培養(yǎng)基配方對(duì)貝萊斯芽胞桿菌FJAT-45028脂肽產(chǎn)量和抑菌活性的影響

陳燕萍 陳梅春 藍(lán)江林 鄭梅霞 劉波 王階平

摘 要：探究培養(yǎng)基配方對(duì)貝萊斯芽胞桿菌FJAT-45028脂肽產(chǎn)量和抑菌活性的影響，篩選出菌株產(chǎn)脂肽的最佳培養(yǎng)基配方。通過酸沉淀、醇溶法提取菌株FJAT-45028發(fā)酵產(chǎn)生的粗脂肽，利用液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-QTOF-MS）測(cè)定脂肽組成和含量，并以龍眼致腐菌小新殼梭孢菌為指示菌，評(píng)估脂肽的抑菌活性。結(jié)果表明：貝萊斯芽胞桿菌FJAT-45028在供試的12種培養(yǎng)基中發(fā)酵后均能產(chǎn)生脂肽，粗脂肽產(chǎn)量范圍為2.28～4.86 g·L-1，抑菌圈直徑范圍為12.46～20.02 mm。LC-QTOF-MS分析結(jié)果顯示，菌株FJAT-45028產(chǎn)生的脂肽由伊枯草菌素、豐原素和表面活性素組成，不同培養(yǎng)基中產(chǎn)生的伊枯草菌素、豐原素和表面活性素的含量范圍分別是0.46～63.49 mg·L-1、34.07～918.86 mg·L-1和7.00～53.24 mg·L-1。相關(guān)性分析表明，伊枯草菌素和豐原素含量以及脂肽總量均與抑菌活性呈顯著正相關(guān)（P<0.01）。以抑菌活性和脂肽產(chǎn)量為指標(biāo)，篩選出貝萊斯芽胞桿菌FJAT-45028產(chǎn)脂肽的最佳培養(yǎng)基配方為：蔗糖20 g·L-1、酵母浸膏20 g·L-1、牛肉浸膏15 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.6 g·L-1、FeSO4·7H2O 9.0 mg·L-1。該研究篩選到了適于產(chǎn)抑菌脂肽的培養(yǎng)基，為菌株FJAT-45028抑菌脂肽的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：貝萊斯芽胞桿菌FJAT-45028;脂肽產(chǎn)量;培養(yǎng)基組分;抑菌活性

中圖分類號(hào)：S 476.1?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：0253-2301（2021）12-0026-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.12.005

Effect of Culture Medium Formula on Yield and Antibacterial Activity of theLipopeptides Produced by Bacillus velezensis FJAT-45028

CHEN Yan-ping， CHEN Mei-chun， LAN Jiang-lin， ZHENG Mei-xia， LIU Bo， WANG Jie-ping*

（Institute of Agricultural Biological Resources， Fujian Academy ofAgricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： In this study， effect of culture medium formula on yield and antibacterial activity of the lipopeptides produced by Bacillus velezensis FJAT-45028 was investigated to obtain the optimal medium for production of the antibacterial lipopeptides. The crude lipopeptides were extracted by acid precipitation and alcoholysis. Their component and content were determined using a liquid chromatography coupled with a quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry （LC-QTOF-MS）. The antifungal activity of the lipopeptides was evaluated byusing Neofusicoccum parvum as an indicator， which is a rot-causing fungus of the Longan fruits. The results showed that the strain FJAT-45028 could yield lipopeptides in the twelve tested culture media. Moreover， content of the crude lipopeptides varied from 2.28 g·L-1 to 4.86 g·L-1， and the diameters of inhibition zone varied from 12.46 mm to 20.02 mm. The results of LC-QTOF-MS detection indicated that the lipopeptides produced by FJAT-45028 were composed by iturin， fengycin and surfactin， and their contents in the twelve culture media varied within the range of 0.46-63.49 mg·L-1， 34.07-918.86 mg·L-1， and 7.00-53.24 mg·L-1， respectively. The correlation analysis indicated that the contents of iturin， fengycin and total lipopeptides were significantly positive correlation with the antifungal activities （P<0.01）. Finally， an optimal medium formula for production of the lipopeptides with antifungal activities by B. velezensis FJAT-45028 was as follow： Sucrose 20 g·L-1， yeast extract 20 g·L-1， beef extract 15 g·L-1， MgSO4·7H2O 0.6 g·L-1， FeSO4·7H2O 9.0 mg·L-1， according to the antifungal activities and yield of the lipopeptides. In conclusion，the suitable medium for production of the antifungal lipopeptides was established， which laying the foundation for the industrial production of the antifungal lipopeptides from the strain FJAT-45028.

