一[4-6]。超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）具有靈敏度高、分辨率高、快速準(zhǔn)確等特點，在鑒定和辨識復(fù)雜生物樣品的微量藥物代謝產(chǎn)物時具有極大優(yōu)勢[7]。近年來，許多質(zhì)譜數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)如提取離子流技術(shù)、中性丟失過濾技術(shù)、產(chǎn)物離子過濾技術(shù)等得到較大程度的開發(fā)和應(yīng)用[8]。其中，質(zhì)量虧損過濾技術(shù)（MDF）是一種基于高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)的過濾技術(shù)，是以母體藥物和核心亞結(jié)構(gòu)作為過濾模板，對復(fù)雜生物基質(zhì)中藥物代謝產(chǎn)物進(jìn)行快速檢測的方法，能夠有效去除干擾離子，在一定程度上可以排除假陽性結(jié)果，從而提高目標(biāo)篩選的準(zhǔn)確性[9]。由于MDF在代謝產(chǎn)物分析中的獨特優(yōu)勢，使其得以快速發(fā)展，越來越多地被應(yīng)用于藥物代謝分析研究中[10-11]?；诖?，本文采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS和MDF技術(shù)分析THSG在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，推測代謝途徑，為進(jìn)一步闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Q Exactive PlusTM組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Ultimate 3000型UHPLC系統(tǒng)（美國Dionex公司）、LSE型渦旋混合器（美國Corning公司）、LK/CSJ-20型超聲清洗器（成都老肯科技股份有限公司）、5430R型高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）、RODI-220B1型純水機(jī)（廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司）、BT-125D型十萬分之一電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

THSG對照品（批號HSW191102，純度≥99.5%）購自桂林益天成生物科技有限公司，順式二苯乙烯苷對照品（cis-THSG，批號P27A11F107214，純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司，肝素鈉購自上海如吉生物科技有限公司，甲醇、乙腈（色譜級）均購自德國Merck公司，甲酸（色譜級）購自美國Thermo Fisher Scientific公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為超純水。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（220±20）g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2016-0041。

2 方法

2.1 溶液的配制

稱取THSG對照品適量，加水溶解，稀釋制成質(zhì)量濃度為60 mg/mL的溶液，振蕩混勻，避光，備用。

2.2 分組與給藥

將18只雄性SD大鼠隨機(jī)分為血漿組（n=3）、尿液組（n=3）、膽汁組（n=3）和組織組（n=9）。實驗前，所有大鼠均于SPF級屏障環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食、飲水;給藥前禁食12 h，各組大鼠均單次灌胃THSG溶液200 mg/kg[12]。

2.3 生物樣品采集與處理

2.3.1 血漿 分別在給藥后10、30 min和1、1.5、2、4 h時采集血漿組大鼠眼眶血0.3 mL，置于涂有肝素鈉的1.5 mL離心管中，于4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，分離血漿，合并同一只大鼠不同時間點的血漿樣品，混勻，于-80 ℃冰箱中保存。

2.3.2 尿液 尿液組大鼠飼養(yǎng)于代謝籠中，收集給藥后0～6 h的尿液，于-80 ℃冰箱中保存。

2.3.3 膽汁 給藥后，膽汁組大鼠腹腔注射烏拉坦（1 g/kg）麻醉，通過膽管插管手術(shù)收集給藥后0～4 h的膽汁，于-80 ℃冰箱中保存。

2.3.4 組織 組織組大鼠分別于給藥后30 min和1、2 h腹腔注射10%水合氯醛（0.04 mL/kg）麻醉，每個時間點各3只，分離心、肝、脾、肺、腎、胃，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分，于-80 ℃冰箱中保存。

2.4 樣品預(yù)處理

2.4.1 血漿樣品 取血漿樣品40 μL，加入4倍體積的甲醇渦旋混勻以沉淀蛋白，于4 ℃下以15 000 r/min離心30 min，取上清液5 μL進(jìn)行分析。

2.4.2 尿液/膽汁樣品 取尿液/膽汁樣品100 μL，加入3倍體積的甲醇渦旋混勻以沉淀蛋白，于4 ℃下以15 000 r/min離心30 min，取上清液5 μL進(jìn)行分析。

