環(huán)狀RNA叉頭框蛋白O3靶向微小RNA-122-5p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響▲

趙彥煥 張東姣 樊麗偉 汪景坤 李 洵 付曉霞 張 磊 趙玉紅

(中國(guó)人民解放軍第八十二集團(tuán)軍醫(yī)院消化內(nèi)科，河北省保定市 071000，電子郵箱：muf67d@163.com)

結(jié)直腸癌是臨床常見的一種惡性腫瘤，目前結(jié)直腸癌的治療技術(shù)已取得巨大進(jìn)步，但結(jié)直腸癌晚期患者的預(yù)后仍較差。局部浸潤(rùn)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡率升高的主要原因，因而探究結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義[1]。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類特殊的非編碼RNA分子，是在mRNA剪接過(guò)程中上游5′端與下游3′端拼接在一起形成的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，大部分circRNA具有普遍性、穩(wěn)定性與保守性等特點(diǎn)。研究表明circRNA可參與結(jié)直腸癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，其可通過(guò)堿基配對(duì)的原則與微小RNA(microRNA，miRNA)結(jié)合從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，因此其有可能成為結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)[2-4]。環(huán)狀RNA叉頭框蛋白O3(circular RNA forkhead box protein O3，circFOXO3)在胃癌組織中高表達(dá)，并可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[5]。但circFOXO3與結(jié)直腸癌之間關(guān)系的相關(guān)研究報(bào)告尚少。一項(xiàng)生物信息學(xué)分析顯示circFOXO3與miRNA-122-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，研究表明miRNA-122-5p在結(jié)直腸癌組織與細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展[6]。但circFOXO3/miRNA-122-5p分子軸是否參與結(jié)直腸癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程尚未可知。因此，本研究探討circFOXO3是否可通過(guò)靶向調(diào)控miRNA-122-5p從而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源與試劑 選取2018年12月至2020年1月本院收治的38例結(jié)直腸癌患者為研究對(duì)象。所有患者均經(jīng)病理診斷證實(shí)為結(jié)直腸癌，其中男性28例、女性10例，年齡53～70(61.03±6.11)歲。術(shù)中切除患者的癌組織及其相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本后立即置于液氮中保存。人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司(批號(hào)：20190203)；胎牛血清(批號(hào)：20181118)、Lipofectamine2000(批號(hào)：20181215)、TRIzol試劑(批號(hào)：20181203)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：20190103)與熒光定量PCR試劑盒(批號(hào)：20181225)購(gòu)自北京天根生化公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)(cell counting kit-8，CCK-8)試劑購(gòu)自上海碧云天生物公司(批號(hào)：20190208)；Transwell小室(批號(hào)：20181212)、Matrigel基質(zhì)膠(批號(hào)：20190211)購(gòu)自北京索萊寶公司；si-NC、si-circFOXO3、miRNA-NC、miRNA-122-5p模擬物、抗miRNA-122-5p-NC、抗miRNA-122-5p購(gòu)自廣州銳博生物公司；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2(批號(hào)：20190216)、MMP-9抗體(批號(hào)：20190218)與辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(批號(hào)：20181206)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116用胰蛋白酶消化后，按照1×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板，加入DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到80%時(shí)，更換無(wú)血清的培養(yǎng)基，用Lipofectamine2000試劑(10 μL)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分組：si-NC組(轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L的si-NC)、si-circFOXO3組(轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L的si-circFOXO3)、miRNA-NC組(轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L的miRNA-122-5p-NC)、miRNA-122-5p組(轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L的miRNA-122-5p-模擬物)、si-circFOXO3+抗miRNA-NC組(共轉(zhuǎn)染終濃度為si-circFOXO3與終濃度為50 nmol/L的抗miRNA-122-5p-NC)、si-circFOXO3+抗miRNA-122-5p組(共轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L的si-circFOXO3與終濃度為50 nmol/L的抗miRNA-122-5p)。轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清的正常DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)circFOXO3、miRNA-122-5p的相對(duì)表達(dá)水平 用TRIzol法分別提取癌旁組織、結(jié)直腸癌組織與轉(zhuǎn)染后HCT116細(xì)胞的總RNA，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，運(yùn)用熒光定量PCR試劑盒分析circFOXO3[以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參]、miRNA-122-5p(以U6內(nèi)參為內(nèi)參)的相對(duì)表達(dá)水平。檢測(cè)儀器為StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。