Napsin A、 TTF-1 及 CK7 在惡性胸水中對肺腺癌的診斷價值

鐘 玲

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科 (廣州 510260)

惡性胸水 (malignant pleural effusion, MPE) 是原發(fā)于胸膜的惡性腫瘤或其他部位的惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至胸膜導(dǎo)致的胸腔積液, 平均生存期為 4 ～7月[1]。 在日常工作中對惡性胸水進(jìn)行細(xì)胞蠟塊包埋切片, 可獲得與腫瘤組織形態(tài)相近的形態(tài), 加以免疫組化的檢測可以對肺原發(fā)性惡性胸水和繼發(fā)的惡性胸水進(jìn)行分類。 細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化檢測特別是Napsin A、 TTF-1 標(biāo)記能獲得更精準(zhǔn)的診斷[2-3], 同時CK7 做為肺腺癌分化的客觀評價指標(biāo)[4]。 本文回顧性分析189 例惡性胸水細(xì)胞蠟塊切片及免疫組化結(jié)果, 探討免疫組化標(biāo)記Napsin A、TTF-1 和CK7 和腫瘤標(biāo)記物CEA 在肺腺癌胸水中的診斷價值。 在惡性胸水的研究中首次將胸水細(xì)胞蠟塊免疫組化及胸水腫瘤標(biāo)記物綜合起來分析,期望對晚期肺腺癌患者準(zhǔn)確的病理診斷提供更充分的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科2017 年1 月—2019 年 11 月所有行 Napsin A、 TTF-1 及 CK7免疫組化檢測的惡性胸水的細(xì)胞蠟塊的患者資料。

1.2 制作細(xì)胞蠟塊

取30 mL 胸水 (血性標(biāo)本時可加入3%醋酸乙醇10 mL 進(jìn)行溶血處理) 放入50 mL 離心管中,離心機(jī)2 000 r/min, 離心5 min, 棄上清, 如果沉淀物不夠時可加入少量蛋清或反復(fù)離心, 收集沉淀物之后, 直接加10 mL 95%酒精充分搖勻, 離心機(jī)2 000 r/min, 離心10 min, 棄上清, 取底部沉淀物, 用拷貝紙包埋放進(jìn)10%中性福爾馬林固定,與常規(guī)小組織進(jìn)行脫水處理。 常規(guī)包埋、 3 ～4 μm切片, HE 染色。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)方法

觀察常規(guī)HE 切片進(jìn)行, 將有可疑異型成分的蠟塊選取出來進(jìn)行免疫組化染色, 根據(jù)鏡下形態(tài)及相關(guān)病史選擇不同的抗體 (均包含Napsin A、TTF-1、 CK7), 采用 EnVision 兩步法。 抗體及試劑均購自福州邁新公司。

1.4 免疫組化結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

以10% 及以上的目標(biāo)細(xì)胞出現(xiàn)定位 (胞核、胞膜或胞漿) 清晰的棕褐色或黃色顆粒為陽性表達(dá), ＜10% 或完全不著色為陰性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計分析

計數(shù)資料用n(%) 表示; 連續(xù)變量采用中位數(shù) (四分位間距) 表示。 計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗; 兩組間比較采用Mann-whitney U 非參數(shù)檢驗, 受試者工作特征曲線 (AUC 曲線) 分析并確定血清和胸水CEA 的最佳診斷臨界值并計算曲線下面積 (AUC),P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,使用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞蠟塊HE 切片

細(xì)胞蠟塊切片中背景干凈, 對比較明顯, 細(xì)胞形態(tài)與常規(guī)組織學(xué)中形態(tài)相似, 避免了細(xì)胞學(xué)涂片的細(xì)胞重疊、 退變等不利于觀察的因素。 大部切片中可見較多巨噬細(xì)胞和間皮細(xì)胞, 腫瘤細(xì)胞異型性明顯, 容易辨認(rèn)。

2.2 惡性胸水的細(xì)胞學(xué)類型及組織來源

在189 例惡性胸水標(biāo)本中, 其中155 例為肺腺癌細(xì)胞, 部分病例細(xì)胞聚集成三維立體球狀結(jié)構(gòu), 部分病例可見乳頭狀或腺腔樣結(jié)構(gòu), 細(xì)胞核漿比明顯升高, 可見核分裂。 1 例為肺小細(xì)胞癌細(xì)胞, 癌細(xì)胞胞漿少, 近乎裸核, 異型性明顯。1 例為惡性黑色素瘤細(xì)胞, 瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)可見明顯的黑色素顆粒, 細(xì)胞核核仁明顯, 表現(xiàn)明顯的失粘附性。 見表1。

