伏寒顆粒對冠心病先天伏寒證患者治療后的血清代謝組學(xué)研究＊

魏 巖，姜麗紅，郭家娟，崔英子，黃永生

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 長春 130021）

冠心病心絞痛屬于中醫(yī)胸痹、心痛等范疇。對84 697例冠心病病例分析，中醫(yī)證候以氣陰兩虛、氣虛血瘀最為多[1],然而臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)一部分患者具有特征性病情演變規(guī)律[2-5]，且整個過程存在頑固的足涼或手足涼，這些患者的病史都有一個共同的相似性：女性患者從月經(jīng)初潮（二七）即有痛經(jīng)，足涼或手足涼癥狀；男性患者從二八開始出現(xiàn)足涼或手足涼，少腹疼痛或遺尿等癥狀；至五七（女）或五八（男）前，均會出現(xiàn)納呆、胃脹、胃痛、惡冷食或泛酸、噯氣等脾胃系統(tǒng)癥狀；至七七（女）或八八（男）后即表現(xiàn)出各系統(tǒng)疾病的癥狀。其發(fā)病歷程與《素問·上古天真論》中論述人體腎精變化女子以七為基數(shù)，男子以八為基數(shù)的時間點(diǎn)相吻合。依據(jù)《靈樞·天年篇》記載“母為基，父為楯”的理論，總結(jié)歸納為這類人群是由于先天陽氣不足，陰寒內(nèi)盛，因寒伏于人體之虛處，稱之為伏寒，提出“先天伏寒”病因?qū)W說，“先天伏寒”病因所導(dǎo)致的臨床證候有別于陽虛，而是按照一定的規(guī)律演化，最后表現(xiàn)為氣（陽）虛氣滯，寒熱錯雜證候，

稱之為“伏寒證”。在臨床上針對“先天伏寒證”的證候特點(diǎn)，而創(chuàng)立伏寒顆粒，全方由仙靈脾、仙茅、巴戟天、黃芪、白術(shù)、黃柏、砂仁等藥組成，臨床療效確切[6-8]。

代謝組學(xué)把人體作為一個完整的系統(tǒng)來研究，這對揭示疾病的復(fù)雜機(jī)制和藥物在人體復(fù)雜的代謝模式具有獨(dú)特的優(yōu)勢，與中醫(yī)學(xué)的整體觀、系統(tǒng)觀和辨證論治思維非常相似[9]。代謝組學(xué)技術(shù)能夠很明顯的區(qū)分先天伏寒證病人和正常對照組的血清代謝物，通過對差異代謝物組分的分析、判斷，可以更好的理解冠心病先天伏寒證的病變過程及機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑和代謝狀況[10]，全面解析機(jī)體產(chǎn)生變化的病理本質(zhì)。

1 研究對象

1.1 研究對象來源及分組

觀察病例為2010年1月-2010年12月就診于長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科診斷為冠心病心絞痛的患者。選擇典型冠心病先天伏寒證患者（實(shí)驗(yàn)組）10例，10例體檢確定其身體健康的志愿者（正常對照組）。2組在性別、年齡方面經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

冠心病心絞痛的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2007年中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會、中華心血管病雜志編輯委員會制定《慢性穩(wěn)定性心絞痛診斷與治療指南》制定[11]，中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥治療胸痹（冠心病心絞痛）的臨床研究指導(dǎo)原則》[12]制定。先天伏寒證診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)黃永生教授臨床經(jīng)驗(yàn)并結(jié)合臨床回顧性流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果[2]制定。主癥：足涼或手足涼，疲乏，善太息，口干，心煩。次癥：氣短，背痛，胃痛或脹，惡冷喜熱食，納差，失眠。舌脈：舌淡隱青或舌尖紅體暗，苔薄白，脈沉弱或沉弦細(xì)弱。病史：女患者從月經(jīng)來潮（14歲左右）即有痛經(jīng)，足涼或手足涼，男患者從二八（即16歲左右）出現(xiàn)足涼或手足涼，少腹疼痛或遺尿。至35歲（女）或40歲（男）前，即出現(xiàn)胃疼、胃脹、納呆、惡冷食，或泛酸、噯氣。至49歲（女）或64歲（男）前即出現(xiàn)心痛癥狀。主癥、病史必備，次癥兼具2項(xiàng)以上，結(jié)合舌象、脈象，即可診斷。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

