優(yōu)化蓽茇多糖的提取工藝及其抗氧化活性研究＊

馬 嵐，王慧敏，陳建平，成日青，齊和日瑪，郭慧卿，塔 娜

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 呼和浩特 010110）

蓽茇（piper Longum L）是胡椒科胡椒屬植物，其干燥成熟的果穗可入藥[1]，是中、蒙、藏、維醫(yī)的習(xí)慣用藥，具有調(diào)理胃火、祛“巴達干·赫依”、調(diào)節(jié)體素、滋補強壯、平喘、祛痰、止痛之功效[2-3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蓽茇具有抗癌、保肝、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、擴張冠狀動脈血管、抗菌、抗血小板、抗高血脂、保護心肌、抗抑郁等藥理學(xué)作用[4]。蓽茇中含有多糖類物質(zhì)，大量的藥理和臨床研究表明，有些植物多糖具有獨特的藥理及生物活性，比如提高免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、降血脂等，并具有無毒、副作用小等優(yōu)點[5-6]。所以中蒙藥中多糖的研究不僅成為熱門領(lǐng)域，也成為當今中蒙藥的研發(fā)方向之一[7]。

基于多糖的這些優(yōu)點，本文采用苯酚－硫酸法測定蓽茇多糖（Piper Longum Polysaccharides，PLP）的含量，通過考察提取溫度、提取時間、提取次數(shù)等影響因素對PLP的提取工藝進行地研究，并采用正交試驗法優(yōu)化提取工藝，最終確定最佳工藝條件，通過ABTS、DPPH自由基清除實驗，對PLP的抗氧化活性進行初步研究，為今后開發(fā)蓽茇多糖天然抗氧化劑奠定基礎(chǔ)。

1 實驗儀器及材料

1.1 實驗儀器

DR6000紫外分光光度計（美國哈希公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；ZKB-1-4型循環(huán)水多用真空泵（鞏義市英峪儀器廠）；BFX5—320型低速自動平衡離心機（白洋離心機廠）；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；恒溫水浴箱（北京市長風(fēng)儀器儀表）；恒溫鼓風(fēng)干燥箱（福利達實驗儀器廠）；BSA124S分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；

1.2 材料與試劑

蓽茇（購自呼和浩特市天力藥業(yè)，產(chǎn)地：廣西，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥用植物學(xué)教研室喬俊纏教授鑒定為胡椒科植物蓽茇的干燥成熟果穗），ABTS[2,2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽]、DPPH（2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基）、D-無水葡萄糖標準品（中國食品藥品檢定研究院，純度99.9%，批號：110833-201506）、乙醇（95%）、無水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、過硫酸鉀、抗壞血酸（VC）、苯酚、濃硫酸、溴化鉀、活性炭等均為分析純。

2 方法

2.1 PLP的制備

稱取蒙藥蓽茇5.0 g，加入100 ml 95%乙醇加熱回流60 min后過濾，除去脂溶性物質(zhì)及色素，將殘渣揮干，然后倒入圓底燒瓶中加入150 ml蒸餾水加熱回流提取60 min[8]，趁熱將提取液進行抽濾，依上述方法重復(fù)提取一次，然后將兩次提取液旋蒸濃縮約至20 ml，按1∶2比例加入40 ml乙醇溶液（95%），靜置24小時。然后抽濾，用無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌沉淀。將沉淀揮干，用蒸餾水溶解并定容至100 ml容量瓶中。吸取上述溶液10 ml，置于100 ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。

2.2 PLP的含量測定

2.2.1 測定波長的選擇

精密吸取葡萄糖對照品溶液1.0 ml供試品溶液1.0 ml分別置于試管中，用蒸餾水定容至2.0 ml，加入5%苯酚溶液1.0 ml，濃硫酸5.0 ml，于40℃水浴中反應(yīng)30 min后置于冷水中冷卻，在400-800 nm進行波長掃描，吸收光譜顯示對照品和供試品分別在491 nm和490 nm處有最大吸收，故選擇490 nm作為測定波長。