表1 189 例惡性胸水中組織來源

2.3 惡性胸水的免疫組化表達(dá)情況

除了 CK7、 TTF-1 及 Napsin A 外, 基于形態(tài)學(xué)及病史考慮, 再增加部分抗體, 有乳腺癌病史患者細(xì)胞學(xué)出現(xiàn)ER、 PR、 Mammaglobin 陽性時診斷為轉(zhuǎn)移性乳腺癌。 既往有下肢惡性黑色素瘤病史時, 結(jié)合 S-100、 HMB45、 Melan A 彌漫陽性時診斷為轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤細(xì)胞。 有部分病例細(xì)胞異型性明顯, 血及胸水中的CEA 表達(dá)均有不同程度的升高, 免疫組化CEA、 CK 均有表達(dá), 且臨床無明確病史且影像學(xué)檢查也未見實質(zhì)性占位, 這種情況考慮為惡性胸水, 但是來源不明。

免疫組化結(jié)果分析 Napsin A 蛋白陽性顆粒定位于胞漿, 在肺腺癌及其他腫瘤所致的惡性胸水標(biāo)本中的陽性表達(dá)率分別為83.9%及16.1% (差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.001)。 TTF-1 蛋白陽性顆粒定位于胞核, 在肺腺癌及其他腫瘤所致的惡性胸水標(biāo)本中的陽性表達(dá)率分別為93.5%及6.5%(差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.001)。 CK7 蛋白陽性顆粒定位于胞漿及胞膜, 在肺腺癌及其他腫瘤所致的惡性胸水標(biāo)本中的陽性表達(dá)率分別為98.1%、1.9% (差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.001)。 所有病例Napsin A、 TTF-1 和 CK7 表達(dá)情況見表 2。

2.4 為了進(jìn)一步研究胸水CEA、 血清CEA、 免疫組化標(biāo)記Napsin A、 TTF-1 和CK7 在肺腺癌源性胸水的診斷價值, 我們將所有患者分為肺腺癌組和非肺腺癌組, 患者的一般情況和胸水CEA 和血清CEA 水平及免疫組化標(biāo)記Napsin A、 TTF-1 和CK7表達(dá)情況見表3。 結(jié)果表明, 兩組患者的年齡無統(tǒng)計學(xué)差異 (P＞0.05), 但肺腺癌組患者男性比例更高, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.019); 相對于非肺腺癌組, 肺腺癌組患者的血清CEA 和胸水CEA 水平升高, 其差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P均＜0.05); 與非肺腺癌組相比較, 肺腺癌組患者的Napsin A、 TTF-1和CK7 表達(dá)升高 (P均＜0.05)。

表2 189 例惡性胸水中Napsin A、 TTF-1、 CK7 的表達(dá)情況 %

表3 胸水肺腺癌與非肺腺癌比較

2.5 在肺腺癌和其它惡性腫瘤所致惡性積液的鑒別診斷中, Napsin A 診斷肺腺癌的敏感度為83.9%, 特異度為93.9%; TTF-1 診斷肺腺癌的敏感度為93.5%, 特異度為90.9%; CK7 診斷肺腺癌的敏感度為98.1%, 特異度為42.4%。

2.6 采用ROC 曲線繪制血清CEA 和胸水CEA 診斷肺腺癌的曲線下面積見圖1。 測得血清CEA 的ROC 曲線面積為0.627,P=0.022, 其診斷肺腺癌的參考值: 7.16 ng/mL, 其診斷肺腺癌的敏感度為69.7%, 特異度為58.5%; 胸水 CEA 的 ROC 曲線面積為0.699,P=0 ＜0.001, 其診斷肺腺癌的參考值: 90.04 ng/mP, 其診斷肺腺癌的敏感度為69.0%, 特異度為66.7%。

3 討 論

正常胸腔內(nèi)有少許漿液, 有潤滑作用, 但是在病理狀態(tài)下漿液可明顯增多。 以往, 胸水增多的病因以結(jié)核多見, 但是隨著惡性腫瘤的增加,惡性胸水不斷增多。 細(xì)胞蠟塊的普及對提高惡性胸水的診斷有很大的幫助。 胸水細(xì)胞蠟塊具有可重復(fù)性、 觀察性高及特異度強(qiáng)等優(yōu)點, 目前在國外許多國家已成為細(xì)胞學(xué)常規(guī)診斷技術(shù)[5]。 細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組化抗體的應(yīng)用能提高惡性胸水的檢出率并進(jìn)一步判斷其組織來源[6-7]。