circFOXO3正向引物序列為5′-GTGGGGAACTTCACTGGTGCTAAG-3′，反向引物序列為5′-GGGTTGATGATCCACCAAGAGCTCTT-3′；GAPDH正向引物序列為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向引物序列為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；miRNA-1225-5p正向引物序列為5′-ACAGTGCGGTCTACGCATGCGTTCGGTAGACAGTCGTAG-3′，反向引物序列為5′-GCGACAGCTGCTTACGTAGGATGCGCGCATAGCTTGCAG-3′；U6正向引物序列為5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物序列為5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系包括10×PCR 緩釋液2.5 μL、MgSO42.5 μL、dNTPs 2.5 μL、正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至25 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min，95℃變性60 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集轉(zhuǎn)染后的HCT116細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，3 000 r/min離心10 min，收集重懸細(xì)胞，按照1×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，分別加入CCK-8試劑10 μL和DMEM培養(yǎng)液100 μL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，用SpectraMax化學(xué)發(fā)光型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(北京悅昌行科技有限公司)檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染后的HCT116細(xì)胞，按照1×103個(gè)/孔的密度接種于6孔板，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2 d更換一次培養(yǎng)液，直至出現(xiàn)細(xì)胞集落時(shí)終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌，用4%多聚甲醛固定30 min，用0.1%結(jié)晶紫染色液染色20 min，蒸餾水沖洗后晾干，觀察細(xì)胞克隆形成數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲 進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)直接將各組HCT116細(xì)胞懸液加入Transwell小室上層(密度4×104個(gè)/mL，200 μL/孔)，進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)需要預(yù)先在Transwell小室上層鋪Matrigel基質(zhì)膠稀釋液(3 mg/mL，40 μL/孔)，將Transwell小室置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后，在上層加入各組HCT116細(xì)胞懸液(密度為6×104個(gè)/mL，200 μL/孔)；下層加入600 μL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，磷酸緩沖鹽溶液沖洗，用4%多聚甲醛固定下層細(xì)胞20 min，用0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，用倒置顯微鏡觀察小室下層細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)circFOXO3與miRNA-122-5p的靶向關(guān)系 通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)starBase(https://starbase.sysu.edu.cn/agoClipRNA.php?source=lncRNA&flag=target&clade=mammal&genome=human&assembly=hg19&miRNA=all&clipNum=1&deNum=0&panNum=0&target=DLGAP4)預(yù)測(cè)circFOXO3的靶基因，將含有circFOXO3與miRNA-122-5p的結(jié)合位點(diǎn)序列片段(由美國(guó)Promega公司構(gòu)建)導(dǎo)入pGL3雙熒光素酶報(bào)告載體(美國(guó)Promega)中構(gòu)建野生型載體WT-circFOXO3，用基因突變技術(shù)對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，將含有突變位點(diǎn)的序列片段導(dǎo)入pGL3雙熒光素酶報(bào)告載體中構(gòu)建突變型載體MUT-circFOXO3，用80 ng熒光素酶報(bào)告載體(美國(guó)Promega)分別與miRNA-122-5p-NC、miRNA-122-5p模擬物利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑共同轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞，24 h后用Dual Luciferase Reporter System(美國(guó)Promega)檢測(cè)熒光素酶活性。以海腎熒光素酶報(bào)告基因活性值為內(nèi)參，計(jì)算各組細(xì)胞熒光素酶活性值(螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因活性值/海腎熒光素酶報(bào)告基因活性值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)MMP-2、MMP-9蛋白的相對(duì)表達(dá)水平 用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取1.2轉(zhuǎn)染后的HCT116細(xì)胞總蛋白，用二喹啉甲酸法定量蛋白，取10 μg蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入MMP-2(1 ∶1 000)、MMP-9(1 ∶1 000)一抗與內(nèi)參GAPDH(1 ∶1 000)，4℃反應(yīng)24 h，TBST洗滌，加入二抗(1 ∶2 000)，室溫反應(yīng)1 h，TBST洗膜，電化學(xué)發(fā)光顯影后采集蛋白圖像，目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值即為目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 circFOXO3與miRNA-122-5p在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及相關(guān)性 與癌旁組織比較，結(jié)直腸癌組織中circFOXO3的表達(dá)水平升高，miRNA-122-5p的表達(dá)水平降低(均P<0.05)，見表1。結(jié)直腸癌組織中circFOXO3與miRNA-122-5p的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.719，P<0.001)。

