王老吉涼茶中試提取過程的近紅外在線檢測研究＊

馬晉芳，肖 雪，王雪利，彭 銀，史慶龍，蔣華壯，葛發(fā)歡＊＊

（1.中山大學藥學院 廣州 510006；2.中山大學南沙研究院 廣州 511458；3.廣東藥科大學廣州 510006；4.廣東省中藥超臨界流體萃取工程技術(shù)研究中心 廣州 510006）

涼茶是我國人民在長期預防疾病與保健的過程中，以中醫(yī)養(yǎng)生理論為指導，以多種中草藥為基礎(chǔ)，研制總結(jié)出的一類具有清熱解毒、生津止渴等功效的飲料總稱[1-2]。

王老吉涼茶是著名的廣東涼茶之一，主要由金銀花、菊花、仙草、夏枯草、雞蛋花、布渣葉、甘草共七味藥材經(jīng)過現(xiàn)代工藝制造而成的一種用于清涼祛火，清熱解毒的現(xiàn)代涼茶產(chǎn)品[2]。涼茶中含有多種成分，其有效成分可能為總酚酸類成分[3]。咖啡酸是一種天然的酚類化合物，具有抗氧化、抗輻射等多種功能活性[4]。目前，對王老吉涼茶質(zhì)量研究較少，有報道采用液質(zhì)聯(lián)用法分析王老吉涼茶中的成分[5]。在王老吉涼茶的實際生產(chǎn)過程中，如果采用液質(zhì)聯(lián)用法或高效液相色譜法進行含量測定，分析結(jié)果存在滯后性，難以滿足在線分析的要求[6]。

隨著科學技術(shù)的進步，目前近紅外在線光譜儀已實現(xiàn)技術(shù)成熟化、產(chǎn)業(yè)化，它能提供成分含量、物理化學性質(zhì)等多個內(nèi)在質(zhì)量參數(shù)的在線測量，從而為基于中藥內(nèi)在成分含量的質(zhì)量控制模式提供了技術(shù)支持。以近紅外在線光譜儀為核心設(shè)備，實現(xiàn)中藥生產(chǎn)過程在線檢測，并根據(jù)檢測結(jié)果實現(xiàn)生產(chǎn)過程的智能化控制將是中藥生產(chǎn)過程的大勢所趨，將成為中藥現(xiàn)代化生產(chǎn)的核心技術(shù)[7-9]。為了進一步提高王老吉涼茶藥材利用率、降低生產(chǎn)成本，因此，引入近紅外光譜技術(shù)，對涼茶生產(chǎn)工藝過程中的提取階段中總酚酸和咖啡酸的含量進行研究。本研究采用近紅外光譜在線分析技術(shù)，結(jié)合偏最小二乘法，對王老吉涼茶中試提取過程進行實時在線檢測研究，為王老吉產(chǎn)品質(zhì)量檢測提供有效支持。

1 材料和方法

1.1 儀器和藥材

圖1 王老吉涼茶提取過程在線近紅外原始光譜

UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國戴安公司）；XS205 DuaLRange型十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多）；UV-2600紫外分光光度計（島津（中國）有限公司）；Matrix-F近紅外光譜儀（德國布魯克公司）；化學計量學分析系統(tǒng)（THUNIR V3.0（Demo），清華大學），在線監(jiān)測分析系統(tǒng)（THU NIR Online（Demo），清華大學）；中小型提取罐（30L）。乙腈（色譜級，德國默克），甲酸、碳酸鈉（分析級，廣州化學試劑廠）。福林酚溶液（天津市光復精細化工研究所）；咖啡酸標準品（110885-200102，中國食品藥品檢定研究院）；沒食子酸標準品（批號：110831-201605，中國食品藥品檢定研究院）；王老吉涼茶混合藥材（廣州王老吉藥業(yè)股份有限公司提供）。

1.2 樣品制備

提取罐中加入純化水200 L，開啟攪拌，用蒸汽將水加熱到煮沸，將已稱好的10 kg混合藥材投入提取罐中，在溫度90±2℃提取90 min，提取過程中進行近紅外控制時每隔約2 min采樣一次，按樣品采集時間編號，并置于密封容器中存放。

1.3 在線近紅外采集光譜[10-11]

光譜采集條件：選用2 mm光程，以空氣為背景，采用透射模式在線采集提取液吸收光譜，光譜范圍為800-2 500 nm，掃描次數(shù)32次，分辨率2 nm，每個提取液樣品重復掃描3次，得出平均的光譜數(shù)據(jù)，采集的近紅外原始光譜見圖1。

