鹽酸倍他司汀中基因毒性雜質(zhì)甲醛的測定

李沫，張耀文，孫苓苓，徐萬魁（遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測院，國家藥品監(jiān)督管理局化學(xué)藥品質(zhì)量研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110036）

鹽酸倍他司?。╞etahistine hydrochloride）化學(xué)名為N-甲基-2-吡啶乙胺二鹽酸鹽，商品名為美克樂（Microer），是由意大利佛曼蒂（Formenti）制藥集團(tuán)開發(fā)的一種組胺H1受體激動(dòng)劑，是一種常用的血管擴(kuò)張藥，臨床上主要用于治療各種眩暈綜合征、慢性缺血性腦血管疾病、美尼爾氏綜合征和相關(guān)的眩暈癥狀[1-4]。

甲醛是一種有特殊刺激性氣味的無色氣體，易溶于水和乙醇，作為重要的化工原料被廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成、合成藥品、材料、涂料、橡膠等行業(yè)[5-7]。甲醛是鹽酸倍他司汀在合成過程中的殘留溶劑之一?；蚨拘噪s質(zhì)可從基因突變、染色體畸變、DNA 損傷與修復(fù)等多個(gè)方面同DNA 發(fā)生直接或間接的相互作用，從而改變DNA 的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象或引起DNA 的損傷，進(jìn)而影響DNA 的功能或改變其遺傳特性，最終引起突變、癌變、畸變等遺傳毒性[8-11]。甲醛是確定的基因毒性雜質(zhì)，人體長期接觸甲醛會(huì)對呼吸系統(tǒng)、皮膚、肝肺功能和神經(jīng)系統(tǒng)等造成危害。

近年來，隨著基因毒性雜質(zhì)法規(guī)的逐漸完善，美國和歐洲藥品監(jiān)督管理對藥品中含有潛在基因毒性雜質(zhì)的限度要求越來越高，藥物中基因毒性雜質(zhì)如果控制不當(dāng)，可能會(huì)導(dǎo)致臨床安全隱患，同時(shí)會(huì)影響新藥上市，甚至導(dǎo)致已上市藥品的召回事件[9]。開展鹽酸倍他司汀中基因毒性雜質(zhì)質(zhì)量控制的研究是非常必要的，故本研究建立了鹽酸倍他司汀原料中基因毒性雜質(zhì)甲醛的分析方法，以保證鹽酸倍他司汀原料的安全性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

GC-2010Plus 型氣相色譜儀（配有AOC-5000型自動(dòng)進(jìn)樣器和氫火焰離子化檢測器，日本島津公司），ALC-1100.2 型分析天平（瑞士Sartorius 公司），ME204E 型分析天平（美國Mettler 公司）。

1.2 試藥

水中甲醛溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（中國計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)：18001，含量：9.69 mg·mL－1），鹽酸倍他司汀（A 廠原料藥，批號(hào)：202010、202012、202016），純化水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，批號(hào)：20200301）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用氣相色譜法測定，色譜柱：DB-624（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；檢測器：氫火焰離子化檢測器（FID）；進(jìn)樣口溫度：230℃；檢測器溫度：250℃，程序升溫：起始溫度為40 ℃，以20 ℃·min－1的速率升溫至200 ℃，維持1 min；載氣：氮?dú)猓恢魉伲?.0 mL·min－1；進(jìn)樣方式：溶液直接進(jìn)樣，進(jìn)樣量：1 μL，分流比：1∶1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密量取水中甲醛溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用水逐級(jí)稀釋至質(zhì)量濃度為5.5 ng·mL－1，作為對照品儲(chǔ)備液；精密量取對照品儲(chǔ)備液1 mL置20 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.275 ng·mL－1）。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取鹽酸倍他司汀0.1 g 置10 mL 量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL 置50 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL 置20 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別量取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液和空白溶劑（水）進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1，空白溶劑色譜峰不干擾測定。

圖1 空白溶劑（A）、對照溶液（B）和供試品溶液（C）氣相色譜圖Fig 1 GC chromatogram of the blank solution（A），the control solution（B）and the reference solution（C）

2.4 線性關(guān)系考察

取對照品儲(chǔ)備液適量并稀釋成系列質(zhì)量濃度溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，以各成分色譜峰面積（A）為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，甲醛在0.055 ～1.109 ng·mL－1與測定值線性關(guān)系良好，線性方程為A＝1.76×104C＋2.20×103，r＝1.000。

