8 周游泳運動對2 型糖尿病大鼠海馬胰島素抵抗的影響及機制

鄧鵬輝，劉 霞，譚倩宇

（湖南師范大學(xué)體育學(xué)院 體適能與運動康復(fù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙410012）

相關(guān)研究人員預(yù)計至2045 年， 全球糖尿病人群將達到6.93 億［1］。 同時，不斷有學(xué)者將阿爾茨海默病稱之為“3 型糖尿病”，并指出其與2 型糖尿病的內(nèi)在聯(lián)系體現(xiàn)在海馬胰島素抵抗［2］。因此海馬胰島素抵抗可能是2 型糖尿病所累及的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變及認知功能改變的重要機制之一。

針對胰島素抵抗的機制研究， 巨噬細胞分泌的TNFα 和IL1β 曾被認為是導(dǎo)致胰島素抵抗的關(guān)鍵因子，然而，采用抑制此二者方法的臨床試驗所取得的療效有限［3-5］。 目前，有研究指出半乳糖甘凝集素3（Gal-3）在誘導(dǎo)病理性胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色， 并指出Gal-3 通過C 端的碳水化合物識別區(qū)域與糖基化的胰島素受體結(jié)合， 降低其酪氨酸磷酸化，從而干擾胰島素信號通路，最終導(dǎo)致IR［6］。 半乳糖苷凝集素-3 在正常大腦中的表達較弱。 研究發(fā)現(xiàn)，Gal-3 在成年大鼠海馬中表達，并且在高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠海馬中g(shù)al-3 水平上升，同時伴隨著海馬組織胰島素抵抗，紫甘薯色素干預(yù)可使海馬組織中Gal-3 表達下調(diào)， 并以此改善海馬組織胰島素抵抗［7］。

另外，脂聯(lián)素在抗胰島素抵抗過程中同樣扮演重要角色。脂聯(lián)素是脂肪組織分泌的主要蛋白質(zhì)之一， 其通過與受體結(jié)合發(fā)揮胰島素增敏作用， 在胰島素抵抗相關(guān)疾病中均發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素和脂聯(lián)素受體活性下調(diào)［8］。 早年研究顯示，脂聯(lián)素敲除大鼠中肌肉表現(xiàn)出嚴重的胰島素抵抗， 具體表現(xiàn)為胰島素受體底物1（IRS-1）以及磷脂酰3-激酶（PI3K）活性下降［9］；運動干預(yù)，因其具有降血糖及降T2DM 發(fā)病率等作用，其在2 型糖尿病海馬胰島素抵抗的發(fā)病及其運動干預(yù)機制中是否發(fā)揮作用，本文將對此進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與分組

本實驗以6 周齡雄性SD 大鼠為對象， 體重150～190g，（購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司（S（XK（湘）2014-0011））每籠5～6 只，自然光，每天定時更換墊料。 實驗前適應(yīng)喂養(yǎng)3天，后隨機分為兩組：空白對照組（NC 組，n=10），糖尿病模型組（DM 組，n=30）。 DM 組采用高脂膳食飼養(yǎng)基礎(chǔ)上，自由進食。高脂喂養(yǎng)4 周后，DM 組大鼠禁食、禁水后按40mg/kg 劑量注射1%STZ。 一周后測大鼠尾靜脈空腹血糖濃度， 超過7.8mmol/L，說明建模成功。 建模成功后恢復(fù)正常飲食。 并將大鼠分為糖尿病對照組（DM 組，n=7）和糖尿病運動組（DME 組，n=7）。

1.2 運動方案

DME 組大鼠每天進行無負重游泳訓(xùn)練60min，每周6 天，休息一天，共8 周。 前一周為適應(yīng)周，一周內(nèi)訓(xùn)練時間過渡到60min。 訓(xùn)練過程中，時刻觀察大鼠狀態(tài)，防溺死，并及時撈出大鼠糞便，保持水清潔衛(wèi)生。 運動結(jié)束后用干毛巾迅速吸水，并吹干放回籠中。

