甘藍(lán)BobHLH121基因克隆、亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析

秦文斌 山溪 張振超 姚悅梅 戴忠良 秦嶺

摘要：【目的】克隆甘藍(lán)bHLH轉(zhuǎn)錄因子（BobHLH121）基因，分析其在不同組織及低溫脅迫下的表達(dá)模式，為深入研究bHLH轉(zhuǎn)錄因子在甘藍(lán)低溫響應(yīng)中的作用機(jī)理提供理論參考。【方法】克隆BobHLH121基因編碼區(qū)（CDS）序列，利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并構(gòu)建pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP融合表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染煙草表皮細(xì)胞，觀察熒光信號(hào)以確定蛋白亞細(xì)胞定位情況。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)BobHLH121基因在低溫脅迫下的相對(duì)表達(dá)量。【結(jié)果】BobHLH121基因CDS長(zhǎng)度為1367 bp，定位于C06染色體上，其編碼311個(gè)氨基酸，蛋白分子量為34.89 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.42，不穩(wěn)定系數(shù)為52.29，疏水性平均系數(shù)為-0.733，說(shuō)明該蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白，且呈酸性，定位于細(xì)胞核。BobHLH121蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋（占30.87%）、延伸鏈（占9.32%）、β-轉(zhuǎn)角（占2.89%）和無(wú)規(guī)則卷曲（占56.91%）組成，具有保守的HLH結(jié)構(gòu)域。BobHLH121蛋白與擬南芥（NP_191768.2）、琴葉擬南芥（EFH52923.1）、亞麻薺（XP_01909381.1）、薺菜（XP_023638997.1）、油菜（CDY65446.1）、白菜（XP_009104362.1）和蘿卜（XP_018442860.1）等多種植物bHLH蛋白的氨基酸相似性分別為55.6%、54.8%、52.0%、50.3%、76.4%、73.9%和61.1%。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，BobHLH121與擬南芥（NP_191768.2）和琴葉擬南芥（EFH52923.1）bHLH蛋白在同一小分支上。BobHLH121基因啟動(dòng)子區(qū)域存在植物生長(zhǎng)發(fā)育、非生物脅迫、激素應(yīng)答和光響應(yīng)大量的順式作用元件。BobHLH121基因在葉片的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織（P<0.05，下同），在其他組織中的相對(duì)表達(dá)量均較低。低溫脅迫6～12 h時(shí)BobHLH121基因的相對(duì)表達(dá)量較低溫處理0 h（對(duì)照）顯著降低，在低溫處理24 h時(shí)急劇升高，顯著高于其他處理時(shí)間，低溫處理48 h時(shí)又顯著降低，表明該基因可能在低溫脅迫下延遲表達(dá)?！窘Y(jié)論】BobHLH121基因含有bHLH家族典型的HLH保守結(jié)構(gòu)域序列，具有明顯的組織表達(dá)特異性，可能參與甘藍(lán)葉片的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控，且響應(yīng)低溫脅迫，可能在甘藍(lán)耐寒性中發(fā)揮調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞： 甘藍(lán);BobHLH121基因;亞細(xì)胞定位;低溫脅迫;基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： S635.036? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）12-3320-10

Cloning，subcellular localization and expression analysis of BobHLH121 gene from Brassica oleracea L.

QIN Wen-bin， SHAN Xi， ZHANG Zhen-chao， YAO Yue-mei，

DAI Zhong-liang*， QIN Ling

（Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences in Hilly Area， Jurong， Jiangsu? 212400， China）