不符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；近半年內(nèi)服用過影響血脂代謝藥物或正在使用影響血脂代謝藥物的患者；過敏體質(zhì)及對多種藥物過敏者。

1.4 給藥方法

冠心病先天伏寒證組給予伏寒顆粒制劑，由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心加工，每次1袋，每日3次，溫開水沖服。療程為28天。

2 研究方法

2.1 儀器與試劑

超導(dǎo)傅里葉變換核磁共振波譜儀（AV-600），購自德國布魯克公司；京立LDZ5-2離心機(jī)購自北京醫(yī)用離心機(jī)廠；-80℃低溫冰箱購自Nuaire公司；

2.2 樣品的采集與處理：

所有患者于給藥前后分別空腹采靜脈血10 ml，離心，取上層血清樣品冷凍于-80℃超低溫保存箱中待測。實(shí)驗(yàn)時，將血清樣品室溫解凍后，低速離心機(jī)離心（3 000 r/min，15 min），取上清液放入5 mm樣品管中，與250 μl重水混合，保持體積在600 μl，待測。

2.3 氫核磁共振（1H-Nuclear Magnetic Resonance，1HNMR）數(shù)據(jù)采集

在20℃室溫的條件下，在AV-600 MHz超導(dǎo)傅立葉變化核磁共振波譜儀上測量。設(shè)置相關(guān)參數(shù)，然后進(jìn)行采樣，得到自由感應(yīng)衰減（Free induction decay，F(xiàn)ID）信號。經(jīng)過32 k點(diǎn)傅立葉變換得到一維NMR譜圖。

2.4 血清樣品1H-NMR譜數(shù)據(jù)處理

以乳酸在1.33 ppm處的雙峰定標(biāo)。積分區(qū)間為4.4-0.5 ppm，積分間距為0.002 ppm，將積分?jǐn)?shù)據(jù)按每一張譜的總強(qiáng)度歸一化之后，以Excel文件保存，以備主成分分析（Principal components analysis,PCA）時使用。

2.5 統(tǒng)計分析

將圖譜數(shù)據(jù)輸入到SIMCA-P+軟件進(jìn)行主成分分析。為了消除相關(guān)因素如個體差異等對分組的影響,強(qiáng)化組間差異，進(jìn)一步采用正交信號校正（Orthogonal signal correction，OSC）處理，再進(jìn)行偏最小二乘法判別分析（Partial least squares projection to latent structure discriminant analysis，PLS-DA）。

3 結(jié)果

3.1 各組血清1H-NMR圖譜比較（圖1）

3.2 治療前與正常組間血清代謝物OPLS-DA積分圖及負(fù)載圖（圖2）

從積分圖和相應(yīng)的負(fù)載圖可以反映出實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，血清樣本內(nèi)化合物所產(chǎn)生的1H-NMR圖譜的差異。與正常組相比，冠心病先天伏寒證組中丙氨酸、乳酸、低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、N-乙酰糖蛋白、脂類化合物等含量較高，而高密度脂蛋白含量則較低。

3.3 治療前后組間血清代謝物OPLS-DA積分圖及負(fù)載圖（圖3）

從積分圖和從相應(yīng)的負(fù)載圖可以反映出冠心病先天伏寒證組治療前組與治療后組比較，血清樣本內(nèi)化合物所產(chǎn)生的1H-NMR圖譜的差異。與治療前組相比，冠心病先天伏寒證患者治療后組中高密度脂蛋白含量較高，而乳酸、丙氨酸、低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、脂類化合物、N-乙酰糖蛋白等物質(zhì)含量較低。