2.2.2 苯酚-硫酸法顯色反應(yīng)的探索

空白液的制備：精密吸取2.0 ml蒸餾水，加入0.5 ml的5%苯酚和5.0 ml濃硫酸，置于具塞比色管中。

供試品液的制備：精密吸取1.0 ml蒸餾水，1.0 ml供試液，分別吸取5%苯酚溶液 0.5、1.0、1.5、2.0 ml，5.0 ml濃硫酸，分別置于試管中。

將上述溶液于40℃水浴中反應(yīng)30 min后置于冷水中冷卻，490 nm波長處測定其吸光度。吸光度分別為：

依上述結(jié)果可知，當加入的苯酚體積為1.5 ml時吸光度最大，所以確定后續(xù)的苯酚-硫酸顯色法所加入的5%苯酚溶液的體積為1.5 ml。

2.2.3 標準曲線的繪制

采用苯酚—硫酸法測定PLP的含量，葡萄糖標準曲線繪制如下：

表1 蓽茇供試品的濃度及其吸光度

表2 精密度實驗結(jié)果

表3 重復(fù)性實驗結(jié)果

分別精密量取葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml置具塞比色管中，用蒸餾水稀釋至2.0 ml，加5%苯酚溶液1.5 ml，濃硫酸5.0 ml，于40℃水浴中反應(yīng)30 min顯色后置于冷水中冷卻，采用紫外—可見分光光度計在490 nm處測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標，以溶液濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實驗

吸取適量供試品溶液，按2.32項下方法操作顯色，于490 nm處連續(xù)取樣測定吸光度5次，其RSD值為0.23%，表明該方法精密度良好（表2）。

2.3.2 重復(fù)性實驗

精密稱取蒙藥蓽茇5.0 g，分別制備5份供試品溶液，分別按2.2.3項下方法操作顯色，于490 nm處測定吸光度，其RSD值為0.84%，表明該方法重復(fù)性良好（表3）。

2.3.3 穩(wěn)定性實驗

吸取適量供試品溶液，按2.2.3項下方法操作顯色，自加水定容搖勻開始計時，分別于10、20、30、45、60 min取樣測定吸光度，結(jié)果見表4。與計時10min后的數(shù)據(jù)比較，60 min后吸光度下降了0.33%，表明供試品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.4 加樣回收率實驗

精密稱取蓽茇5.0 g，共9份，分別加入19.9 mg、28.4 mg、36.9 mg的葡萄糖對照品各三份，按2.2制備多糖溶液，按2.2.3項顯色方法操作測定總多糖含量，結(jié)果平均加樣回收率為98.8%，RSD值為1.10%，表明該測定方法可靠，結(jié)果見表5。

表4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

表5 加樣回收率實驗結(jié)果

2.4 PLP的提取工藝研究

以多糖提取率為指標，首先通過單因素試驗考察提取溫度、提取時間和提取次數(shù)對PLP提取率的影響，然后根據(jù)以上單因素試驗，選取各因素中較優(yōu)的3個水平，采用L9（33）正交表進行正交試驗設(shè)計，從而選出蓽茇多糖提取的最佳工藝條件。

2.5 單因素試驗

2.5.1 提取溫度對PLP提取率的影響

稱取蓽茇5 g，在提取時間為60 min，提取次數(shù)為2次的條件下，設(shè)置提取溫度分別為 60、70、80、90、100℃，按照2.1的步驟進行多糖的提取，然后在波長490 nm處測定多糖溶液的吸光度，根據(jù)回歸方程計算多糖溶液的濃度，得出蓽茇多糖的提取率。

2.5.2 提取時間對PLP提取率的影響

稱取蓽茇5 g，在提取溫度為100℃、提取次數(shù)為2次的條件下，設(shè)置提取時間分別為 40、60、80、100、120 min，按照2.1的步驟進行多糖的提取，然后在波長490 nm處測定多糖溶液的吸光度，根據(jù)回歸方程計算多糖溶液的濃度，得出蓽茇多糖的提取率。

2.5.3 提取次數(shù)對PLP提取率的影響

稱取蓽茇5 g，在提取溫度為100℃、提取時間為60 min的條件下，分別提取1、2、3、4、5次，按照2.1的步驟進行多糖的提取，然后在波長490 nm處測定多糖溶液的吸光度，根據(jù)回歸方程計算多糖溶液的濃度，得出蓽茇多糖的提取率。

