黃芪破壁飲片的DNA條形碼鑒別與黃酮類成分HPLC指紋圖譜研究＊

王 艷，彭麗華，鄭夏生，成金樂＊＊

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點實驗室（廣州中醫(yī)藥大學(xué)），國家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實驗室 廣州 510006；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥破壁飲片技術(shù)與應(yīng)用重點研究室，中山市中智藥業(yè)集團有限公司 中山 528437；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣州 510006）

《中國藥典》2015年版收載的藥用黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1]。具補氣固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌的作用[2]。其主要有效成分為黃酮類、皂苷類、多糖類等。

中藥破壁飲片是通過現(xiàn)代粉碎技術(shù)將傳統(tǒng)中藥飲片加工至D90＜45 μm（300目以上）的破壁粉體，進而通過無添加成型技術(shù)制成的30～100目的干燥顆粒狀飲片[3]。中藥破壁飲片與傳統(tǒng)飲片相比，具有全成分入藥、均勻性好、利用率高、服用簡單、便攜的特點，經(jīng)過細胞破壁后破壁草本的有效物質(zhì)溶出率更高[4]，臨床上也得到越來越多人的關(guān)注。但同時，破壁之后失去了絕大多數(shù)藥材的原有性狀特征，增加了其物種鑒定的難度，DNA條形碼技術(shù)從基因水平對物種進行鑒定，為中藥破壁飲片真?zhèn)舞b定提供有效手段。此外，研究表明，黃芪中黃酮類成分具有清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化和維持血中一氧化氮濃度，保護缺血再灌注損傷的作用[5]。有文獻報道[6]，通過黃芪提取物抗疲勞作用的比較，得出黃芪中黃酮類成分的藥效最佳。同時通過不同產(chǎn)地黃芪總黃酮HPLC指紋圖譜研究[7]表明不同產(chǎn)地之間黃芪的質(zhì)量存在很大的差異。本實驗采用了DNA條形碼技術(shù)，選用ITS2為主體序列，psb A-trn H為輔助序列[8]對產(chǎn)地為甘肅的黃芪藥材制成的黃芪破壁飲片進行了物種鑒定，同時建立了2015版藥典中蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao破壁飲片黃酮類成分HPLC指紋圖譜，為黃芪破壁飲片的質(zhì)量控制提供了有效的方法。本文通過DNA條形碼、HPLC指紋圖譜兩種方法相結(jié)合，在真?zhèn)舞b別的前提下，對15批黃芪破壁飲片進行質(zhì)量分析，再通過指紋圖譜相似度比較，對黃芪破壁飲片的真?zhèn)闻c批間一致性進行綜合評價。

1 材料與儀器

1.1 藥物及試劑

1.1.1 受試藥物

15批黃芪原藥材購自甘肅岷縣順興和中藥材有限公司，均由中山市中智藥業(yè)集團有限公司制備成15批黃芪破壁飲片，批號：20170601(S1)、20170602(S2)、20170701(S3)、20170702(S4)、20170703(S5)、20170704(S6)、20170705(S7)、20170706(S8)、20170707(S9)、20170708(S10)、20170709(S11)、20170801(S12)、20170802(S13)、20170803(S14)、20170804(S15)。

1.1.2 對照品

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（中國食品藥品檢定研究院）、芒柄花素（中國食品藥品檢定研究院）、毛蕊異黃酮（成都曼斯特生物科技有限公司）、刺芒柄花苷（成都曼斯特生物科技有限公司）。

1.1.3 試劑

甲醇（OCEANPAK）、乙腈（Merck KGaA）為色譜純；水為超純水；其他試劑為分析純。植物基因組DNA提取試劑盒（百泰克，DP3111）；2×Power Taq PCR Master Mix（百泰克，PR1701）

1.2 儀器

生物樣品均質(zhì)儀（愛施德，Bioprep-24）、低溫冰箱（Eppendorf，5430R）；多功能 PCR 儀（Biometra，F(xiàn)lex Cycler 2）；水平電泳儀（Bio-Rad）；凝膠成像儀（Biometra，BDA digital）。高效液相色譜儀（Thermo Fisher，U3000）；明澈TM-D24UV純水系統(tǒng)；KQ-400KOE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋DK-S24（上海森信實驗儀器有限公司）；萬分之一電子天平AB204-S（METTLER TOLEOD）、十萬分之一電子天平AUW220D（島津公司）。

