高效液相色譜法測定度魯特韋的手性雜質(zhì)

孫寶丹，周靈祺，柳宏巧，王忠美，李翔，王世輝*（.寧波諾柏醫(yī)藥有限公司，浙江 寧波 35000；.浙江朗華制藥有限公司，浙江 臺州 37000）

度魯特韋是一種人類免疫缺陷病毒類型1 整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制藥，臨床上適合與其他抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥聯(lián)用，治療成年、12 歲以上和體質(zhì)量超過40 kg 兒童的HIV-1 感染[1-3]。藥理學(xué)研究表明度魯特韋（4R，12S）構(gòu)型的抗病毒作用強(qiáng)于其他3個手性構(gòu)型（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1）[4-6]，因此在度魯特韋質(zhì)量控制方面，有效控制其他3 個手性雜質(zhì)非常有必要，但國內(nèi)目前尚未見關(guān)于手性檢測這方面的報道。本研究建立了度魯特韋手性雜質(zhì)的高效液相色譜檢測方法，可作為度魯特韋原料藥和制劑手性純度的評價方法。

圖1 度魯特韋及手性雜質(zhì)A、B、C 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Structure of dolutegravir and chiral impurities A，B and C

1 儀器與試藥

高效液相色譜HPLC（安捷倫1200，配備DAD 檢測器，Chemstation 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；XS205分析天平（十萬分之一，瑞士Mettler Toledo 公司），度魯特韋供試品（原料藥批號：1910001、1910002、1910003； 片劑批號：W66M；Glaxo Opearations UK Ltd），度魯特韋（批號：RS-1909001，含量：99.9%）、手性雜質(zhì)A（批號：RSCIMPA-1909001，含量：99.2%）、手性雜質(zhì)B（批號：RS-CIMPB-1909001，含量：92.0%）、手性雜質(zhì)C（批號：RS-CIMPC-1909001，含量：91.2%）對照品（浙江朗華制藥有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，Honeywell）；超純水；磷酸色譜級（阿拉?。?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DAICEL OJ-RH（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流速：0.4 mL·min－1；柱溫：40℃；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL；以0.2%磷酸水溶液為流動相A，甲醇為流動相B，乙腈為流動相C，梯度洗脫程序見表1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 溶劑 流動相A∶流動相B ＝1∶1（V/V）。

2.2.2 供試品溶液 稱取度魯特韋供試品25 mg置于50 mL 量瓶中，用溶劑超聲溶解并定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

表1 梯度洗脫程序表(%)Tab 1 Gradient elution programme (%)

2.2.3 0.20%對照溶液 稱取度魯特韋對照品25 mg，置于50 mL 量瓶中，用溶劑超聲溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液；精密移取對照品溶液0.2 mL，置于100 mL 量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為0.20%對照溶液。

2.2.4 混合手性雜質(zhì)對照品溶液 稱取對照品度魯特韋25 mg、手性雜質(zhì)A 25 mg、手性雜質(zhì)B 25 mg 和手性雜質(zhì)C 21 mg 置于100 mL 量瓶中，用溶劑溶解并稀釋至刻度，移取上述溶液5 mL 置于25 mL 量瓶中，加入溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為混合手性雜質(zhì)對照品儲備液。移取上述混合手性雜質(zhì)對照品儲備液1.5 mL 置于100 mL 量瓶中，加入溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為混合手性雜質(zhì)對照品溶液。

2.2.5 混合對照品溶液 稱取度魯特韋對照品25.0 mg，置于50 mL 量瓶中，用“2.2.4”項下混合手性雜質(zhì)對照品溶液溶解至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗 分別量取“2.2”項下的溶劑、供試品溶液、混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果度魯特韋保留時間約為18 min，理論板數(shù)按度魯特韋峰計為6370，與相鄰手性雜質(zhì)峰分離度為2.5，拖尾因子1.17，符合要求（見圖2）。

圖2 度魯特韋手性檢測系統(tǒng)適用性圖譜Fig 2 Chromatograms of system suitability test for dolutegracir

2.3.2 定量限和檢測限 取“2.2.4”項下混合手性雜質(zhì)對照品溶液進(jìn)行逐級稀釋，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析。當(dāng)信噪比（S/N）為3∶1 時，測得度魯特韋和手性雜質(zhì)A、B、C 的檢測限分別為25、25、27、30 ng·mL－1；當(dāng)信噪比（S/N）為10∶1 時，測得度魯特韋和手性雜質(zhì)A、B、C 的定量限分別為83、83、89、100 ng·mL－1。