1.3 實驗取材

取材于末次訓(xùn)練后12h 進行，禁食禁水。 以2.5ml/kg 的劑量，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，隨后胸主動脈取血，放入血清促凝管中。 靜止半小時，在4℃，4 000r/min 離心，取上清液保存于－20℃冰箱，待測。 取大鼠海馬組織放入凍存管內(nèi)迅速投入液氮，后放于－80℃冰箱冷凍待測。

1.4 指標檢測

1.4.1 血清FBG、INS 含量的測定

血清FBG 采用葡萄糖氧化酶法，測定儀器為紫外分光光度計，試劑盒購買于南京建成生物工程研究所；血清INS 的含量用酶聯(lián)免疫法測定， 試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司。 胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=空腹胰島素（INS）×空腹血糖（FBG）/22.5≥2.69 有胰島素抵抗。

1.4.2 海馬組織Galectin-3、IRS-1、PI3K、Akt、Adiponectin、AMPK、GLUT4mRNA 表達量的測定

采用Real-time PCR 法測定， 使用總RNA 提取試劑盒（Evo M-MLV RT Premix for qPCR），反轉(zhuǎn)錄成cDNA（Evo MMLV RT Premix for qPCR 試劑盒）， 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s；60℃退火34 s；重復(fù)40 個循環(huán)；添加溶解曲線。程序運行結(jié)束后，將目的基因的Ct 值與內(nèi)參GAPDH 進行標準化，計算出目的基因的相對表達量。PCR 引物序列均由上海生物工程有限公司設(shè)計并合成，引物序列見下表1。

表1 RT-PCR 特異性引物序列表

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究應(yīng)用SPSS17.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理， 采用SPSS 統(tǒng)計軟件進行獨立樣本方差分析。 p<0.05 為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，p<0.01 為差異具有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 研究結(jié)果

2.1 實驗大鼠血清FBG、INS、HOMA-IR 的含量

從表2、圖1 可知，與NC 組相比，DM 組大鼠血清FBG、HOMA-IR 的含量顯著增加（p＜0.01），而大鼠血清INS 含量減少，且無顯著差異（p>0.05）；與DM 組相比，DME 組大鼠血清FBG、HOMA-IR 的含量顯著減少（p＜0.05）、而大鼠血清INS、含量減少，但無顯著差異（p>0.05）。

圖1 實驗大鼠血清中FBG、INS、HOMA-IR 的含量

2.2 各組實驗大鼠海馬Galectin-3、IRS-1、PI3K、AktmRNA 表達水平

如表3 及圖2 所示，實驗8 周后，與NC 組相比，DMC 組大鼠Galectin-3、IRS-1mRNA 表達水平顯著升高 （p＜0.05；p＜0.01），PI3K mRNA 表達水平非常顯著降低（p＜0.01），AKtmRNA 表達水平無顯著性變化，但有明顯的下降趨勢。與DMC 組相比，DME 組大鼠Galectin-3mRNA 表達水平顯著降低 （p＜0.05）， 而PI3KmRNA 表達水平呈非常顯著增加 （p＜0.01），IRS-1 及AKt mRNA 表達水平無顯著性變化。

表2 實驗大鼠血清FBG、INS、HOMA-IR 含量

表3 各組實驗大鼠海馬Galectin-3、IRS-1、PI3K、AktmRNA 表達水平

圖2 各組實驗大鼠海馬Galectin-3、IRS-1、PI3K、AktmRNA 表達水平

2.3 各組實驗大鼠海馬Adiponectin、AMPK、GLUT4-mRNA 表達水平

如表4 及圖3 所示，實驗8 周后，較NC 組，DMC 組大鼠海馬組織GLUT4 及Adiponectin （脂聯(lián)素）mRNA 表達水平非常顯著降低 （p＜0.01），AMPKmRNA 表達水平無顯著性變化，但存在有明顯的下降趨勢。 較DMC 組，DME 組大鼠海馬組織、GLUT4 及Adiponectin mRNA 表達水平呈顯著增加 （p＜0.01；p＜0.05），AMPK mRNA 表達水平無顯著性變化， 但仍存在改善趨勢。

