澳洲堅(jiān)果MiSTPP6基因克隆及低溫脅迫下表達(dá)分析

蔡元保 楊祥燕 李季東 黃思婕 李穆 巫輔民

蔡元保（1981-），高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事果樹(shù)分子生物學(xué)與遺傳育種研究工作，主持國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目、廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目和廣西自然科學(xué)基金等科研項(xiàng)目4項(xiàng)，并作為主要成員參與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部行業(yè)科技專項(xiàng)、廣西創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)發(fā)展專項(xiàng)等重大科研項(xiàng)目。以第一完成人或主要完成人獲得省部級(jí)科技獎(jiǎng)2項(xiàng)，地廳級(jí)科技獎(jiǎng)4項(xiàng);以第一發(fā)明人或第一完成人獲得國(guó)家專利授權(quán)18項(xiàng)（其中發(fā)明專利6項(xiàng)）和計(jì)算機(jī)軟件著作權(quán)登記6項(xiàng)。主持或主要參與廣西地方標(biāo)準(zhǔn)2項(xiàng)，作物新品種登記5個(gè);以第一作者或通訊作者在《南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》《植物學(xué)報(bào)》《植物生理學(xué)報(bào)》《植物遺傳資源學(xué)報(bào)》等期刊上發(fā)表論文30多篇，并獲得優(yōu)秀論文13篇。

摘要：【目的】克隆澳洲堅(jiān)果絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶（PP1）家族基因（MiSTPP6），并分析其不同組織及低溫脅迫下的表達(dá)模式，為澳洲堅(jiān)果PP1家族基因的抗寒分子機(jī)制提供理論依據(jù)?！痉椒ā炕诎闹迗?jiān)果轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，利用RT-PCR技術(shù)克隆MiSTPP6基因，對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其在不同組織及低溫脅迫下的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】從澳洲堅(jiān)果中克隆獲得MiSTPP6基因（GenBank登錄號(hào)為MT374553），其cDNA全長(zhǎng)2129 bp，最大的閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為948 bp，編碼315個(gè)氨基酸殘基，含有PP1蛋白家族的典型結(jié)構(gòu)域（MPP_PP1_PPKL）和特征性序列（LRGNHE）。MiSTPP6蛋白為穩(wěn)定的親水性蛋白，以絲氨酸磷酸化為主，可能定位于細(xì)胞質(zhì)，屬于非分泌型蛋白或膜蛋白，與已知植物PP1蛋白的氨基酸序列具有很高的相似性。MiSTPP6蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋（占40.00%）、無(wú)規(guī)則卷曲（占32.38%）、延伸鏈（占18.41%）和β-轉(zhuǎn)角（占9.21%），其三級(jí)結(jié)構(gòu)與模板蛋白4v0u.1.A的結(jié)構(gòu)相似度為80.60%，GMQE值為0.89。MiSTPP6基因在根、莖、葉、剛開(kāi)放的小花和謝花后30～45 d的小果中均有表達(dá)，其中，MiSTPP6基因在剛開(kāi)放的小花中的相對(duì)表達(dá)量最高。4 ℃低溫脅迫后0.5～24.0 h，MiSTPP6基因在澳洲堅(jiān)果苗期葉片中的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照明顯下調(diào)，整體上呈持續(xù)下降的趨勢(shì)。【結(jié)論】MiSTPP6屬于PP1家族基因，具有組織表達(dá)特異性，可能在澳洲堅(jiān)果抗寒分子機(jī)制中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞： 澳洲堅(jiān)果;蛋白磷酸酶;PP1;基因克隆;表達(dá)分析;低溫脅迫

中圖分類號(hào)： S664.903.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）12-3205-07

Cloning and expression analysis of MiSTPP6 gene from Macadamia integrifolia under cold stress