2.6 正交試驗

以單因素試驗的結(jié)果為基礎(chǔ)，采用L9（33）正交表進行正交試驗設(shè)計，考察提取溫度（A）、提取時間（B）和提取次數(shù)（C）三個因素，選取各因素中較優(yōu)的3個水平。

2.7 PLP脫蛋白

蓽茇多糖濃縮溶液采用Sevage法[9]去除蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)，常溫下離心10 min，然后取上清液重復(fù)操作5次，直到用紫外檢測在波長260-280 nm處無明顯吸收峰為止[10]。最后，將脫蛋白后的多糖溶液按照1∶2的比例加入乙醇溶液（95%），靜置24小時，抽濾，用無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌沉淀，烘干后得到初步純化的蓽茇多糖，即脫蛋白后的PLP。

2.8 抗氧化活性研究

許多中蒙藥多糖均具有抗氧化活性，可以增強免疫功能并延緩機體衰老[11]，機體內(nèi)自由基具有很強的氧化反應(yīng)能力，可與大多數(shù)的無機物和有機物發(fā)生多種類型的反應(yīng)，致細胞突變并壞死，因此多糖的清除自由基能力是評價其抗氧化活性的一個重要方面[12-14]。

2.8.1 ABTS自由基清除試驗

ABTS溶解在0.01 mol/L磷酸緩沖溶液（pH=7.4）配成7.4 mmol/L的溶液，然后取2 ml上述ABTS溶液與2 ml的2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，將混合物放在室溫下黑暗中16 h。稀釋ABTS溶液使其吸光度控制在0.7±0.02的范圍內(nèi)（734 nm處測吸光度）并且在30℃恒溫30 min[15]，每個樣品取2 ml（濃度分別為0.06、0.12、0.24、0.48、0.96、1.92 mg/ml）與2mlABTS溶液混合，在室溫下反應(yīng)20 min，立即在734 nm處測吸光度并記錄。每個樣品重復(fù)測3次并求平均值，VC用做標準，。按照下列公式分別計算蓽茇多糖與VC對ABTS自由基的清除率，公式如下：

ABTS自由基的清除率（%）={1-（A2-A1）/A0}×100%

式中，A0為2 ml ABTS溶液+2 ml蒸餾水的吸光度值；A1為2 ml磷酸緩沖溶液+2 ml蓽茇多糖溶液吸光度值；A2為2 ml ABTS溶液+2 ml蓽茇多糖溶液吸光度值。

2.8.2 DPPH自由基清除試驗

DPPH：用95%乙醇配置成0.2 mmol/L的溶液。

每個樣品取 2 ml(濃度分別為 0.06、0.12、0.24、0.48、0.96、1.92 mg/ml)與2 ml DPPH溶液混合，室溫下混合30 min，吸光度在517 nm處測量，VC用做標準，每個樣品重復(fù)測3次并求平均值。按照下列公式分別計算蓽茇多糖與VC對DPPH自由基的清除率：

DPPH自由基的清除率（%）={1-（A2-A1）/A0}×100%

式中，A0為2 ml DPPH溶液+2 ml蒸餾水的吸光度值；A1為2 ml乙醇+2 ml蓽茇多糖溶液吸光度值；A2為2 ml DPPH溶液+2ml蓽茇多糖溶液吸光度值[16]。

3 結(jié)果與分析

3.1 PLP含量的測定

葡萄糖標準曲線的回歸方程為A=10.366C+0.011（n=6，r=0.9996），式中C為葡萄糖標準溶液的濃度，A為葡萄糖在490 nm波長處測定的吸光值。結(jié)果顯示葡萄糖溶液濃度在0.0100-0.0602 mg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

3.2 單因素試驗結(jié)果分析

蓽茇多糖的提取率隨提取時間的增長而增大，提取時間小于60 min時提取率增幅緩慢，大于60 min增幅明顯，為了更準確地考察提取時間對PLP提取率的影響，在正交試驗中選擇提取時間分別為80、100、120 min作為考察水平進行進一步優(yōu)化。