2.3.3 儀器精密度 取“2.2”項下系統(tǒng)適用性溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果度魯特韋及手性雜質(zhì)A、B 和C 的RSD分別為0.00%、0.20%、0.89%和1.1%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性 按照“2.2.5”項下混合對照品溶液配制方法，平行配制6 份溶液，由同一分析人員進(jìn)樣分析，測定其手性純度。結(jié)果度魯特韋峰和手性雜質(zhì)A、B、C 的RSD分別為0.00%、1.9%、2.7%和1.6%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 中間精密度 在不同時間，使用不同儀器，由不同分析人員按照“2.2.5”項下混合對照品溶液的配制方法，平行配制6 份溶液，按“2.1”項下色譜條件測定其手性純度，結(jié)果度魯特韋、手性雜質(zhì)A、B 和C 的RSD結(jié)果分別為0.00%、2.6%、5.0%和2.9%（n＝2），結(jié)果表明中間精密度良好。

2.3.6 溶液穩(wěn)定性 取“2.2.2”項下的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件每隔2 h 進(jìn)樣分析，結(jié)果度魯特韋和手性雜質(zhì)C 在48 h 內(nèi)RSD分別為0.40%和0.00%；手性雜質(zhì)A 和B 在48 h 內(nèi)均未檢出，結(jié)果表明供試品溶液在48 h 內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.3.7 線性關(guān)系考察 分別移取“2.2.4”項下混合手性雜質(zhì)對照品儲備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和5.0 mL 置100 mL 量瓶中，加入溶劑稀釋至刻度，配制成線性溶液；分別進(jìn)樣上述線性溶液，記錄色譜峰面積。以度魯特韋和各手性雜質(zhì)的峰面積（A）對質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法（雜質(zhì)斜率除以主成分斜率），計算各雜質(zhì)與主成分的校正因子，結(jié)果見表2，度魯特韋和手性雜質(zhì)A、B、C 在對應(yīng)線性范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表2 線性結(jié)果表Tab 2 Linearity

2.3.8 準(zhǔn)確度 準(zhǔn)確稱取1910001 批次度魯特韋供試品共9 份，每個準(zhǔn)確度水平配制3 份雜質(zhì)加樣溶液，進(jìn)樣測定。各雜質(zhì)在0.05%、0.15%和0.25%水平進(jìn)行加樣配制。手性雜質(zhì)A、B、C 平均加樣回收率均在81.38%～100.7%，RSD均在0.33%～4.2%，準(zhǔn)確度良好。

2.3.9 耐用性 取“2.2”項下的系統(tǒng)適用性溶液，分別在流速變化（±0.05 mL·min－1）、色譜柱溫度變化（±5℃）、檢測波長變化（±2 nm）、磷酸濃度變化（±0.05%）等色譜條件下進(jìn)行測定，測得系統(tǒng)適用性均滿足要求，表明在其他條件不變的情況下，流速、柱溫和波長的微小變化對度魯特韋與手性雜質(zhì)的分離均無明顯影響，說明該方法耐用性較好。

2.3.10 供試品手性雜質(zhì)檢測 依法對1 批片劑和3批原料藥供試品進(jìn)行手性雜質(zhì)檢測，結(jié)果見表3。

表3 度魯特韋批含量檢測結(jié)果表Tab 3 Content determination of dolutegravir

3 討論

3.1 波長的選擇

對手性雜質(zhì)混合溶液儲備液在200 ～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外最大吸收掃描，發(fā)現(xiàn)度魯特韋和其手性雜質(zhì)的最大吸收波長均為254 nm，因此選擇254 nm 作為檢測波長。

3.2 色譜柱的選擇

考察了IC、AD-3R 和OJ-RH 3 種手性色譜柱對度魯特韋和手性雜質(zhì)分離的情況。IC 柱：度魯特韋峰拖尾嚴(yán)重，與手性雜質(zhì)無法分離；AD-3R 柱：度魯特韋與雜質(zhì)A 和B 分離較好，但與雜質(zhì)C 分離選擇性差，調(diào)整洗脫程序，改善不大；OJ-RH 柱：對度魯特韋和手性雜質(zhì)A、B 和C 都有較好的選擇性，因此最終選擇OJ-RH 作為檢測色譜柱。

3.3 流動相的選擇

度魯特韋和手性雜質(zhì)A、B 和C 都是鈉鹽，易溶于酸性溶液，因此選擇磷酸水溶液作為水相；考察了乙腈、甲醇、異丙醇作為有機(jī)相時度魯特韋和各手性雜質(zhì)分離的情況，手性選擇性：乙腈＜甲醇≈異丙醇，但是甲醇和異丙醇洗脫能力較弱，尤其是異丙醇，即使占流動相比例高達(dá)75%，度魯特韋的出峰時間仍然很晚，峰展寬非常嚴(yán)重，因此最終將甲醇和乙腈相結(jié)合作為有機(jī)相，這樣既滿足分離要求，又能提高洗脫能力。

綜上所述，本文所建立的高效液相色譜法可以準(zhǔn)確測定度魯特韋的手性雜質(zhì)，方法學(xué)研究表明該方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，且能為度魯特韋原料藥甚至是制劑的手性雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供技術(shù)支持。