CAI Yuan-bao， YANG Xiang-yan*， LI Ji-dong， HUANG Si-jie， LI Mu， WU Fu-min

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning? 530001， China）

Abstract：【Objective】To clone serine/thonine protein phosphatase（PP1） family gene MiSTPP6 from macadamia （Macadamia integrifolia） and analyze its expression patterns in different tissues and cold stress，so as to provide scientific basis for the molecular mechanism of PPI family gene in response to cold stress. 【Method】Based on the transcriptome sequencing of macadamia， MiSTPP6 gene was cloned by RT-PCR and its sequences were analyzed by bioinformatics，and its expression in different tissues and cold stress was analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR. 【Result】A new protein phosphatase gene MiSTPP6 was cloned from M. integrifolia （GenBank accession number was MT374553）. The full length cDNA and open reading frame （ORF） were 2129 bp and 948 bp，encoding 315 amino acidswith MPP_PP1_ PPKL domain and signature sequence （LRGNHE） belonged to the PP1 protein family. MiSTPP6 was a stable hydrophilic protein and mainly phosphorylated by serine，which might be located in the cytoplasm. MiSTPP6 was non-secreted transmembrane protein，which had high similarity with the amino acid sequence of known plant PP1 proteins. The secondary structure of MiSTPP6 consisted of α-helix （40.00%），random coil （32.38%），extended strand （18.41%） and β-turn （9.21%）.The similarity of tertiary structure between MiSTPP6 and the template protein 4v0u.1.A was 80.60%，and the GMQE value was 0.89. MiSTPP6 was expressed in different tissues （roots，stems，leaves，small flowers and small fruits 30-45 d after blossom falling） of macadamia，with the highest expression in opened flower. After low temperature （4 ℃） stress for 0.5-24.0 h，the relative expression of MiSTPP6 in macadamia seedling leaves was significantly down-regulated compared with the control，and the overall trend continued to decrease. 【Conclusion】MiSTPP6 belongs to PP1 family gene and has tissue expression specificity， it may play an important regulatory role in the molecular mechanism of response to cold stress in macadamia.

Key words： macadamia; protein phosphatase; PP1; gene cloning; expression analysis; cold stress

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31860537）;Guangxi Science and Technology Planning Project（GuikeAB19245008）;Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2021YT154，Guinongke 2020YM56）