2 實驗方法

2.1 DNA條形碼方法

2.1.1 樣品前處理

分別稱取各樣品50 mg，置于陶瓷研缽中，用力研磨，取粉末用于DNA提取。

2.1.2 DNA提取

試劑盒法：按照新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（百泰克，DP3111）說明書操作。

2.1.3 PCR擴增和測序[9]

PCR反應(yīng)體系：2×Power Taq PCR Master Mix（百泰克，PR1701）12.5 μL，正反向引物：ITS2-2F，ATGCGATACTTGGTGTGAAT；ITS2-3R，GACGCTT-CTCCAGACTACAAT；psbA-trnH 引物：psbA-F，GTTATGCATGAACGTAATGCTC；trnH-R，CGCGCATGGTGGATTCACAATCC各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補足體積至25.0μL；陰性對照（Negativecontrol，NC）采用ddH2O作為模板。溫度程序（ITS2）：94℃，4 min；94℃，30 s，52 ℃，30 s，72 ℃，45 s，35個循環(huán)；72 ℃，5 min。溫度程序（psbA-trnH）：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s，52 ℃，20 s，72℃，50 s，35個循環(huán)；72℃，5 min。反應(yīng)完成后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測各PCR產(chǎn)物，在目的區(qū)域出現(xiàn)清晰條帶的樣品則送檢做Sanger測序。

2.1.4 數(shù)據(jù)處理

將測序所得的原始峰圖導(dǎo)入CodonCodeAligner（Version5.1.5.0）進行序列處理，去除5.8SrRNA和28SrRNA區(qū)以獲得ITS2序列；psbA-trnH片段則僅進行引物區(qū)域裁切。將各樣品的ITS2序列和psbA-trnH序列作為Quary分別在NCBI、中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（http：//www.tcmbarcode.cn/china/index.php?optionid=174）上做比對，取同源性最高的比對結(jié)果。

2.2 指紋圖譜方法

2.2.1 提取溶劑的考察

取黃芪破壁飲片（批號：20170705）3 g，精密稱定，精密加入甲醇、乙醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇20 mL，靜置30 min，超聲40 min，搖勻，過濾，續(xù)濾液再經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜濾過，進樣10 μL，結(jié)果表明，用甲醇提取所測得的各主要峰峰面積之和最大，因此，選擇純甲醇作為黃芪破壁飲片的提取溶劑。

2.2.2 提取方法的考察

取黃芪破壁飲片（批號：20170705）3 g，精密稱定，精密加入甲醇20 mL，靜置30 min，比較回流提取、超聲提取等提取方法的提取效果結(jié)果表明，回流提取和超聲提取方法的提取效果相差不大，但考慮到實驗操作的簡便性，故選取了超聲提取。

2.2.3 供試品溶液的制備

取黃芪破壁飲片3 g，精密稱定，加甲醇20 mL，靜置30 min，超聲40 min，搖勻，過濾，續(xù)濾液再經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.4 檢測條件的確定

2.2.4.1 檢測波長的選擇

用十八烷基硅膠為填充劑，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（B）-0.15%甲酸水溶液（A），按照程序梯度洗脫：0-10 min，5%-30%(B)；10-30 min，30%(B)；30 min-50min，30%-60%(B)；50min-52min，60%-5%(B)；52min-60 min，5%(B)；柱溫：25℃；體積流量：0.6mg?ml-1；進樣量：10 μL。在選擇檢測波長過程中，采用全波長掃描，圖譜顯示在254 nm處樣品出峰數(shù)多，各主要峰面積面積之和較大，故選254 nm作為檢測波長。

2.2.4.2 流動相的確定

用十八烷基硅膠為填充劑，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為①甲醇-水②乙腈-水③乙腈-0.1%甲酸水溶液④乙腈-0.15%甲酸水溶液⑤乙腈-0.2%甲酸水溶液⑥乙腈-0.1%磷酸水溶液⑦乙腈-0.1%乙酸水溶液梯度洗脫。柱溫：25℃；體積流量：0.6mg?ml-1；進樣量：10 μL。比較各流動相下圖譜的分離度和半峰寬，結(jié)果選?、芴栂到y(tǒng)為流動相。

