耐鹽彩葉杜梨莖尖繁育影響因素研究

王瑩 唐季云 李玉娟 談峰 郭聰 李敏

摘要 [目的]建立耐鹽彩葉杜梨的莖尖組培快繁技術(shù)體系。[方法]以耐鹽彩葉杜梨莖尖為試材，對(duì)影響莖尖離體培養(yǎng)的取材時(shí)期、外植體消毒、培養(yǎng)基和激素配比等因素進(jìn)行研究。[結(jié)果]休眠期水培促萌發(fā)的嫩芽污染率較低，最利于莖尖誘導(dǎo)成活。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出最佳滅菌處理為75%乙醇 +0.1% HgCl2 8 min，污染率和發(fā)芽率分別為27.36%和57.47%;適于莖尖增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基和激素組合為MS+1.0 mg/L 6-BA+1 mg/L IBA，增殖系數(shù)為9.23。[結(jié)論]通過耐鹽彩葉杜梨莖尖繁育技術(shù)的優(yōu)化，為建立其優(yōu)良無性系和進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 耐鹽彩葉杜梨;莖尖培育;組織培養(yǎng);快繁技術(shù)

中圖分類號(hào) S604+.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）13-0056-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.018

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on the Influencing Factors of Stem Tip Breeding of SaltTolerant? Pyrus betulaefolia

Abstract [Objective]To establish a rapid propagation technique system of stem tip tissue culture for salttolerant Pyrus betulaefolia.[Method] The stem tip of? Pyrus betulaefolia was used to study the influencing factors such as the period of sampling，the disinfection of explants，the medium and the ratio of hormones.[Result]The contamination rate of young shoots promoted by hydroponic culture in dormant stage was lower，which was most beneficial to stem tip induction and survival.The optimal sterilization treatment was 75% alcohol for 30s+0.1% HgCl2 for 8 min，and the contamination rate and germination rate were respectively 27.36% and 57.47%.The suitable multiplication culture medium and hormone combination for stem tip tissue was MS+1.0 mg/L 6BA+1.0 mg/L IBA，the multiplication coefficient was 9.23.[Conclusion]Through the optimization of stem tip breeding technology of salttolerant? Pyrus betulaefolia，it layed a foundation for establishing its excellent clone and genetic transformation.

Key words Salttolerant Pyrus betulaefolia;Stem tip culture;Tissue culture;Rapid propagation technology

杜梨為薔薇科梨屬落葉喬木，別名棠梨、灰梨、海棠梨等，原產(chǎn)我國(guó)北部，長(zhǎng)江流域以及遼寧南部、河北、山西、河南、陜西、甘肅、安徽、江西、湖北均有分布，常生于海拔50～1 800 m的平原或山坡上[1]。杜梨是梨樹砧木中抗寒、抗旱、耐澇、耐鹽堿綜合抗性最強(qiáng)的砧木，對(duì)所有的白梨、砂梨、秋子梨系統(tǒng)品種具有親和力，為我國(guó)梨樹砧木最佳選擇[2]。與其他木本果樹一樣，由于杜梨的高度雜合性以及童期較長(zhǎng)等特點(diǎn)，使常規(guī)育種周期較長(zhǎng)。在田間繁殖也相對(duì)費(fèi)時(shí)費(fèi)力、占用較多土地[3]。隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)展，杜梨的離體培養(yǎng)取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，并為種苗工廠化及種質(zhì)資源離體保存提供了有效途徑。筆者以杜梨為試材，采用正交設(shè)計(jì)法，獲得杜梨快速生長(zhǎng)及擴(kuò)繁培養(yǎng)基，旨在為建立其優(yōu)良無性系和進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)材料為露地栽培于江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所苗圃中的耐鹽彩葉杜梨。

1.2 外植體的采集與處理

以耐鹽彩葉杜梨的莖尖作為外植體，分別在3個(gè)不同時(shí)期進(jìn)行取材：①休眠期枝條于溫室內(nèi)水培催芽（S1）;②新梢生長(zhǎng)初期頂端新芽（S2）;③盛花期的枝條頂端莖尖（S3）。