0 引言

【研究意義】蛋白磷酸酶是蛋白質(zhì)可逆磷酸化過(guò)程中的兩個(gè)關(guān)鍵酶之一，通過(guò)蛋白質(zhì)去磷酸化修飾，從而改變目標(biāo)蛋白的構(gòu)象、生物學(xué)活性和穩(wěn)定性（Tang et al.，2011;Miura et al.，2011;Casamayor and Ari?o，2020），因此，蛋白磷酸酶在植物新陳代謝、光合作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞凋亡等生理生化過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，尤其是與植物抗逆性密切相關(guān)（翁華等，2003;Ceulemans and Bollen，2004;Shi，2009）。澳洲堅(jiān)果（Macadamia spp.）原產(chǎn)于亞熱帶雨林，被譽(yù)為“干果皇后”，其生長(zhǎng)環(huán)境要求較高，其中氣溫是主要影響因素之一，若氣溫高于30 ℃或低于10 ℃均會(huì)嚴(yán)重影響其正常生長(zhǎng)（Buthelezi et al.，2019;Herbert et al.，2019）。因此，研究澳洲堅(jiān)果蛋白磷酸酶的功能對(duì)于揭示澳洲堅(jiān)果的抗寒分子機(jī)制具有重要指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蛋白激酶和蛋白磷酸酶的理化性質(zhì)互為對(duì)立，在參與蛋白質(zhì)的可逆磷酸化過(guò)程中，蛋白激酶催化蛋白的磷酸化反應(yīng)，而蛋白磷酸酶催化去磷酸化反應(yīng)（Barrero-Gil and Salinas，2013;阮班軍等，2014）。其中，絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶（PPs）根據(jù)底物的特異性、金屬離子的依賴性及其抑制劑的敏感性，可分為PP1和PP2家族（Luan，2003;Verbinnen et al.，2017）。目前，PP2基因家族的生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)制研究較多，尤其是PP2A和PP2C亞家族。其中，PP2A基因在調(diào)控植物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，如PP2A作為關(guān)鍵調(diào)控基因可響應(yīng)逆境脅迫（Khan et al.，2020），也可作為水楊酸靶基因抑制植物生長(zhǎng)（Tan et al.，2020），還可調(diào)控植物的氧化應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Máthé et al.，2019）;PP2C基因在植物脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Jung et al.，2020）和響應(yīng)干旱脅迫和鹽脅迫中發(fā)揮重要的調(diào)控作用（Krzywińska et al.，2016;Baek et al.，2019）。PP1家族蛋白是蛋白磷酸酶的一個(gè)重要分支，該家族蛋白的組成、結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)均與其他家族成員顯著不同，但均在細(xì)胞信號(hào)傳遞過(guò)程中發(fā)揮重要作用。PP1家族蛋白的活性主要受內(nèi)源抑制劑I-1和I-2的抑制，且主要作用于磷酸酶激酶的β亞基（Farkas et al.，2007）。目前，在豌豆（Guo and Roux，1996）、小麥（Vazquez-Tello et al.，1998）、水稻（Liao et al.，2016）、辣椒（Baek et al.，2017）和擬南芥（Zhang et al.，2020）等多種植物基因組DNA中已分離出PP1家族基因，且發(fā)現(xiàn)其在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要調(diào)控作用。目前有關(guān)PP1家族基因在響應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前有關(guān)澳洲堅(jiān)果PP1家族基因克隆及功能分析的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】基于課題組前期的研究結(jié)果（蔡元保等，2013），從澳洲堅(jiān)果中克隆PP1家族基因（MiSTPP6），對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其在不同組織及低溫脅迫下的表達(dá)情況，以期為澳洲堅(jiān)果蛋白磷酸酶基因的抗寒分子機(jī)制及抗寒品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試品種為澳洲堅(jiān)果（M. integrifolia）品種Own Choice（縮寫(xiě)為O.C.），取自廣西亞熱帶作物研究所澳洲堅(jiān)果種質(zhì)圃。主要試劑：高保真酶Primer STAR Max DNA Polymerase、DNA凝膠回收試劑盒、ExTaq DNA聚合酶、DNA Marker和pMD18-T等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Life公司;ChamQ SYBR qPCR Master Mix購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：CFX96 Real-Time PCR System熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)）。

1. 2 樣品處理及采集

收集O.C.嫁接苗（接穗為4個(gè)月苗齡）的根、莖和葉及剛開(kāi)放的小花和謝花后30～45 d的小果。對(duì)O.C.幼苗進(jìn)行4 ℃低溫脅迫，分別處理0.5、1.0、3.0、6.0、12.0和24.0 h，對(duì)照組（CK）為未低溫處理，試驗(yàn)重復(fù)3次，并收集這些葉片樣品。

1. 3 總RNA提取及cDNA合成

取液氮速凍后的澳洲堅(jiān)果樣品，采用優(yōu)化的CTAB改良法進(jìn)行總RNA提?。ú淘５?，2014）。總RNA的濃度和純度用核酸蛋白分析儀進(jìn)行檢測(cè)，其完整性利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。以澳洲堅(jiān)果樣品總RNA為模板，參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1. 4 MiSTPP6基因cDNA克隆

本課題組通過(guò)澳洲堅(jiān)果抗寒轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選獲得1個(gè)PP1家族基因序列，采用ORFfinder查找最大的開(kāi)放閱讀框（ORF），采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)ORF兩端引物（STPP6-F和STPP6-R）（表1），由深圳華大基因研究院合成。以澳洲堅(jiān)果葉片cDNA為模板、STPP6-F和STPP6-R引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×Primer STAR Max 12.0 μL，10 μmol/L 正、反向引物各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，無(wú)菌ddH2O補(bǔ)充至25.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 35 s，58.3 ℃ 40 s，72 ℃ 75 s，進(jìn)行34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min;4 ℃保存。利用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，并將目標(biāo)條帶連接至pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基中挑取陽(yáng)性克隆，送至深圳華大基因研究院進(jìn)行測(cè)序。