Abstract：【Objective】The whole length of Brassica oleracea L. bHLH transcription （BobHLH121 gene） was cloned by homologous cloning method，and its expression pattern under organ/tissue and low temperature stress was analyzed，which provided theoretical reference for studying the mechanism of bHLH transcription factor in low temperature response. 【Method】The sequence of the coding region（CDS） of BobHLH121 gene was cloned， the prediction analysis was performed using bioinformatics software， and the pCAMBIA1300-BobHLH121-GFP fusion expression vector was construc-ted through the transfection of tobacco epidermal cells， and the fluorescent signal was observed to determine the subcellular localization of the protein. The relative expression of the BobHLH121 gene under low temperature stress was measured using real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR）. 【Result】 The CDS length of BobHLH121 gene was 1367 bp， localized on chromosome C06， encoding 311 amino acids， protein molecular weight of 34.89 kD， theoretical isoelectric point （pI） was 5.42， the instability coefficient was 52.29， and the average hydrophobicity was -0.733， indicating that the protein was an unstable hydrophilic protein， which was acidic and localized in the nucleus. The secondary structure of BobHLH121 protein mainly consisted of α-helix （30.87%）， extended chain （9.32%），β-turn （2.89%） and random coil （56.91%）， with a conserved HLH domain. BobHLH121 protein was closely related to bHLH proteins in Arabidopsis thaliana （NP_191768.2）， A. lyrata （EFH52923.1），Camelina sativa? （XP_01909381.1），Capsella brusa-pastoris （XP_023638997.1），B. napus（CDY65446.1），Chinese cabbage （XP_009104362.1） and radish （XP_018442860.1）， and had amino acid similarities of 55.6%，54.8%，52.0%，50.3%，76.4%，73.9% and 61.1%，respectively. Phylogenetic tree analysis showed that BobHLH121 was on the same small clade as the A. thaliana （NP_191768.2） and A. lyrata （EFH52923.1） bHLH protein. A large number of cis-acting elements for plant growth and development， abiotic stress， hormone response， and light response existed in the promoter region of the BobHLH121 gene. The relative expression of the Bo-bHLH121 gene was significantly higher in leaves than in other tissues （P<0.05， the same below） and lower in all other tissues. The relative expression of BobHLH121 gene was significantly decreased under low temperature treatment for 6-12 h under low temperature treatment at 0 h （control）， and increased sharply at 24 h under low temperature treatment， which was significantly higher than that of other treatments， and decreased significantly at 48 h under low temperature treatment. It indicated that the gene might be delayed in expression under low temperature stress. 【Conclusion】BobHLH121 has a conserved HLH domain typical of the bHLH family， has obvious tissue expression specificity， may participate in the re-gulation of growth and development of cabbage leaves， and respond to low temperature stress， may play a regulatory role in cabbage cold tolerance.

Key words： Brassica oleracea L.; BobHLH121 gene; subcellular localization; low temperature stress; gene expression

Foundation item：Jiangsu Science and Technology Plan Project（BE2020403）; Zhenjiang Science and Technology Plan Project（NY2020001）