1.3 消毒滅菌

用細(xì)毛軟刷將枝條表面清洗干凈，剪取1.5 cm長(zhǎng)的帶芽莖段，用洗潔精浸泡30 min，再用流水沖洗1 h以上，在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇消毒30 s，再分別用01%的HgCl2滅菌6、8、10 min，無菌水沖洗5～6遍接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基上，10 d后統(tǒng)計(jì)污染率，20 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。培養(yǎng)基pH為57，培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d。

1.4 叢生芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)

選取在啟動(dòng)培養(yǎng)基上繼代3次以上生長(zhǎng)健壯的無菌芽，接種到叢生芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基中。設(shè)計(jì)L9（34）正交設(shè)計(jì)：6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L），IBA（0.25、0.50、1.00 mg/L），NAA（0、0.2、0.4 mg/L），30 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)及生長(zhǎng)狀況。

1.5 壯苗生根

選擇生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)均一的叢生芽，轉(zhuǎn)接至壯苗生根培養(yǎng)基中。壯苗生根培養(yǎng)基用MS+（0.1、0.5、1.0） mg/L IBA，30 d后統(tǒng)計(jì)生根率、根數(shù)和生長(zhǎng)狀況。

1.6 煉苗與移栽

將繼代培養(yǎng)45 d、高度超過3 cm、生長(zhǎng)健壯、根系發(fā)育良好的無菌苗，在組培室中進(jìn)行煉苗。首先去掉瓶子的橡皮筋煉苗2 d，然后將封口膜打開一半煉苗2 d，最后完全去封口膜煉苗7 d。煉苗結(jié)束后，取出組培苗，用無菌水將根系上的瓊脂清洗干凈，并用800倍的多菌靈浸泡15 min。移栽到草炭：珍珠巖=3：1（體積比）的混合基質(zhì)中。移栽前，基質(zhì)用高錳酸鉀消毒，放置一個(gè)晚上后使用，移栽后澆透水使基質(zhì)和根部緊密結(jié)合，放置在25℃的人工氣候箱中培養(yǎng)7～14 d，之后放置在溫室內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳取材時(shí)期的選擇

由表1可知，取材時(shí)間對(duì)莖尖的誘導(dǎo)效果有顯著差異。休眠期枝條于溫室內(nèi)水培外植體與其他取材時(shí)期相比，莖尖污染率最低，而發(fā)芽率與成活率最高，成活率與其他各組差異達(dá)極顯著水平。盛花期的枝條頂端莖尖誘導(dǎo)效果較其他2組較差，污染率接近50%，發(fā)芽率僅為33.51%。對(duì)3次取材結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)得出，污染率由低到高依次為休眠期枝條于溫室內(nèi)水培催芽、新梢生長(zhǎng)初期頂端新芽、盛花期枝條頂端莖尖。前2個(gè)時(shí)期取材，莖尖污染率相對(duì)較低，誘導(dǎo)成活率和發(fā)芽率較高，是較適宜的取材時(shí)期。

2.2 啟動(dòng)培養(yǎng)

由表2可知，用HgCl2消毒不同時(shí)間，隨著滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率逐漸降低，相應(yīng)的萌發(fā)率先升高后降低。綜合考慮污染情況和發(fā)芽結(jié)果，杜梨滅菌最適宜的方法為75%乙醇30 s，0.1% HgCl2滅菌8 min，此時(shí)的污染率為27.36%，發(fā)芽率為57.47%，其發(fā)芽率與其他滅菌方式差異達(dá)極顯著水平。

2.3 叢生芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)

由表3可知，高濃度IBA和NAA均能促進(jìn)叢生芽的增殖生長(zhǎng)，而過高濃度的6-BA對(duì)植株生長(zhǎng)及叢生芽增殖不利，6-BA濃度1 mg/L時(shí)，隨著IBA濃度的增加，增殖系數(shù)升高。極差分析結(jié)果表明，叢生芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)效果影響因素由大到小依次為IBA、6-BA和NAA。6-BA與IBA的濃度比為1∶1時(shí)效果最好，明顯優(yōu)于其他組合。最適宜誘導(dǎo)叢生芽的組合為1 mg/L 6-BA+1 mg/L IBA，此時(shí)的增殖系數(shù)為9.23，叢生芽長(zhǎng)勢(shì)最好，葉色鮮艷（圖1）。