Key words： Bacillus velezensis FJAT-45028; Yield of lipopeptide; Components of the culture medium; Antibacterial activity

芽胞桿菌脂肽具有廣譜抗菌活性、穩(wěn)定性好、不易產(chǎn)生耐藥性、對(duì)人畜毒性低且對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，可用于防治水果采后病害。例如，枯草芽胞桿菌fmbJ產(chǎn)生的脂肽可延緩桃子的腐爛，防腐效率達(dá)76.5%[1];貝萊斯芽胞桿菌HN-2的脂肽對(duì)芒果炭疽菌具有強(qiáng)拮抗作用[2];解淀粉芽胞桿菌BA168產(chǎn)生的豐原素fengycin能夠有效抑制蘋果采后病害青霉病原菌的生長(zhǎng)[3]。

芽胞桿菌脂肽是通過非核糖體途徑合成的，優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件，能夠大幅度提升脂肽產(chǎn)量。例如，枯草芽胞桿菌YHI在無碳源供應(yīng)時(shí)，菌體幾乎不產(chǎn)脂肽，添加淀粉+米糠油為碳源后，脂肽產(chǎn)量比以葡萄糖為碳源高出104.4%[4];枯草芽胞桿菌T500在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加蛋白胨和酵母粉進(jìn)行優(yōu)化后，表面活性素surfactin的產(chǎn)量提高了48.2%，伊枯草菌素iturin的產(chǎn)量提高了180.9%，同時(shí)還檢測(cè)到了基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)無法產(chǎn)生的豐原素[5]。本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得了1株能夠有效抑制龍眼采后致腐病原菌小新殼梭孢菌Neofusicoccum parvum生長(zhǎng)的貝萊斯芽胞桿菌FJAT-45028，該菌發(fā)揮拮抗作用的主要活性成分為脂肽。為提升該菌株的脂肽產(chǎn)量和抑菌活性，本研究利用液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-QTOF-MS/MS）技術(shù)，分析了菌株FJAT-45028在12種不同培養(yǎng)基中的脂肽組成和產(chǎn)量，并結(jié)合抑菌活性，篩選出菌株FJAT-45028產(chǎn)脂肽的最佳培養(yǎng)基配方，為脂肽在龍眼采后病害的防控應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis FJAT-45028、龍眼采后致腐菌小新殼梭孢菌Neofusicoccum parvum FJAT-3531，均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所實(shí)驗(yàn)室分離、保存。

本試驗(yàn)所需的培養(yǎng)基配方見表1，各培養(yǎng)基試劑均購(gòu)買于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) （1）貝萊斯芽胞桿菌FJAT-45028培養(yǎng)：菌株FJAT-45028接種至50 mL LB液體培養(yǎng)基中，30℃、170 r·min-1 振蕩培養(yǎng)24 h，作為種子液。按1%接種量接種至50 mL不同的培養(yǎng)基中（表1），25℃、170 r·min-1 振蕩培養(yǎng)48 h。（2）小新殼梭孢菌FJAT-3531培養(yǎng)：FJAT-3531接種至50 mL的PDA培養(yǎng)基中，30℃、170 r·min-1培養(yǎng)48 h，濃度調(diào)整為107 CFU·mL-1備用。

1.2.2 脂肽制備 貝萊斯芽胞桿菌FJAT-45028發(fā)酵液離心棄去菌體得上清液，上清液加2 mol·L-1鹽酸至pH<2，4℃靜置24 h，離心得沉淀，加入磷酸鹽緩沖溶液（PBS）溶解后，經(jīng)低溫真空冷凍干燥后為粗脂肽粉末，稱重記錄所得粗脂肽產(chǎn)量。

1.2.3 脂肽組成測(cè)定 參照文獻(xiàn)Chen等[6]方法，利用LC-QTOF-MS/MS技術(shù)進(jìn)行脂肽組成和含量測(cè)定。脂肽iturin、fengycin和surfactin的含量定義為每升上清液所含有的脂肽量（mg·L-1）。