表4 各組實驗大鼠海馬Adiponectin、AMPK、GLUT4mRNA表達水平

圖3 各組實驗大鼠海馬Adiponectin、AMPK、GLUT4mRNA表達水平

3 分析與討論

3.1 2 型糖尿病大鼠模型的復(fù)制以及海馬胰島素抵抗相關(guān)指標的變化

本次模型的建立采用清潔級大鼠， 通過高脂喂養(yǎng)以及藥物干預(yù)建立模型。 這種方法能夠更好地模擬人類2 型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展的過程，以及縮短發(fā)病周期。 此模型的特點主要在于：1） 高脂飼料可以誘導(dǎo)實驗大鼠發(fā)生高血脂癥以及胰島素抵抗，避免了1 型糖尿病的發(fā)生。 2）STZ 對于實驗動物的胰島細胞有高選擇性毒副作用， 一定劑量的STZ 可以使胰島β細胞受損，胰島素合成和分泌能力降低，從而使血糖升高，形成2 型糖尿病。 本實驗DMC 組FBG 顯著性高于NC 組 （p＜0.01）， 而DME 組FBG 顯著性低于DMC 組 （p＜0.05）。 盡管NC、DMC 和DME 組胰島素 （Ins） 水平無顯著性變化， 但是DMC 組和DME 組大鼠HOMA-IR 顯著性高于NC 組（p＜0.01，p＜0.05），同時較DMC 組大鼠，DME 組HOMA-IR 顯著性降低（p＜0.05）。本實驗結(jié)果表明，2 型糖尿病造模成功。多數(shù)研究支持IRS-1、PI3K、AKt 作為評定組織性胰島素抵抗的黃金指標。本研究發(fā)現(xiàn)， 該實驗所建立的2 型糖尿病大鼠大鼠模型海馬組織存在胰島素抵抗，具體表現(xiàn)為，DMC 組較NC 組大鼠海馬組織、IRS-1mRNA 表達水平顯著性升高（p＜0.05），PI3KmRNA表達水平非常顯著降低（p＜0.01），可見，糖尿病大鼠海馬組織存在胰島素抵抗。

3.2 有氧運動通過半乳糖苷凝集素3（Gal-3）改善2 型糖尿病大鼠海馬胰島素抵抗

多項研究指出半乳糖苷凝集素3（Gal-3）與胰島素抵抗密切相關(guān)。 乳糖苷凝集素3（Galectin-3，Gal-3）屬于半乳糖苷凝集素Galectins 家族的一員，該家族是一類可結(jié)合β-半乳糖苷的動物凝集素，由巨噬細胞等免疫細胞分泌，在諸如免疫和炎癥應(yīng)答、 腫瘤發(fā)生和生長等多種生理和病理過程中都起著重要作用。 研究發(fā)現(xiàn)，Gal-3 通過C 端的碳水化合物識別區(qū)域與糖基化的胰島素受體結(jié)合，降低其酪氨酸磷酸化，以此干擾胰島素信號通路，最終導(dǎo)致IR［10］。靶向Gal3 的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論敲除Gal-3 基因還是給予Gal-3 抑制劑都能明顯改善肥胖小鼠的IR。半乳糖苷凝集素-3 在患肥胖和2 型糖尿病的人及鼠類體內(nèi)高表達；半乳糖苷凝集素-3 在2 型糖尿病患者體內(nèi)的表達水平顯著升高。 半乳糖苷凝集素-3 在肥胖癥和2 型糖尿病患者體內(nèi)表達量顯著升高且無性別差異， 并與2 型糖尿病患者體內(nèi)的糖化血紅蛋白（HbA1c）含量呈負相關(guān)。 并且在糖尿病患者研究中發(fā)現(xiàn)，gal-3 水平與空腹胰島素（r＝-0.56，p＜0.01）、胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)模型評價（r＝-0.52，p＜0.05）和胰島素敏感性指數(shù)（r＝0.62，p＜0.005）均顯著相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Gal-3 在成年大鼠海馬中表達，并且在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠海馬中g(shù)al-3水平上升，同時伴隨著海馬組織胰島素抵抗，紫甘薯色素干預(yù)可使海馬組織中Gal-3 表達下調(diào)， 并以此改善海馬組織胰島素抵抗及其認知功能障礙［7］。 上述研究提示：海馬胰島素抵抗的發(fā)生可能由海馬組織中Gal-3 水平升高誘發(fā)的。 本研究結(jié)果顯示， 較NC 組，DMC 組大鼠Galectin-3、IRS-1mRNA 表達水平顯著性升高 （p＜0.05）； 同時， 較DMC 組，DME 組大鼠Galectin-3mRNA 表達水平顯著性降低。