2.4.3 組織樣品 取各組織樣品，加入3倍量（g/mL）生理鹽水，在冰浴下勻漿，超聲（功率280 W，頻率40 kHz）10 min，于4 ℃下以15 000 r/min離心30 min，取上清液100 μL，再加入3倍體積的甲醇渦旋混勻以沉淀蛋白，于4 ℃下以15 000 r/min離心30 min，取上清液5 μL進(jìn)行分析。

2.5 液相條件

以Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）為色譜柱，以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～2 min，10%B→15%B;2～4 min，15%B→20%B;4～8 min，20%B→30%B;8～10 min，30%B→40%B;10～11 min，40%B→60%B;11～12 min，60%B→70%B），流速為0.2 mL/min，柱溫為35 ℃，自動進(jìn)樣器溫度為4 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。

2.6 質(zhì)譜條件

以組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測;離子源為加熱型電噴霧離子源，離子源溫度為350 ℃;碰撞能量為25、35、45 eV;鞘氣流速為40 arb;輔助氣為15 arb;噴霧電壓為2.5 kV;輔助氣溫度為350 ℃;采集模式為負(fù)離子模式，質(zhì)譜檢測模式為全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描（Full mass/dd-MS2）;Full mass分辨率為70 000，監(jiān)測離子掃描范圍為m/z 100～1 200;dd-MS2分辨率為17 500，動態(tài)排除時間為10.0 s。

2.7 數(shù)據(jù)處理方法

將樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Compound Discovery 2.1軟件，以THSG和THSG苷元（THS）為過濾模板，分別設(shè)定質(zhì)量范圍和質(zhì)量虧損范圍為50 Da和50 mDa，誤差值<3 ppm，通過與空白生物樣品比較，排除內(nèi)源性因素干擾，得到處理數(shù)據(jù)集。結(jié)合體內(nèi)藥物代謝規(guī)律，根據(jù)精確相對分子質(zhì)量的高分辨質(zhì)譜信息、碎片離子信息并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，篩選代謝產(chǎn)物相關(guān)信息，推測代謝途徑[13]。

3 結(jié)果

3.1 THSG對照品的質(zhì)譜裂解規(guī)律

在負(fù)離子模式下，THSG的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z 405.119 45，推測分子式為C20H22O9，二級質(zhì)譜圖中出現(xiàn)碎片離子m/z 243.066 13、137.023 19、149.022 84、215.070 13、225.054 76、173.059 37、93.032 98。其中，主要碎片離子m/z 243.066 13（C14H12O4）系由THSG脫去一分子葡萄糖殘基（C6H10O5）形成THS碎片離子峰，結(jié)合文獻(xiàn)[14]報道，可推測THSG的質(zhì)譜裂解途徑，詳見圖1。

由圖1可見，THSG中碎片離子m/z 225.054 76、215.070 13分別由m/z 243.066 13丟失1分子H2O、1分子CO形成，由于THS中沒有直接脫去H2O和CO的基團(tuán)，推測THS可能由于羥基取代苯環(huán)首先發(fā)生重排成醌式結(jié)構(gòu)后，再脫去小分子基團(tuán)形成較為穩(wěn)定的碎片離子。m/z 149.022 84為脫去苯環(huán)后所形成的碎片離子，m/z 137.023 19為THS發(fā)生醌式重排后雙鍵位置斷裂且多個羰基基團(tuán)脫去CO后形成的碎片離子。m/z 215.070 13脫去1分子C2H2O中性分子形成m/z 173.059 37。

3.2 THSG代謝產(chǎn)物的識別與鑒定

從大鼠血漿、尿液、膽汁、組織樣品中共識別、鑒定出代謝產(chǎn)物20個，其中血漿、尿液、膽汁、心、肝、脾、肺、腎、胃樣品中分別檢出6、7、11、1、5、1、3、4、4個代謝產(chǎn)物，包括Ⅰ相代謝（如水解、加氫、羥化）產(chǎn)物2個、Ⅱ相代謝（如葡萄糖醛酸結(jié)合和硫酸化）產(chǎn)物18個，結(jié)果見圖2（膽汁中的代謝產(chǎn)物出峰時間接近，峰形重疊不易辨別，故該樣品以2張?zhí)崛‰x子流圖表示）、表1。