1.2.4 抑菌活性檢測(cè) 采用抑菌圈法進(jìn)行貝萊斯芽胞桿菌FJAT-45028脂肽對(duì)小新殼梭孢菌FJAT-3531的抑菌活性測(cè)定。吸取準(zhǔn)備好的病原菌懸浮液適量，加入到50℃左右的半固體PDA培養(yǎng)基中（瓊脂含量0.9%），使得病原菌終濃度為5×105 CFU·mL-1，并倒置于已凝固的PDA固體培養(yǎng)基上（瓊脂含量1.8%）。待培養(yǎng)基凝固后，采用直徑為7 mm的打孔器進(jìn)行打孔，分別在孔中注入甲醇溶解的濃度為30 mg·mL-1的脂肽溶液80 μL，無菌甲醇溶液為空白對(duì)照，以0.5 mg·mL-1的潮霉素為陽性對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，30℃培養(yǎng)3 d后，測(cè)抑菌圈直徑。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用DPS 18.10軟件，Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析，多元回歸法進(jìn)行脂肽含量和抑菌活性相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基配方對(duì)貝萊斯芽胞桿菌FJAT-45028粗脂肽產(chǎn)量的影響

由表2可知，菌株FJAT-45028在12種培養(yǎng)基中均能產(chǎn)生脂肽，不同培養(yǎng)基的粗脂肽產(chǎn)量范圍為2.28～4.86 g·L-1，其中最高產(chǎn)量的是最低產(chǎn)量的2.13倍;菌株FJAT-45028在K、L、F和C這4種培養(yǎng)基中的粗脂肽產(chǎn)量顯著高于其他培養(yǎng)基（P<0.05），這4種培養(yǎng)基的脂肽產(chǎn)量無顯著差異（P>0.05）;而利用H和B培養(yǎng)基發(fā)酵的脂肽產(chǎn)量最低，僅為2.31 g·L-1和2.28 g·L-1。對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加甘油或山梨醇能顯著提高脂肽的產(chǎn)量。

2.2 培養(yǎng)基配方對(duì)貝萊斯芽胞桿菌FJAT-45028抑菌活性的影響

由表3可知，菌株FJAT-45028在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)生的脂肽對(duì)龍眼致腐菌小新殼梭孢菌均有抑菌活性，其抑菌圈直徑范圍為12.46～20.02 mm;菌株FJAT-45028在培養(yǎng)基F中產(chǎn)生的脂肽抑菌活性顯著高于其他培養(yǎng)基（P<0.05），抑菌圈直徑為20.02 mm;其次，其他培養(yǎng)基所產(chǎn)脂肽抑菌活性僅次于培養(yǎng)基F的有C、J、I、G、L、K、H，該菌在這7組培養(yǎng)基中脂肽抑菌活性無顯著性差異（P>0.05）;而利用培養(yǎng)基A和B所產(chǎn)脂肽的抑菌活性最差，抑菌圈直徑僅為13.53 mm和12.46 mm。對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)富含碳源、氮源和無機(jī)鹽的培養(yǎng)基產(chǎn)生的脂肽具有較好的抑菌效果。綜合考慮粗脂肽產(chǎn)量和抑菌活性，篩選的貝萊斯芽胞桿菌FJAT-45028產(chǎn)脂肽最佳培養(yǎng)基配方為F培養(yǎng)基，即蔗糖20 g·L-1、酵母浸膏20 g·L-1、牛肉浸膏15 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.6g·L-1、FeSO4·7H2O 9.0 mg·L-1。