0 引言

【研究意義】堿性螺旋-環(huán)-螺旋（Basic helix-loop-helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子是一類廣泛存在于真核生物中的調(diào)節(jié)蛋白超家族，其家族成員具有高度保守的HLH結(jié)構(gòu)域（Toledo-Ortiz et al.，2003;Li et al.，2006），通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控或核定位等相關(guān)功能激活或抑制相關(guān)的下游基因，從而調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程以及生物和非生物脅迫響應(yīng)（Agarwal et al.，2006a;Feller et al.，2011;Gong et al.，2015）。甘藍(lán)（Brassica oleracea L.）為十字花科蕓薹屬植物，在我國(guó)廣泛種植，年種植面積達(dá)到90萬(wàn)ha左右，但多為露地栽培，極易遭受冷害、日灼、病蟲(chóng)害等多種非生物和生物脅迫。其中，低溫脅迫可改變植物細(xì)胞內(nèi)蛋白結(jié)構(gòu)和活性，從而影響光合作用等一系列酶促反應(yīng)的速率，最終導(dǎo)致植株葉片萎蔫黃化等現(xiàn)象（Miura and Furumoto，2013）。因此，開(kāi)展甘藍(lán)bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因克隆及低溫脅迫下表達(dá)模式研究，以期挖掘其抗逆基因，對(duì)改良甘藍(lán)品種抗性具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著不同植物基因組測(cè)序的完成，擬南芥（Carretero-paulet et al.，2010）、大白菜（Song et al.，2014）、番茄（Sun et al.，2015;Wang et al.，2015）、蘋(píng)果（Mao et al.，2017）等植物中bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員已被鑒定。研究發(fā)現(xiàn)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與花青素的生物合成（Toledo-Ortiz et al.，2003;Gonzalez et al.，2008;Pires and Dolan，2010）、生物與非生物脅迫（Sorensen et al.，2003;Hichri et al.，2011）、植物器官發(fā)育（Goossens et al.，2017;Takahashi et al.，2017）等。bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白具有高度保守的bHLH結(jié)構(gòu)域，其長(zhǎng)度約為50～60個(gè)氨基酸，分為2個(gè)不同的區(qū)域，即堿性區(qū)域和螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)域（HLH），其中，N-端的堿性區(qū)域包含13～17個(gè)親水性的堿性氨基酸，具有與DNA識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，參與DNA結(jié)合（Mao et al.，2017）。植物感知低溫后，會(huì)將冷信號(hào)通過(guò)低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑傳遞下去，最終誘導(dǎo)冷脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，增加植株適應(yīng)性，而CBF依賴的冷信號(hào)途徑普遍存在于高等植物中，現(xiàn)已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)（劉雙等，2017）。擬南芥的ICE（Inducer of CBF expression）是CBF低溫響應(yīng)通道上游的調(diào)控基因，編碼一個(gè)類似MYC bHLH結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子（Kurbidaeva et al.，2015）。擬南芥中有2個(gè)ICE基因（AtICE1和AtICE2），其中AtICE1基因正調(diào)控CBF3信號(hào)途徑，通過(guò)與MYB15蛋白互作，抑制MYB15對(duì)CBF的負(fù)調(diào)控作用（Kurbidaeva et al.，2015）;AtICE2基因則通過(guò)調(diào)節(jié)CBF1基因表達(dá)來(lái)正調(diào)控植物的低溫響應(yīng)（Agarwal et al.，2006b）。此外，Li等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，水稻OrbHLH001基因在擬南芥中過(guò)量表達(dá)時(shí)，顯著提高了擬南芥的抗寒能力。Chen等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，菊花bHLH家族基因CdICE1在低溫、干旱和鹽脅迫中均具有調(diào)控作用。Guo和Wang（2017）研究發(fā)現(xiàn)，小麥WbHLH046基因能被低溫誘導(dǎo)，在低溫脅迫下表達(dá)量顯著升高。Man等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，水稻ICE1基因受低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能驗(yàn)證等研究已有很大進(jìn)展，但bHLH家族成員眾多，且不同植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和調(diào)控功能變化多樣。目前，甘藍(lán)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究鮮少，甘藍(lán)bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與非生物脅迫響應(yīng)的研究在甘藍(lán)中未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】基于甘藍(lán)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的生物信息學(xué)分析結(jié)果，利用同源克隆的方法克隆BobHLH121基因編碼區(qū)（CDS）序列，并通過(guò)構(gòu)建pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP融合表達(dá)載體確定蛋白亞細(xì)胞定位情況，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)Bo-bHLH121基因在不同組織及低溫脅迫下的相對(duì)表達(dá)量，為深入研究bHLH轉(zhuǎn)錄因子在甘藍(lán)生長(zhǎng)發(fā)育及低溫脅迫的作用機(jī)制提供理論參考，對(duì)提高甘藍(lán)產(chǎn)量和抗性具有重要意義。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試的甘藍(lán)材料由江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供?？俁NA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、T4 DNA連接酶和pMD18-T質(zhì)粒載體等均購(gòu)自TaKaRa公司;DNA回收純化試劑盒購(gòu)自諾維贊生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：光照培養(yǎng)箱（南京恒裕儀器設(shè)備制造有限公司）、PCR儀（蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司）、凝膠成像系統(tǒng)（上海培清科技有限公司）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（QuantStudio3，美國(guó)）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 樣品采集 種子發(fā)芽后播種于基質(zhì)中，在人工氣候室中進(jìn)行生長(zhǎng)（白天25 ℃/夜晚18 ℃，光照14 h/黑暗10 h），待植株長(zhǎng)至五葉一心時(shí)進(jìn)行4 ℃低溫脅迫處理（每個(gè)處理至少選取18株）。將幼苗移至春化室中低溫處理0（對(duì)照）、6、12和24 h后取樣，取每株頂端第三片完全展開(kāi)的葉片，使用液氮迅速冷凍，保存于-80 ℃冰箱。

1. 2. 2 BobHLH121基因克隆 稱取2份新鮮葉片0.1 g，分別用于RNA和DNA提取。以RNA為模板，使用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。采用CTAB法提取葉片總DNA。