1. 5 生物信息學(xué)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTp對(duì)克隆基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，并用ORFfinder進(jìn)行最大的ORF預(yù)測(cè)。采用SMART和PROSITE預(yù)測(cè)編碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域和功能基元;利用ProtParam預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì);通過(guò)NetPhos 3.1分析蛋白的磷酸化位點(diǎn);以PSORT分析蛋白的亞細(xì)胞定位;利用SignalP 4.1預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽;采用TMpred預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域;通過(guò)SOPMA和SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的GenBank中搜索同源蛋白，利用DNAMAN 6.0進(jìn)行蛋白的氨基酸序列多重比對(duì)分析，并用MEGA 5.1的鄰接法（Neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（Bootstrap為1000次重復(fù)）。

1. 6 澳洲堅(jiān)果MiSTPP6基因的表達(dá)模式分析

采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)MiSTPP6基因的熒光定量引物QSTPP6-F和QSTPP6-R（表1）。利用BioRad CFX96熒光定量PCR檢測(cè)MiSTPP6基因在澳洲堅(jiān)果不同組織及低溫脅迫下的表達(dá)情況，以澳洲堅(jiān)果管家基因MADH為內(nèi)參基因（楊倩等，2020）。反應(yīng)體系：2×SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL，cDNA模板1.0 μL，正、反向引物各1.0 μL，無(wú)菌ddH2O補(bǔ)充至20.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃15 s，60.8 ℃或58.0 ℃（表1）25 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行42個(gè)循環(huán)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1. 7 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算MiSTPP6基因的相對(duì)表達(dá)量（Livak and Schmittgen，2001）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 MiSTPP6基因克隆結(jié)果

以澳洲堅(jiān)果葉片cDNA為模板、STPP6-F和STPP6-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果和同源序列分析結(jié)果顯示，該片段全長(zhǎng)2129 bp，ORF長(zhǎng)度為948 bp，編碼315個(gè)氨基酸殘基，與其他植物的PP1基因家族成員具有極高的相似性，說(shuō)明擴(kuò)增片段為PP1家族基因，將其命名為MiSTPP6，GenBank登錄號(hào)為MT374553。

2. 2 MiSTPP6與其他植物PP1蛋白的序列比對(duì)結(jié)果

對(duì)MiSTPP6與其他植物PP1蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，結(jié)果表明MiSTPP6蛋白與已知植物PP1蛋白的氨基酸序列具有較高的相似性（圖1），其中，與罌粟（Papaver somniferum）PsPP1-1蛋白（XP_026418403）高達(dá)92.70%，與姬蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）PePP1-1（XP_020590163）高達(dá)90.10%，與鐵皮石斛（Dendrobium catenatum）DcPP1-1（XP_020673587）高達(dá)89.17%，與藜麥（Chenopodium quinoa）CqPP1（XP_021769065）高達(dá)88.50%。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，MiSTPP6含有PP1蛋白家族的典型結(jié)構(gòu)域（MPP_PP1_PPKL）和特征性序列（LRGNHE）。

2. 3 MiSTPP6與其他PPs的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

從GenBank中選擇來(lái)源于不同植物的代表性PPs蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖2）表明，20個(gè)PPs蛋白被分成PP1和PP2家族，其中，MiSTPP6屬于PP1家族，與罌粟PsPP1-1（XP_026418403）、姬蝴蝶蘭PePP1-1（XP_020590163）和鐵皮石斛DcPP1-1（XP_020673587）的親緣關(guān)系最近。