2.3 培養(yǎng)基配方對(duì)貝萊斯芽胞桿菌FJAT-45028產(chǎn)脂肽組成含量的影響

從表4可知，12種培養(yǎng)基產(chǎn)生的脂肽均含有伊枯草菌素、豐原素、表面活性素三大家族化合物，脂肽總含量范圍在41.52～988.18 mg·L-1，最大含量是最低含量的23.8倍。伊枯草菌素含量范圍在0.46～63.49 mg·L-1，其中菌株FJAT-45028在培養(yǎng)基中伊枯草菌素含量大小前四者的依次為L(zhǎng)>C>F>K;豐原素含量范圍在34.07～918.86 mg·L-1，各培養(yǎng)基中豐原素含量大小前四者的依次為F>K>L>C;表面活性素含量范圍在7.00～53.24 mg·L-1，各培養(yǎng)基中表面活性素含量大小前四者的依次為C>J>I>K。分析發(fā)現(xiàn)，伊枯草菌素和豐原素含量在前四者的培養(yǎng)基均為F、K、L、C，伊枯草菌素、豐原素、表面活性素含量最低者均為B培養(yǎng)基，說明富含碳源、氮源及無機(jī)鹽的培養(yǎng)基有利于貝萊斯芽胞桿菌FJAT-45028脂肽組分中伊枯草菌素和豐原素的合成。

2.4 貝萊斯芽胞桿菌FJAT-45028脂肽組分含量與抑菌活性相關(guān)性分析

脂肽對(duì)龍眼致腐菌小新殼梭孢菌FJAT-3531的抑菌活性與伊枯草菌素含量、豐原素含量及總脂肽含量間相關(guān)系數(shù)分別為0.7678**、0.7351**和0.7625**，均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），而與表面活性素含量相關(guān)系數(shù)為0.3759，兩者間相關(guān)性不顯著（P>0.05），表明菌株FJAT-3531粗脂肽中發(fā)揮抑菌作用的活性成分可能為伊枯草菌素和豐原素。

3 結(jié)論與討論

脂肽是由非核糖體途徑合成，不同菌株所產(chǎn)脂肽組分不一樣，但同一菌株在不同的培養(yǎng)條件下所產(chǎn)脂肽組分和含量也會(huì)有所不同。李興玉等[7]報(bào)道枯草芽胞桿菌XF1菌株在5種不同的培養(yǎng)基發(fā)酵液中所含環(huán)脂肽類化合物色譜圖基本一致，但脂肽產(chǎn)量最高者為最低者的2.94倍。張曉云等[8]分析了不同碳、氮源對(duì)枯草芽胞桿菌BAB-1菌株脂肽產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明，熊果苷是BAB-1菌株產(chǎn)生表面活性素的最佳碳源，其含量是L阿拉伯糖的5.60倍;熊果苷與葡萄糖利于該菌株產(chǎn)生豐原素，顯著高于D木糖、D核糖及L阿拉伯糖。本研究結(jié)果顯示，貝萊斯芽胞桿菌FJAT-45028在12種培養(yǎng)基中所產(chǎn)的脂肽組分均含有伊枯草菌素、豐原素、表面活性素，但各組分的含量均不同，且差異顯著。

金屬離子對(duì)抑菌脂肽的產(chǎn)生有一定影響，鐵、鎂、錳離子能促進(jìn)抑菌脂肽的產(chǎn)生。劉宇帥等[9]研究表明，較高濃度的葡萄糖和無機(jī)鹽及較低濃度的Mg2+能夠顯著提高解淀粉芽胞桿菌TF28抑菌脂肽的產(chǎn)量;黃翔峰等[10]研究發(fā)現(xiàn)，添加Fe2+能大幅提高脂肽產(chǎn)量。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)JAT-45028菌株在加入Mg2+和Fe2+的F和K培養(yǎng)基產(chǎn)生的脂肽含量顯著高于未添加Mg2+和Fe2+的A和B培養(yǎng)基，其中F發(fā)酵液中脂肽含量為B培養(yǎng)基的23.8倍，說明Mg2+和Fe2+也能促進(jìn)FJAT-45028菌株的脂肽的合成。