2.2.5 方法學(xué)考察

2.2.5.1 精密度試驗

取同一黃芪破壁飲片供試品（批號：20170705），照上述色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗項下方法，連續(xù)進樣6次，各圖譜的相似度均在0.99以上，表明儀器等整個檢測系統(tǒng)的精密度良好。

2.2.5.2 穩(wěn)定性試驗

取黃芪破壁飲片供試品溶液（批號：20170705），分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h測定，各圖譜相似度均在0.99以上，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5.3 重復(fù)性試驗

取黃芪破壁飲片（批號：20170705）3 g，共6份，分別依法制成供試品溶液，照上述色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗項下方法，分別進樣，各圖譜相似度均在0.99以上，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

圖1 15個樣品ITS2擴增結(jié)果

圖2 15個樣品psbA-trnH擴增結(jié)果

3 實驗結(jié)果

3.1 DNA條形碼實驗結(jié)果及分析

3.1.1 ITS2片段及psbA-trnH片段擴增結(jié)果

15批黃芪破壁飲片均能成功提取出基因組DNA，并可成功獲得ITS2片段及psbA-trnH片段（見圖1、2）

3.1.2 ITS2鑒定結(jié)果

利用ITS2片段可以成功鑒定出本研究中的15批黃芪破壁飲片，其各批次之間的堿基均一致，各樣品的ITS2序列比對結(jié)果與公共數(shù)據(jù)庫中蒙古黃芪已有序列的同源性達到100%（見表1），ITS2序列比對過程中未出現(xiàn)除蒙古黃芪同源性達到100%的其他物種。

3.1.3 psbA-trnH鑒定結(jié)果

比對結(jié)果表明，各批次樣品之間的序列一致，各樣品中的psbA-trnH序列比對結(jié)果與公共數(shù)據(jù)庫中蒙古黃芪已有序列的同源性均達到100%（見表2），psbA-trnH序列比對過程中未出現(xiàn)除蒙古黃芪同源性達到100%的其他物種。

3.1.4 結(jié)果分析

ITS2及psbA-trnH鑒定結(jié)果顯示，實驗所用的黃芪為蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao。

表1 ITS2序列比對結(jié)果

表2 psbA-trnH序列比對結(jié)果

3.2 HPLC指紋圖譜實驗結(jié)果及分析

3.2.1 指紋圖譜的建立

取15批黃芪破壁飲片供試品溶液各10 μL，在上述色譜條件下進行測定，得到15批不同批次黃芪破壁飲片HPLC指紋圖譜，根據(jù)色譜圖中各色譜峰的相對保留時間，確定共有峰，并選取其中11個共有峰作為特征指紋峰，建立的指紋圖譜見圖3（S1～S15分別對應(yīng)上述樣品批次名稱）。

3.2.2 共有峰的標定

圖3 15批不同批次黃芪破壁飲片HPLC指紋圖譜及對照圖

根據(jù)15批黃芪破壁飲片的指紋圖譜檢測結(jié)果，選擇圖譜中峰面積較大、峰形較好的色譜峰為共有峰，在對照圖譜上共標定11個共有峰。經(jīng)過與對照品比對知5號峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，7號峰為刺芒柄花苷，10號峰為毛蕊異黃酮，11號峰為芒柄花素，見圖4。計算各色譜峰保留時間和保留峰面積與同一圖譜中S峰的保留時間和保留峰面積比值，得到的相對保留時間和相對峰面積見表4及表5。

3.2.3 共有峰相關(guān)信息

色譜圖中5號色譜峰（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）分離度良好，保留時間適宜，故選此峰為參照峰。根據(jù)15批黃芪破壁飲片樣品的色譜圖結(jié)果，以參照峰峰面積為基準，計算各保留時間與參照峰的保留時間，各共有峰與參照峰峰面積的比值，RSD值在0.024%-0.116%之間，相對保留時間穩(wěn)定，符合《中藥注射劑指紋圖譜的技術(shù)要求（暫行規(guī)定）》的要求（結(jié)果見表3，表4）。