蓽茇多糖的提取率隨溫度的升高而增大，在提取溫度為100℃時，提取率最高；溫度從60℃增至70℃時，多糖的提取率沒有明顯提高，但溫度大于70℃提取率明顯提高很多，結(jié)果表明溫度對多糖的提取率影響較大，所以選擇提取溫度分別為80、90、100℃作為考察水平進行正交試驗。

蓽茇多糖的提取率隨提取次數(shù)的增加而增大，當提取次數(shù)大于4時，多糖提取接近完全，當提取次數(shù)增加到5時，提取率變化不大，增加趨勢減緩，從經(jīng)濟角度綜合考慮，選擇提取次數(shù)分別為2、3、4次作為考察水平進行正交試驗。

3.3 正交試驗結(jié)果分析

3.3.1 正交試驗結(jié)果

為了確定PLP的最佳工藝條件，根據(jù)以上單因素試驗，采用L9（33）正交表，以提取時間，提取溫度，提取次數(shù)三個因素，選取各因素中較優(yōu)的3個水平，見表6。

提取時間（80、100、120）分鐘，提取溫度（80、90、100）℃，提取次數(shù)（2、3、4）次，做正交試驗。見表7和表8。

圖1 葡萄糖標準曲線

表6 L9（33）因素水平表

表7 正交試驗設(shè)計表及結(jié)果

表8 方差分析

由正交試驗結(jié)果（表7）可知，影響蓽茇多糖提取率的諸因素的主次關(guān)系依次是提取溫度（B），提取時間（A），提取次數(shù)（C）；從表7可以直觀的辨別各因素的最佳組合為A3B3C2，即最佳工藝為提取時間120分鐘，提取溫度100℃，提取次數(shù)3次。

3.3.2 驗證試驗

在最佳工藝條件下進行蓽茇多糖提取的驗證試驗，結(jié)果見下表：

表9 蓽茇中多糖含量的測定結(jié)果

圖2 PLP與VC對ABTS自由基清除率

圖3 PLP與VC對DPPH自由基清除率

如表9所示，采用最佳提取方法提取蓽茇多糖，粗多糖平均提取率為1.21%，而且RSD值僅為1.7%，三次結(jié)果差異很小，說明該工藝穩(wěn)定可行。

3.4 脫蛋白后PLP對ABTS自由基的清除結(jié)果

如圖2所示，蓽茇多糖濃度在0.06mg?ml-1時，對ABTS自由基的清除率較低為31.12%，隨著多糖濃度升高，對ABTS自由基清除率也增大，當多糖濃度大于0.48mg?ml-1時，清除率已達99.71%，多糖濃度繼續(xù)升高，對ABTS自由基的清除率增加得不再明顯，說明抗氧化作用已經(jīng)接近飽和，當多糖濃度為0.96mg?ml-1時，其清除率與VC清除率相同，達到100%。當多糖濃度增加至1.92mg?ml-1時，其清除率略有下降為99.42%。

3.5 脫蛋白后PLP對DPPH自由基的清除結(jié)果

如圖3所示，蓽茇多糖對DPPH自由基清除率隨多糖濃度先升高后下降，當濃度達到0.48mg?ml-1時，清除率最大達到88.27%，接近VC的清除率。但是當多糖濃度增至0.96mg?ml-1時，對DPPH自由基的清除率反而降至37.14%，說明由于多糖不溶于乙醇，同時多糖濃度過高，出現(xiàn)多糖析出的現(xiàn)象，導(dǎo)致清除率有所下降。

4 結(jié)論

本研究采用正交試驗法優(yōu)化PLP的提取工藝條件，驗證試驗結(jié)果表明，該提取工藝條件穩(wěn)定可靠，可以為PLP的進一步開發(fā)和藥理作用研究奠定實驗基礎(chǔ)。體外抗氧化實驗表明，PLP對ABTS自由基的清除能力較高，當PLP濃度不低于0.96 mg/ml時，其清除率與VC清除率相同，而對DPPH自由基的清除能力當PLP濃度超過0.96mg/ml時弱于Vc?？偟膩碚f，PLP對于自由基還是具備較好的清除能力，具有良好的抗氧化活性，今后會針對PLP抗氧化活性進行進一步體內(nèi)研究。