1.4 王老吉涼茶提取液中指標成分的含量測定

1.4.1 王老吉涼茶中總酚酸的含量測定[12]

1.4.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸標準品，加水配制成0.645 mg·mL-1的對照品溶液。

1.4.1.2 供試品溶液的制備

取“1.2”項下樣品各5 mL，再加入5 mL蒸餾水，混勻即可。

1.4.1.3 測定方法

分別精密量取標準品溶液與供試品溶液1 mL，加入1.8 mL福林酚試劑,室溫反應5 min后加入1.2 mL 7.5%碳酸鈉溶液，避光放置1.5 h后于765 nm下，以水為空白測定其吸光度。

1.4.2 王老吉涼茶中咖啡酸的含量測定[13-14]

1.4.2.1 色譜條件

色譜柱 phenomenex Luna 5u C18(2)100A（250×4.6 mm）；流動相體系：乙腈-0.3%乙酸水溶液；流動相A為乙腈，流動相B為0.3%乙酸水溶液，梯度洗脫（0-20 min，7%-20%A；20-30 min，20%-95%A），流速為0.8 mL/min，柱溫35℃，檢測波長：316 nm。檢測器：紫外檢測器DAD-3000，進樣量：20 μL。

1.4.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取咖啡酸標準品，加甲醇配制成濃度為0.214 mg·mL-1的咖啡酸母液。精密量取母液0.8 mL至5 mL容量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻作為對照品溶液。

1.4.2.3 供試品溶液的制備

取“1.2”項下樣品各5 mL，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液。

1.4.2.4 測定方法

分別精密量取標準品溶液與供試品溶液各20 μL，經(jīng)HPLC測定。

1.5 樣本的在線監(jiān)測分析

采用THU NIR Online（Demo）對王老吉涼茶提取過程中的各個批次進行分析比較，對光譜進行波長選擇，排除噪聲干擾，反應檢測目標成分的變化情況，選擇提取過程趨勢一致的批次進行模型的建立與預測分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

將符合生產(chǎn)條件的樣本劃分為校正集、驗證集及外部預測集，采用多種光譜預處理方法如無預處理、卷積平滑、一階卷積求導、二階卷積求導、歸一化法、多元散射校正、標準正態(tài)變量變換中的一種或幾種對光譜進行優(yōu)化[15-18]。采用多種波長選擇方法，如全波長法、相關(guān)系數(shù)法、相關(guān)成分法、迭代優(yōu)化法等對光譜進行波長選擇[10,11,17]，采用偏最小二乘法對樣本的光譜數(shù)據(jù)與其性質(zhì)的含量值做回歸擬合計算，建立校正模型。

1.7 模型評價參數(shù)[19-20]

采用交互驗證標準偏差（SECV）、校正標準偏差（SEC）、主因子數(shù)（LV）、決定系數(shù)（R2）作為指標，評價模型的性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液中總酚酸測定結(jié)果

根據(jù)測定方法中建立的UV-Vis法，對提取液中的總酚酸進行含量測定，方法學主要參考中藥藥典和已報道過的文獻[12]，其精密度、重復性、穩(wěn)定性的RSD值分別為0.82%、2.34%和0.25%，均小于3.0%，平均加樣回收率為97.64%，均符合分析要求，所建立的線性方程為Y=1.4356X+0.0246，R=0.9995，各批次的提取液中總酚酸的測定結(jié)果見表1、表3、表5。

2.2 提取液中咖啡酸測定結(jié)果

根據(jù)測定方法中建立的液相方法，對提取液中的咖啡酸進行含量測定，方法學主要參考中藥藥典和已報道過的文獻[13-14]，其精密度、重復性、穩(wěn)定性的RSD值分別為0.97%，0.83%和2.97%，均小于3.0%，平均加樣回收率為98.57%，均符合分析要求，所建立的線性方程為Y=78.9692X+0.0302，R=1.0000，各批次的提取液中咖啡酸的測定結(jié)果見表2、表4、表6。

2.3 各批次樣本的在線監(jiān)測分析

采用THU NIR Online（Demo）對王老吉涼茶提取過程中的六個批次進行分析比較[21]，光譜波長選擇為834-1830 nm，檢測目標成分的變化情況，如圖2所示為第一批次趨勢變化圖，從左向右，趨勢逐漸趨于平衡，提示達到提取完全。通過比較各個批次，選擇提取過程趨勢一致的五個批次進行模型的建立與預測分析。

2.4 樣本集的劃分

根據(jù)2.3中樣本的在線監(jiān)測分析結(jié)果，選出5批符合現(xiàn)場生產(chǎn)條件的樣本進行建模和驗證分析，其中包括118個建模樣本，30個外部驗證樣本，1個批次34個在線驗證樣本。