從甘藍(lán)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Bolbase，http：//brassicadb.org/brad/index.php）下載BobHLH121（Bol010854）基因編碼區(qū)（CDS）序列，使用Primer Premier 5.1設(shè)計(jì)引物（表1），委托金斯瑞生物科技有限公司合成引物。以甘藍(lán)葉片DNA為模板進(jìn)行BobHLH121基因的擴(kuò)增。反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.0 μL，40 ng/μL DNA模板1.0 μL，10 μmol/L正、反向引物（BobHLH121-1-F/BobHLH121-1-R）各1.0 μL，2 mmol/L dNTP 2.0 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，Taq聚合酶0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并使用凝膠成像儀拍照。利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收純化目的片段，將其連接至pMD18-T后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。使用LB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素）進(jìn)行菌落篩選，挑選陽(yáng)性克隆送往南京斯普金生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1. 2. 3 生物信息學(xué)分析 在甘藍(lán)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索BobHLH121基因的CDS、DNA和蛋白序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST搜索同源序列。使用MEGA 6.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap值設(shè)置為1000，其他參數(shù)為默認(rèn)值。使用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì)。使用Mapchart繪制BobHLH121基因在染色體上的位置。利用New PLACE（https：//sogo.dna.affrc.go.jp/）分析BobHLH121起始密碼子上游2000 bp序列中順式作用元件;使用SOPMA（http：//npsa-pbi.libcp.fr/cgi-bin/secpred-sopma.pl）預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu);使用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）、BacelLo（http：//gpcr.biocomp.unibo.it/bacello/pred.htm）和PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/）進(jìn)行Bo-bHLH121亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1. 2. 4 BobHLH121基因在不同組織及低溫脅迫下的表達(dá)分析 BobHLH121基因在甘藍(lán)不同組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)均從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載（登錄號(hào)：GSE42891）。根據(jù)BobHLH121基因序列，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異引物（BobHLH121-2-F/Bo-bHLH121-2-R）（表1），選用甘藍(lán)GAPDH為內(nèi)參基因（Brulle et al.，2014），并委托金斯瑞生物科技有限公司合成引物。以甘藍(lán)葉片的cDNA第一條鏈為模板，使用熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM II，檢測(cè)BobHLH121基因在不同低溫處理時(shí)間下的表達(dá)量。反應(yīng)體系：40 ng/μL cDNA模板1.0 μL、0.2 μmol/L正、反向引物（BobHLH121-2-F/BobHLH121-2-R）各1.0 μL，SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL，ddH2O補(bǔ)足20.0 μL。PCR擴(kuò)增采用兩步法：95 ℃ 5 s，60 ℃ 20.0 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);熔解曲線分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s。

1. 2. 5 亞細(xì)胞定位 根據(jù)BobHLH121基因序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物（BobHLH121-3-F/Bo-bHLH121-3-R）（表1），以攜帶目的基因序列的克隆載體pMD18-T為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收純化目的片段。分別使用Sac I和Xba I酶切帶有熒光蛋白（GFP）基因的質(zhì)粒載體PCAMBIA2300-GFP和目的片段，然后用T4連接酶連接，構(gòu)建融合表達(dá)載體PCAMBIA2300-GFP-BobHLH121（賀丹等，2021），將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌GV3101。將農(nóng)桿菌菌液注射煙草葉片，暗培養(yǎng)72 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察葉片中熒光信號(hào)。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算BobHLH121基因的相對(duì)表達(dá)量。采用GraphPad Prism 5.0整理分析數(shù)據(jù)及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 BobHLH121基因克隆結(jié)果

以甘藍(lán)葉片DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。BobHLH121基因CDS長(zhǎng)度為1367 bp，編碼311個(gè)氨基酸殘基?；厥漳康臈l帶的測(cè)序結(jié)果與甘藍(lán)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中Bol010854基因CDS的序列完全一致，表明克隆片段為目的基因。

2. 2 染色體定位結(jié)果

在甘藍(lán)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索BobHLH121基因信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因定位于C06染色體上（圖2），基因位置信息為C06：16463282-16464648（-），屬于MF2亞組上的反義鏈基因。BobHLH121是個(gè)雙拷貝基因，與白菜和擬南芥的同源基因之間具有相同的共線性區(qū)塊（圖3）。