圖1 各組典型的代謝譜圖和相應(yīng)的化學(xué)位移譜峰指認(rèn)

圖2 兩組血漿代謝物OPLS-DA積分圖及負(fù)載圖

圖3 兩組血漿代謝物OPLS-DA積分圖及負(fù)載圖

3.4 各組血清差異代謝物分析（表1）

結(jié)合上圖及下表我們可以看出，與正常組相比，冠心病先天伏寒證組中丙氨酸、乳酸、低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、N-乙酰糖蛋白、脂類化合物等含量較高，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而高密度脂蛋白含量則較低，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

與治療前組相比，冠心病先天伏寒證患者治療后組中高密度脂蛋白有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而乳酸、低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、脂類化合物有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

4 討論

臨床上冠心病先天伏寒證的患者具有“足涼或手足涼”這樣突出的癥狀，臨床往往易與陽虛混淆，或誤診為陽虛而治療。有人利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對先天伏寒證、陽虛證患者的血清樣本進(jìn)行檢測，得出伏寒組與陽虛組病人間的差異蛋白點(diǎn)很多，表達(dá)上調(diào)的蛋白有過氧化物氧化還原酶，纖維蛋白原，補(bǔ)體因子H，角蛋白，補(bǔ)體因子C4。表達(dá)下調(diào)的蛋白有人體絨模促性激素，維生素D，纖維蛋白原，糖蛋白，胰蛋白酶抑制劑，結(jié)合珠蛋白，載脂蛋白等。說明二者在體質(zhì)上或?qū)砑膊〉陌l(fā)生傾向上有所不同[13]。伏寒顆粒針對“先天伏寒證”的證候特點(diǎn)，而創(chuàng)立，功用為溫陽益氣，辛開苦降，疏肝理氣，調(diào)整陰陽，使陰陽合治，寒熱共調(diào)，標(biāo)本兼顧，辛開苦降，使陰陽調(diào)和而其痛自止。有部分研究表明，對30例冠心病先天伏寒證組給予伏寒顆粒制劑，每次1袋，每日3次，療程為28天。經(jīng)治療，冠心病先天伏寒證組的心絞痛療效、心電圖療效、中醫(yī)證候療效的總有效率分別為90%，60%，86.67%；硝酸甘油停減率為46.67%。在治療后心絞痛療效方面，將治療前、治療14天、治療28天心絞痛癥狀積分進(jìn)行比較，與治療前相比，治療14天、治療28天均可使心絞痛癥狀積分明顯下降；在治療后中醫(yī)證候療效方面，與治療前相比較，治療14天、治療28天均可使先天伏寒證候積分明顯下降，與治療前相比均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；給予冠心病先天伏寒兼血瘀證患者伏寒顆粒合血府逐瘀顆粒干預(yù)，在干預(yù)28天后血清hs-CRP、IL-6、TNF-α含量、全血TNF-αmRNA、IL-6-αmRNA表達(dá)、Hcy、IL-1β均有不同程度降低，血清ACTH、皮質(zhì)醇含量均有明顯升高。而對于實(shí)驗(yàn)組血清TNF-α、皮質(zhì)醇、ACTH含量、全血TNF-mRNA表達(dá)及Hcy、IL-1β改善作用更為明顯。說明伏寒方可以針對先天伏寒證候特征而起作用[14-16]。

冠心病先天伏寒證組與正常組的差異代謝物中乳酸是葡萄糖在無氧酵解條件下由丙酮酸降解而產(chǎn)生的，同時伴有三磷酸腺苷的生成。生理狀態(tài)下不作為主要供能途徑，血中乳酸維持動態(tài)平衡。心肌供血不足，使心肌攝入氧下降，細(xì)胞得不到充分氧供，三羧酸循環(huán)反應(yīng)受到抑制，產(chǎn)生減少，糖酵解增強(qiáng)，可造成乳酸堆積。因此乳酸水平的異常提示機(jī)體能量代謝失調(diào)。