2.5 定量限與檢測限

精密量取“2.4”項(xiàng)下0.055 ng·mL－1的溶液適量，稀釋后進(jìn)樣，以色譜峰的信噪比S/N為3 計(jì)算檢測限，以S/N為10 計(jì)算定量限。結(jié)果表明，甲醛的檢測限為0.018 ng·mL－1，定量限為0.055 ng·mL－1。

2.6 精密度試驗(yàn)

2.6.1 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取鹽酸倍他司汀0.1 g，精密稱定，置10 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL 置50 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL 置20 mL 量瓶中，加甲醛對照品儲(chǔ)備液1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，平行操作6 份，分別進(jìn)樣，結(jié)果6 份供試品溶液中甲醛含量均值為0.269 ng·mL－1，RSD為0.70%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.2 中間精密度試驗(yàn) 照“2.6.1”項(xiàng)下方法配制溶液，在不同時(shí)間由另一名試驗(yàn)人員進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果12 份供試品溶液中甲醛含量均值為0.269 ng·mL－1，RSD為0.60%，表明該方法中間精密度良好。

2.7 回收試驗(yàn)

稱取鹽酸倍他司汀0.1 g（甲醛含量為0），精密稱定，置10 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL 置50 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL 置20 mL 量瓶中，分別精加甲醛對照品儲(chǔ)備液0.8、1.0 和1.2 mL，每個(gè)濃度3 份，用水稀釋至刻度，搖勻，作為回收率樣品溶液。取回收率樣品溶液和“2.2”項(xiàng)下對照品溶液，分別進(jìn)樣，計(jì)算得甲醛低、中、高濃度的平均回收率分別為100.6%、96.9%、97.0%，RSD分別為0.79%、2.1%、1.9%。

2.8 耐用性試驗(yàn)

按“2.2”項(xiàng)下方法制備對照品溶液和供試品溶液，分別考察起始柱溫[（40±5）℃]、柱流速[（3±5）mL·min－1]條件對試驗(yàn)結(jié)果的影響，并考察相同填料、不同色譜柱[TG-624（30 m×0.32 mm，1.8 μm），TG-624（30 m×0.53 mm，3 μm）]對試驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示試驗(yàn)條件的變動(dòng)對保留時(shí)間、分離度、樣品檢出情況影響較小，方法耐用性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.6.1”項(xiàng)下方法配制溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h 進(jìn)樣，考察峰面積的RSD，結(jié)果表明對照品溶液和供試品溶液RSD分別為0.48%和0.64%，溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 樣品測定

按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果樣品中均未檢出甲醛。

3 討論

3.1 溶劑的選擇

待測物甲醛和樣品鹽酸倍他司汀在水中均有良好的溶解性，尤其是甲醛，考慮到其標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是水溶液，故選擇水作為溶劑。

3.2 檢測方法的選擇

目前檢測藥品中微量的甲醛，主要的測定方法有分光光度法、熒光光度法、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）和高效液相/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC/GC-MS）等[12]。前3種方法，樣品都需要衍生化后再進(jìn)行測定，試驗(yàn)操作繁瑣，檢驗(yàn)靈敏度低。HPLC/GC-MS 法具有靈敏度高、分辨率高、檢測限低等優(yōu)點(diǎn)，但是儀器成本較為昂貴，應(yīng)用不夠廣泛。本研究選擇氣相色譜直接進(jìn)樣法，操作簡單快捷，避免了樣品預(yù)處理的繁瑣步驟和試劑消耗量大的缺點(diǎn)，同時(shí)滿足了檢測靈敏度的需求，為甲醛的檢測提供了切實(shí)可行的試驗(yàn)方法。

3.3 色譜條件的選擇

本試驗(yàn)選用DB-624 毛細(xì)管色譜柱（固定液為6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷），此色譜柱對弱極性有機(jī)溶劑有較好的適用性。為了使樣品不干擾測定，本試驗(yàn)采用程序升溫的方法，并對升溫條件進(jìn)行了優(yōu)化，使待測物有比較合適的保留時(shí)間的同時(shí)，樣品中的成分不干擾待測物的分離。

3.4 甲醛限度確定的依據(jù)

根據(jù)毒理數(shù)據(jù)查詢CPBD（致癌效力數(shù)據(jù)庫）可知，甲醛的最小毒理學(xué)數(shù)據(jù)TD50＝1.35 mg/（kg·d），ADI ＝TD50/5000×50 kg ＝1.35 μg·d－1，鹽酸倍他司汀最大日劑量Dose 為50 mg·d－1，最終甲醛的限度為ADI/Dose ＝2.7×10－5g·g－1。