3.2.1 M13、M16 M16的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-分別為m/z 405.118 38、405.118 74，保留時間及質(zhì)譜裂解規(guī)律與原型化合物一致，因此將其鑒定為THSG。M13具有與原型化合物類似的二級碎片離子，但保留時間不同，推測其可能為THSG的同分異構(gòu)體，經(jīng)過與對照品對比，將M13鑒定為cis-THSG。

3.2.2 M11 M11的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z 485.074 62，推測分子式為C20H22O12S，與原型化合物分子組成相比增加了80 Da（SO3）。其二級特征性碎片離子m/z 243.065 12、405.117 86，與THSG特征碎片離子基本一致，推測M11為THSG的硫酸化代謝產(chǎn)物。

3.2.3 M1、M4、M7、M8 M1、M4、M7、M8的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-分別為m/z 581.149 90、581.150 15、581.150 70、581.150 21，推測分子式均為C26H30O15，均與原型化合物分子組成相比增加了176 Da。在二級質(zhì)譜圖中，均出現(xiàn)了碎片離子m/z 243.065 09、405.117 00，推測這4個化合物均為THSG的葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物[15-16]。

3.2.4 M2、M3 M2、M3的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-均為m/z 661.106 14，推測分子式均為C26H30O18S，其分子組成與M11（C20H22O12S）相比增加了176 Da（C6H8O6），與M1、M4、M7、M8分子組成（C26H30O15）相比增加了80 Da。其二級特征性碎片離子包括m/z 243.065 11、485.073 85等，推測M2、M3均為THSG的硫酸化及葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。

3.2.5 M9、M12、M17 M9、M12、M17的準(zhǔn)分子離子峰

[M-H]-分別為m/z 419.097 02、419.097 84、419.098 91，推測分子式均為C20H20O10，其均較二級碎片離子m/z 243.065 06增加了176 Da，推測M9、M12、M17均為THS的葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。

3.2.6 M5 M5的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z 595.130 49，推測分子式為C26H28O16。與M9、M12、M17分子組成（C20H20O10）相比增加了176 Da。其二級特征性碎片離子為m/z 243.066 07、419.097 93，推測M5為THS雙葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。

3.2.7 M20 M20的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z 325.039 15，推測分子式為C14H14O7S。其二級特征性碎片離子為m/z 245.081 36、230.057 80，其中相對豐度最強(qiáng)的為m/z 245.081 36的碎片，與m/z 243.065 06分子組成相比增加了2 Da，推測THSG進(jìn)入大鼠體內(nèi)后通過水解脫糖形成THS，THS（C14H12O4，[M-H]-為m/z 243.065 09）碳碳雙鍵加氫進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成碳碳單鍵生成dihydro-THS（C14H14O4，[M-H]-為m/z 245.081 36），因在所有組織及體液樣品中均未檢測到THS及dihydro-THS，筆者認(rèn)為這兩種成分在體內(nèi)易進(jìn)一步發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，根據(jù)一般藥物代謝規(guī)律及生成的系列代謝產(chǎn)物[17-18]，推測THS、? ? dihydro-THS可能是后續(xù)代謝產(chǎn)物的中間轉(zhuǎn)化體。M20與dihydro-THS分子組成相比增加了80 Da（SO3），綜上推測M20為THSG的水解-加氫-硫酸化代謝產(chǎn)物。

3.2.8 M6、M14、M19 M6、M14的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-分別為m/z 421.113 04、421.112 95，推測分子式均為C20H22O10，與原型化合物的分子組成相比增加了16 Da。其均生成了相同的二級特征性碎片離子m/z 259.060 15（C15H16O4），與THS分子組成相比增加了16 Da，推測M6、M14均為THSG的羥化產(chǎn)物。M19的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z 421.113 77，推測分子式為C20H22O10，與dihydro-THS分子組成相比增加了176 Da，其二級特征性碎片離子為m/z 245.117 13，推測M19為THSG的水解-加氫-葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。