2.4 無菌苗生根培養(yǎng)

從表4可以看出，IBA在一定濃度范圍內(nèi)均可誘導(dǎo)外植體生出不定根，但濃度過高會(huì)使平均生根數(shù)和平均根長(zhǎng)降低，且3種濃度的IBA平均根長(zhǎng)差異極顯著。但I(xiàn)BA濃度為1.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)的不定根數(shù)較少，根系變粗且短，植株生長(zhǎng)不良。IBA濃度為0.5 mg/L時(shí)，生根的數(shù)量最多且根長(zhǎng)最長(zhǎng)，為最適宜的生根濃度。

2.5 試管苗移栽

移栽后前7 d每天噴水2～3次，之后每天噴水1次，保持空氣濕度在80%左右，14 d后即可移出培養(yǎng)箱，直接放置在溫室中進(jìn)行常規(guī)管理，移栽成活率達(dá)90%以上，之后在氣候合適時(shí)可移栽大田。

3 結(jié)論與討論

適宜的取材時(shí)期是降低莖尖污染率、提高莖尖誘導(dǎo)成活率的重要因素[4]。李艷霞等[5]在建立越橘品種‘Koralle莖尖繁殖體系中發(fā)現(xiàn)，利用休眠期水培后萌發(fā)出的嫩芽為外植體時(shí)，材料的污染最低。范世杰等[6]對(duì)3種越橘（桔）莖尖初代培養(yǎng)與增殖進(jìn)行研究，結(jié)果表明不同取材時(shí)期莖尖污染率和誘導(dǎo)成苗率有很大差異。該試驗(yàn)也獲得了相似的研究結(jié)果，用休眠期水培后萌發(fā)出的嫩芽可顯著降低接種的污染率，提高莖尖誘導(dǎo)成活率，為最適宜取材時(shí)期。新梢生長(zhǎng)初期頂端新芽和盛花期的枝條頂端莖尖由于長(zhǎng)時(shí)間暴露在室外，污染嚴(yán)重，接種后不易滅菌，導(dǎo)致污染率較高;另外莖尖頂端分生組織分化相對(duì)緩慢，以致于誘導(dǎo)成活率較低，應(yīng)盡量避免這些時(shí)期取材。

在莖尖培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基是影響莖尖成活率以及苗木狀態(tài)的主要因素之一，當(dāng)然，同一屬的不同種以及不同品種對(duì)培養(yǎng)基的反映有所不同，使用的培養(yǎng)基不能同一而論[7-9]。植物激素是影響莖尖誘導(dǎo)和增殖的關(guān)鍵因子之一，在組織培養(yǎng)中起重要作用。林靜等[10]利用杜梨子葉誘導(dǎo)不定芽，結(jié)果顯示，培養(yǎng)基和激素濃度對(duì)叢生芽誘導(dǎo)起關(guān)鍵性作用，而生長(zhǎng)素NAA對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)起主要作用。只有選用合適的激素及質(zhì)量濃度，才能獲得理想的結(jié)果。該研究中對(duì)叢生芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)效果影響最大的是IBA，其次為6-BA，尤其6-BA與IBA的濃度比接近1時(shí)效果最好，這可能因品種的基因型而有所差異。

耐鹽彩葉杜梨作為一種新型的適合沿海灘涂利用的彩葉樹種，具有極高的觀賞價(jià)值和市場(chǎng)前景。該試驗(yàn)以彩葉杜梨莖尖為外植體，初步建立了莖尖組培快繁技術(shù)體系，在保證生根成活率的同時(shí)，大大縮短了育苗周期，為實(shí)現(xiàn)耐鹽彩葉杜梨優(yōu)質(zhì)組培苗工廠化生產(chǎn)和規(guī)?；_發(fā)提供了參考。

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