3.2.4 15批黃芪破壁飲片指紋圖譜相似度評價

對15批不同批次黃芪破壁飲片的HPLC數(shù)據(jù)進行處理，與對照指紋圖譜相匹配，15批不同批次黃芪破壁飲片的HPLC譜圖的相似度在0.9-1.0之間。表明各批樣品來源均一，質(zhì)量穩(wěn)定（表3，表4）。

4 討論

對于已失去外觀形狀的黃芪破壁飲片，本研究通過DNA條形碼技術(shù)對實驗所用的15批樣品進行物種鑒定，結(jié)果顯示樣品均為2015年版藥典中的蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao。以單一的有效成分控制中藥質(zhì)量已不能適應(yīng)中藥現(xiàn)代化的形勢，中藥指紋圖譜可以在不清楚全體化學(xué)成分的情況下，有效控制中藥的內(nèi)在質(zhì)量，提高中藥質(zhì)量的穩(wěn)定性[10]。因此本研究在基源確定后對15批黃芪破壁飲片黃酮類成分進行指紋圖譜研究，方法學(xué)考察結(jié)果符合指紋圖譜技術(shù)要求，并對圖譜進行相似度評價，結(jié)果各批次的相似度均大于0.9，表明所用的樣品質(zhì)量穩(wěn)定，來源均一。

中藥破壁飲片是一類創(chuàng)新型飲片，目前對黃芪破壁飲片質(zhì)量評價的方法鮮有報道。藥材的打破細胞壁后失去原有的顯微及外觀特征；但卻具有節(jié)省藥材、免煎高效等優(yōu)點。近年來，越來越多的藥理藥效學(xué)研究結(jié)果表明中藥破壁飲片相對于傳統(tǒng)飲片具有更好的安全性和有效性[11-14]。本文的研究則是從質(zhì)量控制方面做出了有意義的探究—利用DNA條形碼技術(shù)進行黃芪破壁飲片的物種鑒定，再在物種鑒定的基礎(chǔ)上通過HPLC指紋圖譜技術(shù)評價黃芪破壁飲片的質(zhì)量。辛天怡等[15]提到DNA容易降解，在進行DNA條形碼鑒定過程中，可能會由于DNA降解過于嚴重而無法成功獲得其條形碼序列，采用DNA條形碼技術(shù)和與其他方法結(jié)合進行檢驗，綜合評價藥品質(zhì)量更具有說服力。本實驗采用DNA條形碼技術(shù)結(jié)合HPLC指紋圖譜技術(shù)同時評價黃芪破壁飲片的質(zhì)量，對于生產(chǎn)實踐具有重要的指導(dǎo)意義，同時保證產(chǎn)業(yè)化的產(chǎn)品質(zhì)量，為保證產(chǎn)品批間一致性提供了可行性的方法。

圖4 黃芪破壁飲片指紋圖譜與混合對照品HPLC圖

2015年版藥典中黃芪藥材有2種來源，即蒙古黃芪、膜莢黃芪。這2種來源的黃芪質(zhì)量具有一定的差異，本實驗只對來源為蒙古黃芪藥材所制成的黃芪破壁飲片進行了HPLC指紋圖譜的研究，對2種來源黃芪質(zhì)量上的差異進行系列的研究具有一定的必要性。同時本實驗中只收集了甘肅一個產(chǎn)地的不同批次的黃芪藥材制成的黃芪破壁飲片進行研究，實驗結(jié)果顯示其質(zhì)量穩(wěn)定，對于企業(yè)生產(chǎn)上質(zhì)量控制具有很好的指導(dǎo)意義，但收集蒙古及不同產(chǎn)地的黃芪對比其質(zhì)量的差異性，為其生產(chǎn)上選擇優(yōu)質(zhì)的原藥材更具實際意義。除此之外也需要在指紋圖譜的基礎(chǔ)上對其藥效學(xué)進行深入研究，為臨床用藥提供科學(xué)的依據(jù)。

表3 15批黃芪破壁飲片指紋圖譜共有峰相對保留時間

表4 15批黃芪破壁飲片指紋圖譜共有峰相對峰面積

表5 相似度計算數(shù)據(jù)-平均數(shù)

表6 相似度計算數(shù)據(jù)-中位數(shù)