2. 4 MiSTPP6蛋白的理化特性分析結(jié)果

MiSTPP6蛋白分子式C1599H2502N426O464S19，分子量35.73 kD，理論等電點(diǎn)（pI）5.18，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）和正電荷殘基（Arg+Lys）分別為43和34個(gè)，不穩(wěn)定指數(shù)Ⅱ37.48，脂肪系數(shù)95.65，親水性系數(shù)-0.105，說(shuō)明該蛋白為穩(wěn)定的親水性蛋白。

2. 5 MiSTPP6蛋白的磷酸化位點(diǎn)、亞細(xì)胞定位、跨膜域和信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果

NetPhos 3.1分析結(jié)果（圖3）顯示，MiSTPP6蛋白的磷酸化位點(diǎn)高（分值大于0.5）的氨基酸有20個(gè)，其中絲氨酸10個(gè)，蘇氨酸6個(gè)，酪氨酸4個(gè)，且這些磷酸化位點(diǎn)在該蛋白中的分布不均勻。PSORT預(yù)測(cè)結(jié)果表明，MiSTPP6蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)的概率較高，為65%。TMpred和SignalP預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MiSTPP6蛋白不含跨膜域和信號(hào)肽序列，屬于非分泌型蛋白或膜蛋白。

2. 6 MiSTPP6蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

SOPMA預(yù)測(cè)結(jié)果可知，MiSTPP6蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋（占40.00%）、無(wú)規(guī)則卷曲（占32.38%）、延伸鏈（占18.41%）和β-轉(zhuǎn)角（占9.21%）（圖4）。以PP1（4v0u.1.A）為同源模板對(duì)MiSTPP6蛋白進(jìn)行建模，結(jié)果（圖5）顯示，MiSTPP6蛋白與模板蛋白4v0u.1.A的結(jié)構(gòu)相似度為80.60%，GMQE值為0.89，主要由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

2. 7 MiSTPP6基因的表達(dá)分析結(jié)果

由圖6可知，MiSTPP6基因在澳洲堅(jiān)果的根、莖、葉、小花和小果中均有表達(dá)，其中MiSTPP6基因在剛開(kāi)放的小花中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是小果，在莖中的相對(duì)表達(dá)量最低。由圖7可知，4 ℃低溫脅迫后0.5～24.0 h，MiSTPP6基因在澳洲堅(jiān)果苗期葉片中的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照明顯下調(diào)，整體上呈持續(xù)下降的趨勢(shì)。

3 討論

PP1由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基組成的全酶。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物基因組編碼大約200個(gè)相互作用的PP1蛋白。但在植物中僅有少數(shù)PP1蛋白被報(bào)道（Zhang et al.，2020）。PP1家族蛋白的氨基酸序列及蛋白空間結(jié)構(gòu)高度保守，含有典型的MPP_PP1_PPKL結(jié)構(gòu)域（Casamayor and Ari?o，2020）。本研究從澳洲堅(jiān)果克隆獲得MiSTPP6基因，其編碼的氨基酸序列含有PP1蛋白家族的典型結(jié)構(gòu)域（MPP_PP1_PPKL）和特征性序列（LRGNHE），且與其他已鑒定的PP1蛋白具有極高的氨基酸序列相似性，并被聚類到PP1蛋白家族，推測(cè)MiSTPP6是PP1蛋白家族的新成員。由于PP1蛋白和其他家族的PPs一樣，均是通過(guò)蛋白質(zhì)去磷酸化修飾，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝等生命活動(dòng)發(fā)揮重要作用（Kostich et al.，2002;Shi，2009）。MiSTPP6是穩(wěn)定的親水性蛋白，以絲氨酸磷酸化為主。根據(jù)氨基酸磷酸化修飾的作用（Barrero-Gil and Salinas，2013;阮班軍等，2014），推測(cè)MiSTPP6蛋白可通過(guò)絲氨酸磷酸化修飾發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。