2.5 近紅外模型的建立

2.5.1 光譜預處理

采用“1.6”中的光譜預處理方法，對所“1.3”中采集的建模原始光譜進行光譜預處理來消除基線漂移，提高信噪比，提取關(guān)鍵信息。本研究比較了幾種常用預處理方法，提高了模型的穩(wěn)定性和預測的準確性，結(jié)果見表7，交叉驗證相關(guān)系數(shù)R越接近1，內(nèi)部交叉驗證均方差SECV越小，預處理方法越好。最終確定對總酚酸和咖啡酸分別進行卷積平滑預處理，在其所有預處理方法中SECV最小，分別為0.0620和0.0010。

2.5.2 波長的選擇方法

本研究中對總酚酸和咖啡酸的建模波段進行優(yōu)選，結(jié)合各成分中分子結(jié)構(gòu)的差異性，通過比較全波長、相關(guān)系數(shù)法、迭代優(yōu)化波長選擇方法，優(yōu)選最佳建模波段，并建立數(shù)學模型，確定近紅外光譜與含量的關(guān)系。結(jié)果顯示迭代優(yōu)化波長選擇方法能最大程度地利用光譜中的有效信息，并消除噪音等因素的影響，因此，對全波長法、相關(guān)系數(shù)法、迭代優(yōu)化波長選擇方法進行比較（表8）。結(jié)果顯示迭代優(yōu)化波長選擇方法的相關(guān)系數(shù)最高，SECV值最小，所以，總酚酸和咖啡酸均選擇迭代優(yōu)化波長選擇方法建立定量模型。

2.5.3 模型維數(shù)的確定

本研究中采用偏最小二乘法建立定量模型，維數(shù)的選擇對模型的預測能力有較大影響。在校正集樣本一定的情況下，維數(shù)過多，則會由于噪音偏大而出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象；維數(shù)過少則會由于包括的信息不完全導致模型的預測能力差。因此，本研究選擇兩個指標成分的模型維數(shù)分別為4和6，結(jié)果見圖3。

2.5.4 模型的建立

在線提取液的近紅外光譜分別經(jīng)卷積求導預處理后，采用迭代優(yōu)化波長選擇方法，運用偏最小二乘法分別建立定量校正模型并分析，結(jié)果顯示總酚酸和咖啡酸的相關(guān)系數(shù)分別為0.9759和0.9664，內(nèi)部交叉驗證均方差SECV分別為0.0620和0.0010，具體模型的參數(shù)見下表。

2.6 模型的外部驗證與在線驗證

選取30個樣本作為外部驗證集，34個樣本作為在線驗證集，預測總酚酸和咖啡酸的含量，并與高效液相法測定值進行比較，驗證校正模型的準確性，預測值與真實值的擬合結(jié)果見圖4，相關(guān)系數(shù)均大于0.85，說明預測值和真實值相對吻合，可見總酚酸和咖啡酸的定量校正模型具有良好的預測能力。

3 討論

通過建立的近紅外光譜校正模型，獲得的王老吉涼茶提取液中總酚酸和綠原酸近紅外預測值與HPLC測定值基本一致，且預測值的變化趨勢也與在線提取過程的含量相符合。結(jié)果證實了近紅外光譜在線技術(shù)在王老吉涼茶的中試提取過程中應用的可行性，為下一步在王老吉涼茶的大生產(chǎn)過程中實施近紅外在線動態(tài)質(zhì)量監(jiān)控提供了研究基礎(chǔ)。

此外，本實驗采用同一批次的藥材作為研究對象，整體預測效果較好，但仍存在有個別異常光譜，分析原因，不排除提取過程中循環(huán)設(shè)備儀器引起的遮光現(xiàn)象。這也提醒在后續(xù)研究工作特別是在線過程分析中要充分考慮各種干擾因素。

表1 建模樣本中總酚酸含量測定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

表2 建模樣本中咖啡酸含量測定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

表3 外部驗證集樣本中總酚酸的含量測定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

表4 外部驗證集樣本中咖啡酸的含量測定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

表5 在線驗證集樣本中總酚酸的含量測定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

表6 在線驗證集樣本中咖啡酸的含量測定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

圖2 第一批次的總酚酸在線監(jiān)測分析圖

表7 光譜預處理方法的比較

表8 波長選擇方法的比較

圖3 模型維數(shù)圖

表9 兩個成分的模型參數(shù)

圖4 定量校正模型外部驗證與在線驗證圖