2. 3 啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果

利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)BobHLH121基因的上游2000 bp啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件，結(jié)果（表2）顯示，BobHLH121基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在大量的順式作用元件，主要分為植物生長(zhǎng)發(fā)育、非生物脅迫、激素應(yīng)答和光響應(yīng)四種類型。

2. 4 理化性質(zhì)分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

根據(jù)ExPASy在線工具推測(cè)BobHLH121蛋白的分子式為C1510H2389N421O494S17，分子量為34.89 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.42，不穩(wěn)定系數(shù)為52.29，疏水性平均系數(shù)為-0.733，說(shuō)明該蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白，且呈酸性。使用SOPMA在線工具預(yù)測(cè)Bo-bHLH121蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4所示。Bo-bHLH121蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)比較豐富，主要由α-螺旋（占30.87%）、延伸鏈（占9.32%）、β-轉(zhuǎn)角（占2.89%）和無(wú)規(guī)則卷曲（占56.91%）組成，說(shuō)明α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是該蛋白多肽鏈中主要的結(jié)構(gòu)元件。

2. 5 序列比對(duì)及同源分析結(jié)果

SMART分析結(jié)果顯示，BobHLH121蛋白具有保守的HLH結(jié)構(gòu)域（圖5）。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST搜索BobHLH121蛋白的同源序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bo-bHLH121蛋白與擬南芥（NP_191768.2）、琴葉擬南芥（EFH52923.1）、亞麻薺（XP_01909381.1）、薺菜（XP_023638997.1）、油菜（CDY65446.1）、白菜（XP_009104362.1）和蘿卜（XP_018442860.1）等多種植物bHLH蛋白的氨基酸相似性分別為55.6%、54.8%、52.0%、50.3%、76.4%、73.9%和61.1%（圖6）。由圖7可知，BobHLH121與擬南芥（NP_191768.2）和琴葉擬南芥（EFH52923.1） bHLH蛋白在同一小分支上。

2. 6 亞細(xì)胞定位分析結(jié)果

Plant-mPLoc、BacelLo和PredictProtein預(yù)測(cè)結(jié)果均顯示，BobHLH121蛋白定位于細(xì)胞核中。將PCAMBIA2300-GFP-BobHLH121融合表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染煙草葉片表皮細(xì)胞，從而獲得煙草瞬時(shí)表達(dá)體系，通過(guò)觀察熒光信號(hào)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)明顯的綠色熒光，處理組僅在煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞核檢測(cè)到綠色熒光信號(hào)，即BobHLH121蛋白定位于細(xì)胞核中（圖8），表明Bo-bHLH121具有核蛋白的功能。

2. 7 BobHLH121基因組織表達(dá)分析結(jié)果

BobHLH121基因在甘藍(lán)愈傷組織、根、莖、葉、芽、花和角果中的表達(dá)模式如圖9所示。BobHLH121基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量存在明顯差異，其中在葉片的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織（P<0.05，下同），在其他組織中的相對(duì)表達(dá)量均較低，尤其是在花中的相對(duì)表達(dá)量最低，表明BobHLH121基因可能參與甘藍(lán)葉片的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控。

2. 8 BobHLH121基因在低溫脅迫下的表達(dá)分析結(jié)果

對(duì)BobHLH121基因在低溫脅迫下甘藍(lán)幼葉中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果如圖10所示。低溫脅迫6～12 h時(shí)BobHLH121基因的相對(duì)表達(dá)量較低溫處理0 h（對(duì)照）顯著降低，低溫處理24 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量急劇升高，顯著高于其他處理時(shí)間，低溫處理48 h時(shí)又顯著降低，表明BobHLH121基因可能在低溫脅迫下延遲表達(dá)，響應(yīng)24 h才被激活表達(dá)。