與正常組相比，冠心病先天伏寒證患者存在著明顯的脂代謝異常。主要表現(xiàn)在脂類化合物，高密度脂蛋白，低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白。流行病學(xué)研究表明，高密度脂蛋白膽固醇含量與冠心病呈負(fù)相關(guān)，低密度脂蛋白膽固醇含量與冠心病呈正相關(guān)。本研究中，與正常組相比，冠心病先天伏寒證組中高密度脂蛋白含量較低，低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白含量較高，與流行病學(xué)研究結(jié)果一致。

谷氨酞胺的變化直接影響機(jī)體總氨基酸的代謝，在體內(nèi)許多代謝途徑上發(fā)揮重要作用，谷氨酰胺參與分解代謝，使組織對分解代謝、炎癥和感染作出最佳反應(yīng)，因此具有免疫增強(qiáng)效應(yīng)；谷氨酰胺也被稱為機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下的“條件必需氨基酸”，對于調(diào)節(jié)應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞代謝和免疫細(xì)胞功能有重要意義。而由谷氨酰胺轉(zhuǎn)化生成的谷胱甘肽有非常重要的抗氧化、抗損傷作用，在細(xì)胞的自我修復(fù)、抗衰老、抗凋亡方面具有非特異性保護(hù)作用。丙氨酸是體內(nèi)重要的非必需氨基酸，丙氨酸是淋巴細(xì)胞再生及免疫過程中重要的參與者。

表1 各組血清差異代謝物分析

N-乙酰糖蛋白的出現(xiàn)，說明凝血機(jī)制出現(xiàn)異常。因?yàn)閰⑴c血液凝固過程的纖維蛋白原、凝血酶原和幾種凝血因子都是糖蛋白。有研究表明乙酰糖蛋白譜峰的改變可能是高脂血癥大鼠模型血瘀的早期生物標(biāo)記物[17]。同時N-乙酰糖蛋白在調(diào)節(jié)物質(zhì)能量代謝，免疫調(diào)節(jié)等方面有重要作用。

綜上分析，冠心病先天伏寒證存在著能量代謝、糖脂代謝、免疫調(diào)節(jié)等多種代謝通路的異常，是整體多個系統(tǒng)功能共同改變的結(jié)果。這些異常可能導(dǎo)致能量生成不足，而產(chǎn)生手足涼，怕冷等臨床癥狀；糖、脂類等代謝障礙有可能導(dǎo)致氣血運(yùn)行不足，氣滯血瘀，而出現(xiàn)胸悶，疲乏，氣短等臨床癥狀，這與冠心病先天伏寒證的臨床表現(xiàn)一致。而血清這些代謝物的改變，說明在“先天伏寒證”狀態(tài)下，存在著能量代謝異常，供能不足（虛寒[18]）、凝血功能異常（氣滯血瘀）、脂類代謝異常（痰濁）、免疫功能異常（熱證客觀化指標(biāo)[19]）等一系列表現(xiàn)，這種虛實(shí)夾雜、寒熱錯雜的表現(xiàn)與先天伏寒證的證候特點(diǎn)一致。而從治療前后結(jié)果中分析，伏寒顆粒對乳酸、低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、脂類化合物、高密度脂蛋白等物質(zhì)含量改善明顯。因此我們認(rèn)為伏寒顆?？梢哉{(diào)整冠心病先天伏寒證患者的糖脂、能量代謝，并使之代謝網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)向正常狀態(tài)修復(fù)的趨勢，這可能是伏寒顆粒治療冠心病先天伏寒證的作用機(jī)制，復(fù)方藥物大都是通過多層次、多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)的整合作用協(xié)調(diào)干預(yù)人體的內(nèi)源性代謝物組來治療疾病，伏寒顆粒詳細(xì)的作用機(jī)制則仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，深入研究。