已有研究表明，PP1家族基因在植物不同組織中廣泛表達(dá)，其編碼蛋白可定位于細(xì)胞的不同部位，以便于行使其生物學(xué)功能（Verbinnen et al.，2017）。如擬南芥PP1R3基因在不同組織中廣泛表達(dá)，其編碼蛋白又與Ⅰ型蛋白磷酸酶（TOPPs）共定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中（Zhang et al.，2020）。本研究發(fā)現(xiàn)，MiSTPP6基因在澳洲堅(jiān)果的根、莖、葉、小花和小果等不同組織中均有表達(dá)，且其編碼蛋白很可能定位于細(xì)胞質(zhì)，故推測(cè)澳洲堅(jiān)果MiSTPP6在細(xì)胞質(zhì)中調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。

PP1家族基因在植物響應(yīng)脫落酸（ABA）、干旱脅迫、鹽脅迫等逆境脅迫中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，如OsPP1a基因超表達(dá)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽性（Liao et al.，2016）;辣椒CaAIPP1與CaAIRF1互作以調(diào)控ABA信號(hào)和干旱脅迫響應(yīng)（Baek et al.，2017）;擬南芥PP1R3介導(dǎo)ABA反應(yīng)（Zhang et al.，2020）。本研究發(fā)現(xiàn)，澳洲堅(jiān)果幼苗受4 ℃低溫脅迫后，MiSTPP6基因的相對(duì)表達(dá)量整體上呈持續(xù)下降的趨勢(shì)，因此，推測(cè)MiSTPP6可能作為負(fù)調(diào)控因子在澳洲堅(jiān)果抗寒分子機(jī)制中發(fā)揮作用。由于MiSTPP6基因在其他逆境脅迫中的功能研究尚無(wú)報(bào)道。在后續(xù)研究中，應(yīng)通過(guò)亞細(xì)胞定位、過(guò)量或反義表達(dá)等對(duì)MiSTPP6基因功能進(jìn)行深入研究，對(duì)于了解蛋白質(zhì)可逆磷酸化過(guò)程及其在澳洲堅(jiān)果抗逆境脅迫的作用機(jī)制具有重要意義。

4 結(jié)論

MiSTPP6屬于PP1家族基因，具有組織表達(dá)特異性，可能在澳洲堅(jiān)果抗寒分子機(jī)制中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

參考文獻(xiàn)：

蔡元保，楊祥燕，陳顯國(guó)，曾黎明，郭凌飛，林玉虹，崔明勇. 2013. 澳洲堅(jiān)果SCoT反應(yīng)體系的建立及應(yīng)用[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，21（3）：253-258. [Cai Y B，Yang X Y，Chen X G，Zeng L M，Guo L F，Lin Y H，Cui M Y. 2013. Establishment and application of SCoT amplification system for macadamia[J]. Journal of Tropical and Subtropical Botany，21（3）：253-258.] doi：10.3969/j.issn. 1005-3395.2013.03.011.

蔡元保，楊祥燕，孫光明，黃強(qiáng)，劉業(yè)強(qiáng)，李紹鵬，張治禮. 2014. 菠蘿花發(fā)育相關(guān)基因AcMADS1的克隆與組織表達(dá)特性分析[J]. 植物學(xué)報(bào)，49（6）：692-703. [Cai Y B，Yang X Y，Sun G M，Huang Q，Liu Y Q，Li S P，Zhang Z L. 2014. Cloning of flowering-related gene AcMADS1 and characterization of expression in tissues of pineapple（Ananas comosus）[J]. Chinese Bulletin of Botany，49（6）：692-703.] doi：10.3724/SP.J.1259.2014.00692.

阮班軍，代鵬，王偉，孫建斌，張文濤，顏真，楊靜華. 2014. 蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，36（7）：1027-1037. [Ruan B J，Dai P，Wang W，Sun J B，Zhang W T，Yan Z，Yang J H. 2014. Progress on post-translational modification of proteins[J]. Chinese Journal of Cell Biology，36（7）：1027-1037.] doi：10.11844/cjcb. 2014.07.0299.