3 討論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中的第二大轉(zhuǎn)錄因子家族，在光合作用、光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、色素生物合成、種子發(fā)育和脅迫響應(yīng)等過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。有關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的非生物脅迫響應(yīng)研究在擬南芥（Xiang et al.，2008）、水稻（Liu and Zhou，2018）等模式植物中已廣泛展開(kāi)，但甘藍(lán)中鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究從甘藍(lán)克隆獲得BobHLH121基因CDS全長(zhǎng)為1367 bp，其編碼的氨基酸序列中具有HLH保守結(jié)構(gòu)域，是bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族典型的結(jié)構(gòu)特征。HLH保守結(jié)構(gòu)域主要參與結(jié)合下游基因中啟動(dòng)子區(qū)域的E-box/G-box順式作用元件。BobHLH121蛋白與擬南芥bHLH家族Ia組蛋白的氨基酸序列相似性較高（Shan et al.，2019）。將BobHLH121與其他植物的bHLH蛋白進(jìn)行比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bo-bHLH121與擬南芥和琴葉擬南芥bHLH蛋白聚在一個(gè)分支上。BobHLH121蛋白與擬南芥bHLH蛋白（NP_191768.2）的氨基酸相似性分別為55.6%，推測(cè)甘藍(lán)與擬南芥發(fā)生基因分化之后，出現(xiàn)了基因復(fù)制和基因丟失的現(xiàn)象，導(dǎo)致基因的多樣化和功能分化。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，BobHLH121蛋白定位在細(xì)胞核，表明BobHLH121具有核蛋白功能，推測(cè)其主要功能是在細(xì)胞核中調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而調(diào)控甘藍(lán)在低溫脅迫下的響應(yīng)（劉海霞等，2010;豆玉娟等，2014）。因此，今后深入研究BobHLH121蛋白的生物學(xué)功能。

啟動(dòng)子順式作用元件可調(diào)控基因的表達(dá)模式（Saeed et al.，2006），且與多種脅迫響應(yīng)的基因密切相關(guān)（Walther et al.，2007;Le et al.，2012）。啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的2000 bp片段，對(duì)結(jié)合靶基因具有重要影響（Fang et al.，2008;Wu et al.，2012）。本研究發(fā)現(xiàn)BobHLH121基因的啟動(dòng)子區(qū)域有許多激素應(yīng)答相關(guān)的元件，表明BobHLH121基因可能在脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）和茉莉酸甲酯（MeJA）信號(hào)通路中發(fā)揮積極作用。擬南芥AtICE2基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在許多與非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，且在低溫響應(yīng)中發(fā)揮重要的作用（Sorensen et al.，2003）。而B(niǎo)obHLH121基因的啟動(dòng)子區(qū)域也包含LTR等低溫響應(yīng)元件。目前已有大量研究證明，在脅迫條件下，部分bHLH轉(zhuǎn)錄因子被激活并結(jié)合到參與各種信號(hào)通路的關(guān)鍵基因啟動(dòng)子上，進(jìn)而通過(guò)調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)調(diào)節(jié)植物的抗逆性（Lu et al.，2017）。例如，擬南芥AtICE1（AtbHLH116）能識(shí)別CBF3基因啟動(dòng)子序列中的MYC位點(diǎn)（CANNTG），誘導(dǎo)CBF3基因的表達(dá)，提高擬南芥對(duì)低溫脅迫的抗性（Badawi et al.，2008）。Feng等（2012）從蘋(píng)果中獲得AtICE1的同源蛋白（MdCIbHLH1），其與DREB家族基因MdCBF2啟動(dòng)子區(qū)域的MYC識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致MdCBF2基因表達(dá)上調(diào)，從而提高了蘋(píng)果的低溫耐性。Nakamura等（2011）研究發(fā)現(xiàn)在低溫處理下水稻OsICE1和OsICE2蛋白可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子基因OsDREB1B和OsHSFA3的表達(dá)上調(diào)，可調(diào)控植株的低溫耐受性。李宇偉等（2012）在蒺藜苜蓿中發(fā)現(xiàn)1個(gè)低溫響應(yīng)基因MtbHLH1，在4 ℃低溫脅迫下，不同處理時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量具有明顯的差異性。本研究通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BobHLH121基因在低溫處理24 h的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，說(shuō)明BobHLH121基因參與調(diào)控低溫脅迫響應(yīng)，今后應(yīng)深入研究揭示其低溫響應(yīng)機(jī)制。

4 結(jié)論

BobHLH121基因含有bHLH家族典型的HLH保守結(jié)構(gòu)域序列，具有明顯的組織表達(dá)特異性，可能參與甘藍(lán)葉片的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控，且響應(yīng)低溫脅迫，可能在甘藍(lán)耐寒性中發(fā)揮調(diào)控作用。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）