研究表明，豐原素和伊枯草菌素具有與化學(xué)農(nóng)藥相當(dāng)?shù)纳锘钚裕茱@著抑制植物病原真菌的生長(zhǎng)。付瑞敏等[3]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽胞桿菌BA168產(chǎn)生的豐原素是抑制蘋果采后病害擴(kuò)展青霉病原菌的脂肽成分;Calvo等[11]研究表明，解淀粉芽胞桿菌BUZ14脂肽伊枯草菌素A是防控桃子褐腐病和蘋果藍(lán)腐病的主要抑菌成分;蔣夢(mèng)曦等[12]用脂肽伊枯草菌素A處理櫻桃番茄后，腐爛率可降低55%;朱弘元等[13]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽胞桿菌B15生產(chǎn)的伊枯草菌素A、豐原素對(duì)葡萄灰霉病菌有較好的抑菌效果。本研究結(jié)果顯示，菌株FJAT-45028粗脂肽對(duì)龍眼致腐菌小新殼梭孢菌的抑制活性與伊枯草菌素和豐原素呈極顯著正相關(guān)，表明粗脂肽發(fā)揮抑菌作用的活性組分可能為伊枯草菌素和豐原素，該結(jié)果與前人報(bào)道相吻合。綜合考慮脂肽產(chǎn)量和抑菌活性，貝萊斯芽胞桿菌FJAT-45028產(chǎn)脂肽的最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖20 g·L-1、酵母浸膏20 g·L-1、牛肉浸膏15 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.6 g·L-1、FeSO4·7H2O 9.0 mg·L-1。本研究結(jié)果為脂肽在龍眼采后病害防控的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃現(xiàn)青，別小妹，呂鳳霞，等.枯草芽胞桿菌fmbJ產(chǎn)脂肽抑制點(diǎn)青霉效果及其桃防腐試驗(yàn)[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008（1）：263-267.

[2]王雨，譚崢，韋丹丹，等.貝萊斯芽胞桿菌HN2的鑒定.及對(duì)杧果炭疽菌的抑菌活性研究[J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2020，36（2）：220-230.

[3]付瑞敏，?；燮?，邢文會(huì)，等.解淀粉芽胞桿菌所產(chǎn)脂肽豐原素是防治蘋果采后青霉病的關(guān)鍵物質(zhì)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（3）：80-85.

[4]沈玉江，雷亞峰，劉健，等.產(chǎn)表面活性素枯草芽胞桿菌YHI的培養(yǎng)基優(yōu)化研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，32（5）：69-76，128.

[5]喬俊卿，劉郵洲，張榮勝，等.枯草芽胞桿菌T500產(chǎn)脂肽類抗生素的搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，41（3）：447-455.

[6]CHEN M C，WANG J P，ZHU Y J，et al.Antibacterial activity against Ralstonia solanacearum of the lipopeptides secreted from the Bacillus amyloliquefaciens strain FJAT-2349[J].Journal of Applied Microbiology，2019，126（5）：1519-1529.

[7]李興玉，毛自朝，吳毅歆，等.不同培養(yǎng)基對(duì)Bacillus subtilis XF1產(chǎn)脂肽抗生素的影響[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，35（6）：49-53.

[8]張曉云，郭慶港，王培培，等.不同碳氮源對(duì)枯草芽胞桿菌BAB1產(chǎn)抗菌脂肽的影響[J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2021，37（2）：251-258.

[9]劉宇帥，孟利強(qiáng)，陳靜宇，等.解淀粉芽胞桿菌TF28產(chǎn)抗菌脂肽培養(yǎng)基優(yōu)化[J].微生物學(xué)雜志，2017，37（3）：52-58.

[10]黃翔峰，詹鵬舉，彭開銘，等.培養(yǎng)基中鐵離子對(duì)枯草芽胞桿菌CICC 23659發(fā)酵產(chǎn)脂肽的影響研究[J].中國(guó)生物工程雜志，2013，33（6）：52-61.

[11]CALVO H，MENDIARA I，ARIAS E，et al.The role of iturin A from B.amyloliquefaciens BUZ14 in the inhibition of the most common postharvest fruit rots[J].Food Microbiol，2019，82：62-69.

[12]蔣夢(mèng)曦，林福興，別小妹，等.Iturin A與肉桂精油復(fù)配提升櫻桃番茄貯藏品質(zhì)[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2019，45（19）：206-212.

[13]朱弘元，康健，范昕，等.解淀粉芽胞桿菌B15產(chǎn)脂肽的分離鑒定及抑菌機(jī)理[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（5）：186-189.

（責(zé)任編輯：柯文輝）

收稿日期：2021-10-12

作者簡(jiǎn)介：陳燕萍，女，1985年生，碩士，助理研究員，主要從事生物防治研究。

通信作者：王階平，男，1972年生，博士，研究員，主要從事微生物生物技術(shù)與農(nóng)業(yè)生物藥物（E-mail：781063449@qq.com）。

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目——省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)（2019R1034-5、2019R1034-2）;福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院對(duì)外合作項(xiàng)目（DEC2020-06）。