圖1 血清CEA 和胸水CEA 診斷肺腺癌的ROC 曲線

本研究共入選了189 例惡性胸水標(biāo)本, 結(jié)合HE 切片觀察、 患者病史及免疫組化 Napsin A、TTF-1 及CK7 等結(jié)果綜合分析, 我們進(jìn)一步評估Napsin A、 TTF-1 及CK7 對肺腺癌與其它惡性腫瘤的鑒別能力, 我們將患者分為肺腺癌組和非肺腺癌組, 結(jié)果表明, 在本組155 例肺腺癌所致的胸水中Napsin A 敏感度為83.9%, 特異度為93.9%。Napsin A 是一種顯著表達(dá)于肺和腎臟的天門冬氨酸蛋白酶, 是肺腺癌的一種標(biāo)記物[8]。 Napsin A 在肺腺癌中的表達(dá)與組織學(xué)類型和分化程度具有相關(guān)性[9], 在原位腺癌、 微浸潤腺癌及貼壁型肺癌中100%表達(dá), 但是在浸潤性粘液腺癌中陽性率不到50%, 因此當(dāng)一個浸潤性粘液腺癌所致的胸水中Napsin A 可能是陰性表達(dá), 這時與TTF-1、 CK7進(jìn)行組合診斷更具有診斷價值, 也能避免一部分表達(dá)Napsin A 的腫瘤如乳頭狀透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌[10]及卵巢透明細(xì)胞癌[11]的誤診。 本研究中出現(xiàn)了1 例卵巢透明細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移至胸水, 出現(xiàn)了Napsin A 及CK7 陽性、 TTF-1 陰性表達(dá)情況, 結(jié)合病史可以避免診斷為肺腺癌細(xì)胞的可能。

TTF-1 又稱為甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子, 主要分布在成人的內(nèi)胚層分化甲狀腺濾泡細(xì)胞呼吸道II 型肺泡上皮等, 屬于II 型肺泡的特異度標(biāo)志物, 可用于肺腺癌診斷。 在排除甲狀腺癌后的 TTF-1 的表達(dá)水平可作為肺癌的一項特異度標(biāo)志物, 將TTF-1 和其他抗體聯(lián)合檢測, 可對肺腺癌等進(jìn)行確診。文獻(xiàn)報道TTF-1 在肺腺癌所致的胸水敏感度在79.2% ～92.6% 之間[12-13]。 本研究的 TTF-1 敏感度為93.5%, 略高于文獻(xiàn), 可能與本研究中非肺源性腫瘤例數(shù)較少有關(guān)。 本研究顯示TTF-1 在肺腺癌所致的胸水特異度為90.9%, 與文獻(xiàn)報道[14]的71.1% ～90%相符, 表明在鑒別惡性胸水來源時TTF-1 是個較好的指標(biāo)。 在本組155 例肺腺癌所致的胸水中Napsin A 敏感度及特異度均較TTF-1 低。 這與Turner 等[15]報道在肺腺癌中表達(dá)相符。

CK7 屬于角蛋白的一種亞型, 一般情況下,主要表達(dá)于肺、 乳腺、 卵巢等上皮處, 在2014 版專家共識[9]中表明CK7 在肺腺癌中100%表達(dá), 敏感度極高; 但是特異度較低。 本研究中表明CK7診斷肺腺癌的敏感度為98.1%, 特異度為42.4%,與共識是接近的[9]。 癌細(xì)胞在胸水中處于浸泡狀態(tài), 存在一定程度的CK7 抗原丟失, 因此胸水細(xì)胞標(biāo)本CK7 的表達(dá)較低。 CK7 在57.7%的非腺癌中陽性表達(dá), 因此, 在肺腺癌鑒別診斷中, 不宜單獨使用, 應(yīng)該聯(lián)合其他特異度較高的抗體。

然而三者均具有較高的敏感度, Napsin A 和TTF-1 的特異度高達(dá)90%以上, 而CK7 的特異度較低, 因而根據(jù)指南將三者聯(lián)合應(yīng)用, 能在最大程度上診斷出肺腺癌。

目前已有學(xué)者將腫瘤標(biāo)記物CEA 用于肺腺癌的臨床診斷中, 有研究表明CEA 是肺癌的一個很好標(biāo)記物, 且胸水檢測優(yōu)于血清, 在肺腺癌顯著升高[16]。本研究對比了血清和胸水CEA 對肺腺癌組及非肺源性惡性胸水組織的鑒別診斷能力。 結(jié)果表明, 無論是胸水CEA 還是胸水CEA 在肺腺癌和其它惡性腫瘤的鑒別中均有統(tǒng)計學(xué)意義, 使用AUC 曲線測得血清CEA 的其診斷肺腺癌的參考值: 7.16 ng/mL; 胸水CEA 肺腺癌的參考值: 90.04 ng/mL, 與文獻(xiàn)[17]中的 (69.98 ±10.65) ng/mL 相近。

綜上所述, Napsin A、 TTF-1 及 CK7 在惡性胸水中具有重要價值, 三者的聯(lián)合應(yīng)用能極大提高肺腺癌與其它惡性腫瘤來源胸水的鑒別能力, 同時胸水及血清的CEA 值可以做為一個鑒別診斷的參考依據(jù)。