翁華，冉亮，魏群. 2003. 植物蛋白磷酸酶及其在植物抗逆中的作用[J]. 植物學(xué)通報(bào)，20（5）：609-615. [Weng H，Ran L，Wei Q. 2003. Protein phosphatases and their functions in plant response to environmental stress[J]. Chinese Bulletin of Botany，20（5）：609-615.] doi：10.3969/j.issn.1674- 3466.2003.05.013.

楊倩，楊子平，周婭麗，陳東泉，劉恒. 2020. 澳洲堅(jiān)果實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的篩選[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，41（8）：1505-1512. [Yang Q，Yang Z P，Zou Y L，Chen D Q，Liu H. 2020. Screening of stable reference genes for qRT-PCR analysis in Macadamia integrifolia[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，41（8）：1505-1512.] doi：10.3969/ j.issn.1000-2561.2020.08.001.

Baek D，Min C K，Kumar D，Park B，Cheong M，Choi W，Park H C，Chun H J，Park H J，Lee S Y，Bressan R，Kim J，Yun D. 2019. AtPR5K2，a PR5-Like receptor kinase，modulates plant responses to drought stress by phosphory-lating protein phosphatase 2Cs[J]. Frontiers in Plant Scien-ce，10：1146. doi：10.3389/fpls.2019.01146.

Baek W，Lim C W，Lee S C. 2017. Functional analysis of the pepper protein phosphatase，CaAIPP1，and its interacting partner CaAIRF1：Modulation of ABA signalling and the drought stress response[J]. Plant Cell & Environment，40（10）：2359-2368. doi：10.1111/pce.13039.

Barrero-Gil J，Salinas J. 2013. Post-translational regulation of cold acclimation response[J]. Plant Science，205-206（5）：48-54. doi：10.1016/j.plantsci.2013.01.008.

Buthelezi N M D，Magwaza S L，Tesfay Z S. 2019. Postharvest pre-storage processing improves antioxidants，nutritional and sensory quality of macadamia nuts[J]. Scientia Horticulturae，251（1）：197-208. doi：10.1016/j.scienta. 2019.03.026.

Casamayor A，Ari?o J. 2020. Controlling Ser/Thr protein phosphatase PP1 activity and function through interaction with regulatory subunits[J]. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology，122：231-288. doi：10.1016/bs.apcsb.2020.06.004.

Ceulemans H，Bollen M. 2004. Functional diversity of protein phosphatase-1，a cellular economizer and reset button[J]. Physiological Reviews，84（1）：1-39. doi：10.1152/physrev. 00013.2003.

Farkas I，Dombrádi V，Miskei M，Szabados L，Koncz C. 2007. Arabidopsis PPP family of serine/threonine phosphatases [J]. Trends in Plant Science，12（4）：169-176. doi：10.1016/ j.tplants.2007.03.003.

Guo Y L，Roux S J. 1996. Partial purification and characteri-zation of a type 1 protein phosphatase in purified nuclei of pea plumules[J]. Biochemical Journal，319：985-991. doi：10.1042/bj3190985.

Herbert S W，Walton D A，Wallace H M. 2019. The influence of pollen-parent and carbohydrate availability on macadamia yield and nut size[J]. Scientia Horticulturae，251（1）：241-246. doi：10.1016/j.scienta.2019.03.006.

Jung C，Nguyen N H，Cheong J J. 2020. Transcriptional regulation of protein phosphatase 2C genes to modulate abscisic acid signaling[J]. International Journal of Molecular Sciences，21（24）：9517. doi：10.3390/ijms21249517.

Khan Z H，Agarwal S，Rai A，Memaya M B，Mehrotra S，Mehrotra R. 2020. Co-expression network analysis of protein phosphatase 2A（PP2A） genes with stress-responsive genes in Arabidopsis thaliana reveals 13 key regulators[J]. Scientific Reports，10（1）：21480. doi：10.1038/s41598-020-77746-z.