3.3 有氧運動通過脂聯(lián)素/AMPK/GLUT4 信號通路改善2 型糖尿病大鼠海馬胰島素抵抗

本研究結(jié)果顯示， 海馬胰島素抵抗不僅與半乳糖苷凝集素3（Gal-3）密切相關(guān)，同時脂聯(lián)素/AMPK/GLUT4 信號通路在海馬胰島素抵抗發(fā)生、發(fā)展中同樣扮演重要角色。 較NC 組，DMC 組大鼠海馬組織GLUT4 及Adiponectin mRNA 表達水平呈顯著性降低（p＜0.05），盡管AMPKmRNA 表達水平無顯著性變化，但有明顯的下降趨勢。 同時，較DMC 組，DME 組大鼠海馬組織GLUT4 及Adiponectin mRNA 表達水平呈顯著性增加，盡管AMPK mRNA 表達水平無顯著性變化， 但仍存在改善趨勢。 本實驗結(jié)果提示：脂聯(lián)素/AMPK/GLUT4 信號通路在2 型糖尿病大鼠海馬組織胰島素抵抗的發(fā)生、 發(fā)展以及運動干預(yù)改善2 型糖尿病大鼠海馬組織胰島素抵抗扮演重要角色。 同時，近年來，多項研究指出，脂聯(lián)素/AMPK/GLUT4 信號通路與胰島素抵抗密切相關(guān)。 具體地說，目前，已發(fā)現(xiàn)10 余個脂聯(lián)素基因常見的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）及一些罕見的錯義突變，它們與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)。 在2 型糖尿病、肥胖癥、動脈粥樣硬化和脂代謝紊亂等胰島素抵抗相關(guān)疾病中， 血漿脂聯(lián)素水平均明顯下降， 并且血漿脂聯(lián)素水平的下降和胰島素抵抗的發(fā)展相平行［11］；通過給嚴重胰島素抵抗的脂肪萎縮小鼠注射基因重組的脂聯(lián)素后發(fā)現(xiàn)，骨骼肌胰島素受體和Akt激酶磷酸化以及IRS- 1 酪氨酸磷酸化明顯增加。 動物實驗也證明，脂聯(lián)素基因敲除小鼠肌肉中PI3K 活性明顯降低，通過腺病毒載體轉(zhuǎn)染的方法提高血漿脂聯(lián)素水平后可顯著提高肌肉中PI3K 的活性，其胰島素敏感性明顯增加［12］。 上述研究結(jié)果提示，脂聯(lián)素與胰島素抵抗密切相關(guān)，同時目前多數(shù)研究多集中在脂聯(lián)素與外周胰島素抵抗的關(guān)系， 本研究結(jié)果提示脂聯(lián)素同樣與中樞胰島素抵抗密切相關(guān)，同時，運動干預(yù)具有改善中樞脂聯(lián)素/AMPK/GLUT4 信號通路病理性變化以此達到改善海馬胰島素抵抗的作用。

4 結(jié)論

1）2 型糖尿病將導(dǎo)致病理性中樞胰島素抵抗，同時8 周有氧運動能夠有效改善2 型糖尿病海馬胰島素抵抗。

2）8 周有氧運動可能通過降低海馬組織Gal-3 水平以及提高脂聯(lián)素/AMPK/GLUT4 信號通路表達，從而達到改善2 型糖尿病海馬胰島素抵抗， 同時Gal-3 以及脂聯(lián)素/AMPK/GLUT4 信號通路異?？赡芤彩? 型糖尿病病理性引發(fā)中樞胰島素抵抗的機制之一。