表1 circFOXO3與miRNA-122-5p在結(jié)直腸癌和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)水平(x±s)

2.2 干擾circFOXO3表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞生物學(xué)行為、相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響 與si-NC組比較，si-circFOXO3組的miRNA-122-5p表達(dá)水平升高，circFOXO3表達(dá)水平下調(diào)，細(xì)胞活力降低，克隆形成數(shù)、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少，MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平下降(均P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 干擾circFOXO3表達(dá)后HCT116細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)情況

表2 兩組HCT116細(xì)胞生物學(xué)行為、相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的比較(x±s)

2.3 circFOXO3與miRNA-122-5p的靶向關(guān)系 circFOXO3與miRNA-122-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖2。轉(zhuǎn)染miRNA-122-5p模擬物可明顯降低野生型載體WT-circFOXO3的熒光素酶活性(P<0.05)，而對(duì)突變型載體MUT-circFOXO3的熒光素酶活性無(wú)明顯影響(P>0.05)，見表3。

圖2 starBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示circFOXO3與miRNA-122-5p存在結(jié)合位點(diǎn)

表3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果(x±s)

2.4 miRNA-122-5p過(guò)表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞生物學(xué)行為、相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響 與miRNA-NC組比較，miRNA-122-5p組的細(xì)胞miRNA-122-5p表達(dá)上調(diào)，活力降低，克隆形成數(shù)、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均減少，MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平降低(均P<0.05)，見圖3、表4。

圖3 miRNA-122-5p過(guò)表達(dá)后HCT116細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)情況

表4 miRNA-122-5p過(guò)表達(dá)后HCT116細(xì)胞生物學(xué)行為、相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的比較(x±s)

2.5 抑制miRNA-122-5p表達(dá)聯(lián)合干擾circFOXO3表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞生物學(xué)行為、相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響 與si-circFOXO3+抗miRNA-NC組比較，si-circFOXO3+抗miRNA-122-5p組的miRNA-122-5p表達(dá)水平下調(diào)，細(xì)胞活力升高，克隆形成數(shù)、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均增多，MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平升高(均P<0.05)，見圖4、表5。

圖4 抑制miRNA-122-5p表達(dá)聯(lián)合干擾circFOXO3表達(dá)后HCT116細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)情況

表5 抑制miRNA-122-5p表達(dá)聯(lián)合干擾circFOXO3表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞生物學(xué)行為、相關(guān)基因和蛋白表達(dá)影響的比較(x±s)

3 討 論

circRNA廣泛存在于生物細(xì)胞中，目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)circRNA的表達(dá)異常與結(jié)直腸癌有關(guān)，主要分為促癌circRNA與抑癌circRNA，可調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為。例如，hsa-circRNA-102958通過(guò)miRNA-585/CDC25B軸促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生[7]；circHIPK3通過(guò)充當(dāng)miRNA-7的海綿分子促進(jìn)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[8]；circRNA-0000392通過(guò)miRNA-193a-5p促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展[9]；circRNA CBL.11通過(guò)充當(dāng)miRNA-6778-5p的海綿分子抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖[10]。circRNA在結(jié)直腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制成為研究熱點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中circFOXO3的表達(dá)水平升高，干擾circFOXO3表達(dá)可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞活力，且使細(xì)胞克隆形成數(shù)減少(P<0.05)，提示干擾circFOXO3表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及克隆形成。MMP與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，其中MMP-2、MMP-9在結(jié)直腸癌中的水平升高，可通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)沉積而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[11-12]。本研究結(jié)果顯示，干擾circFOXO3表達(dá)后結(jié)直腸癌遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均減少，MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，提示干擾circFOXO3表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移及侵襲。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中miRNA-122-5p的表達(dá)水平降低，circFOXO3與miRNA-122-5p的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，且干擾circFOXO3表達(dá)后可明顯促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中miRNA-122-5p的表達(dá)(P<0.05)，提示circFOXO3可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控miRNA-122-5p的表達(dá)從而參與結(jié)直腸癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。研究表明，miRNA-122-5p通過(guò)下調(diào)雙特異性磷酸酶4抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲[13]，并可通過(guò)靶向LYN激酶抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[14]。此外，miRNA-122-5p還可通過(guò)靶向特異AT序列結(jié)合蛋白1抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[15]。這些研究表明miRNA-122-5p在腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能發(fā)揮抑癌基因作用。本研究結(jié)果通過(guò)雙熒光酶報(bào)告基因檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)，結(jié)直腸癌細(xì)胞中circFOXO3與miRNA-122-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，并可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA-122-5p。此外，miRNA-122-5p過(guò)表達(dá)可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞活力、克隆形成、遷移及侵襲能力，而抑制miRNA-122-5p表達(dá)可明顯拮抗干擾circFOXO3表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用。提示circFOXO3靶向miRNA-122-5p促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中circFOXO3表達(dá)水平升高，而miRNA-122-5p表達(dá)水平降低，干擾circFOXO3表達(dá)可通過(guò)負(fù)向調(diào)控miRNA-122-5p從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲。由此可見circFOXO3可充當(dāng)miRNA-122-5p的海綿分子而參與結(jié)直腸癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，其或可作為結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)。這為進(jìn)一步闡釋結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，下一步實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circFOXO3/miRNA-122-5p分子軸在結(jié)直腸癌發(fā)生過(guò)程中的作用機(jī)制，進(jìn)一步探尋miRNA-122-5p的可能作用靶點(diǎn)，以明確circRNA-miRNA-mRNA分子軸在結(jié)直腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制。