Kostich M，English J，Madison V，Gheyas F，Wang L，Qiu P，Greene J，Laz T M. 2002. Human members of the eukaryotic protein kinase family[J]. Genome Biology，3（9）：Research0043. doi：10.1186/gb-2002-3-9-research0043.

Krzywińska E，Kulik A，Bucholc M，F(xiàn)ernandez M，Rodriguez P，Dobrowolska G. 2016. Protein phosphatase type 2C PP2CA together with ABI1 inhibits SnRK2.4 activity and regulates plant responses to salinity[J]. Plant Signaling & Behavior，11（12）：e1253647. doi：10.1080/15592324.2016. 1253647.

Liao Y D，Lin K H，Chen C C，Chiang C M. 2016. Oryza sativa protein phosphatase 1a（OsPP1a） involved in salt stress tolerance in transgenic rice[J]. Molecular Breeding，36（3）：22. doi：10.1007/s11032-016-0446-2.

Livak K J，Schmittgen T D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods，25（4）：402-408. doi：10.1006/meth.2001.1262.

Luan S. 2003. Protein phosphatases in plants[J]. Annual Review of Plant Biology，54：63-92. doi：10.1146/annurev.arplant.54.031902.134743.

Máthé C， Garda T，F(xiàn)reytag C，M-Hamvas M. 2019. The role of serine-threonine protein phosphatase PP2A in plant oxi-dative stress signaling-facts and hypotheses[J]. International Journal of Molecular Sciences，20（12）：3028. doi：10.3390/ijms20123028.

Miura K，Ohta M，Nakazawa M，Ono M，Hasegawa P M. 2011. ICE1 Ser403 is necessary for protein stabilization and regulation of cold signaling and tolerance[J]. The Plant Journal，67（2）：269-279. doi：10.1111/j.1365-313X.2011. 04589.x.

Shi Y. 2009. Serine/threonine phosphatases：Mechanism through structure[J]. Cell，139（3）：468-484. doi：10.1016/j.cell.2009. 10.006.

Tan S，Abas M，Verstraeten I，Glanc M，Molnár G，Hajn? J，Lasák P，Pet?ík I，Russinova E，Petrá?ek J，Novák O，Pospí?il J，F(xiàn)riml J. 2020. Salicylic acid targets protein phosphatase 2A to attenuate growth in plants[J]. Current Biology，30（3）：381-395.e8. doi：10.1016/j.cub.2019.11. 058.

Tang W Q，Yuan M，Wang R J，Yang Y H，Wang C，Oses-Prieto J A，Kim T W，Zhou H W，Deng Z，Gampala S S. 2011. PP2A activates brassinosteroid-responsive gene expression and plant growth by dephosphorylating BZR1[J]. Nature Cell Biology，13（2）：124-131. doi：10.1038/ncb2151.

Vazquez-Tello A，Ouellet F，Sarhan F. 1998. Low temperature-stimulated phosphorylation regulates the binding of nuclear factors to the promoter of Wcs120，a cold-specific gene in wheat[J]. Molecular & General Genetics，257（2）：157-166. doi：10.1007/s004380050635.

Verbinnen I，F(xiàn)erreira M，Bollen M. 2017. Biogenesis and activity regulation of protein phosphatase 1[J]. Biochemical Society Transactions，45（1）：89-99. doi：10.1042/BST2016 0154.

Zhang J，Qin Q Q，Nan X H，Guo Z L，Liu Y，Jadoon S，Chen Y，Zhao L L，Yan L F，Hou S. 2020. Role of protein phosphatase 1 regulatory subunit 3（PP1R3） in mediating abscisic acid response[J]. Plant Physiology，184（3）：1317- 1332. doi：10.1104/pp.20.01018.

（責(zé)任編輯 陳 燕）