3.2.9 M15、M18 M15、M18的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-分別為m/z 323.022 25、323.022 22，推測分子式均為C14H12O7S，二者與THS分子組成相比增加了80 Da，且均生成了相同的二級碎片離子m/z 243.065 11，推測M15、M18均為THS的硫酸化代謝產(chǎn)物。

3.2.10 M10 M10的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z 597.144 47，推測分子式為C26H30O16，與M6、M14分子組成相比增加了176 Da，二級特征性碎片離子為m/z 259.060 21、421.112 27，推測M10為THSG的羥化-葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。

3.3 THSG在大鼠體內(nèi)的代謝途徑分析

20個代謝產(chǎn)物涉及的代謝反應(yīng)有葡萄糖水解、加氫、羥化、葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸化反應(yīng)等，推測THSG在大鼠體內(nèi)主要代謝途徑見圖3。

4 討論

THSG為茋類化合物，是中藥何首烏的特征成分。本課題組前期已對生、制何首烏提取液在大鼠體內(nèi)的主要成分及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定分析，結(jié)果顯示大部分代謝物與THSG或大黃素有關(guān)，且以Ⅱ相代謝產(chǎn)物為主[12]。何首烏提取液中的成分十分復(fù)雜，僅進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)鑒定不能明確體內(nèi)代謝產(chǎn)物的來源，化合物代謝途徑判斷結(jié)果亦較為模糊。因此，本研究以THSG單體給藥，考察其在大鼠血漿、尿液、膽汁、組織中的代謝情況。結(jié)果顯示，在大鼠不同部位檢測到的代謝產(chǎn)物有一定差異，從血漿、尿液、膽汁、心、肝、脾、肺、腎、胃樣品中分別檢出了6、7、11、1、5、1、3、4、4個代謝產(chǎn)物，包括Ⅰ相代謝產(chǎn)物2個、Ⅱ相代謝產(chǎn)物18個。已有研究表明，THSG作為何首烏主要活性成分之一，因其具有多個活潑的羥基結(jié)構(gòu)，較易發(fā)生Ⅱ相代謝反應(yīng)，主要排泄途徑是膽汁[19]，本研究在膽汁中檢測到的代謝產(chǎn)物種類居多，且除檢測到的原型化合物外，以Ⅱ相代謝產(chǎn)物THSG的葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物為主。

對于代謝產(chǎn)物的鑒定，關(guān)鍵在于裂解途徑的分析與鑒定以及通過研究藥物原型及其代謝產(chǎn)物的裂解過程，比較碎片離子和分子離子的差異[20-21]。對于大部分代謝產(chǎn)物而言，可采用質(zhì)譜方法根據(jù)其一級、二級質(zhì)譜初步推測代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，但僅憑m/z無法判斷具體結(jié)合位置，故可通過核磁共振及其他分析手段進(jìn)一步研究確證。本研究將高分辨質(zhì)譜產(chǎn)生的海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過MDF技術(shù)的過濾作用獲得更精煉的數(shù)據(jù)集，從而挖掘出更多THSG潛在的體內(nèi)代謝產(chǎn)物。MDF技術(shù)的優(yōu)勢在于可有效地去除干擾離子、簡化質(zhì)譜解析、提高篩選目標(biāo)物的準(zhǔn)確率[22]。

綜上，本研究采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS和MDF技術(shù)對THSG在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析與鑒定，通過分析各部位生物樣品中代謝產(chǎn)物的分子式、保留時間并結(jié)合一級、二級質(zhì)譜信息，共鑒定出THSG的20個代謝產(chǎn)物，推測該化合物在大鼠體內(nèi)的代謝途徑主要涉及葡萄糖水解、加氫、羥化、葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸化反應(yīng)等，為進(jìn)一步研究THSG的代謝產(chǎn)物以及作用機(jī)制提供了重要信息。

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（收稿日期：2020-11-11 修回日期：2021-02-01）

（編輯：鄒麗娟）