HPLC—雙波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定苗藥了哥王乙醇提取物中傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的含量

馮果 李瑋 何新 吳增光 鄭傳奇

中圖分類(lèi)號(hào) R917；R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）17-2369-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.15

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定苗藥了哥王乙醇提取物中傘形花內(nèi)酯和西瑞香素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Diamonsil C18，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為0～15 min，324 nm，>15～45 min，346 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 ?L。結(jié)果：傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.33～6.60 μg（r=0.999 7）、0.21～4.20 μg（r=0.999 2）；檢測(cè)限分別為6.60、4.20 ng，定量限分別為18.90、12.60 ng；精密度、穩(wěn)定性（48 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD<2%（n=6或n=7）；平均加樣回收率分別為98.27%、99.98%，RSD分別為1.96%、1.84%（n=9）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性和重復(fù)性好，適用于苗藥了哥王中傘形花內(nèi)酯和西瑞香素含量的同時(shí)測(cè)定。

關(guān)鍵詞 了哥王；苗藥；高效液相色譜法；傘形花內(nèi)酯；西瑞香素；含量測(cè)定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for content determination of umbelliferone and daphnoretin in ethanol extract of Miao medicine Wikstroemia indica simultaneously. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Diamonsil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution （gradient elution） at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 324 nm during 0-15 min and 346 nm during >15-45 min. The column temperature was 30 ℃， and injection volume was 20 μL. RESULTS： The linear range was 0.33-6.60 μg for umbelliferone （r=0.999 7） and 0.21-4.20 μg for daphnoretin （r=0.999 2）. The detection limits were 6.60 and 4.20 ng， and the limits of quantification were 18.90 and 12.60 ng， respectively； RSDs of precision， stability （48 h） and reproducibility tests were lower than 2% （n=6 or n=7）. The average recoveries were 98.27% （RSD=1.96%， n=9） and 99.98% （RSD=1.84%，n=9）， respectively. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate， stable and reproducible. It is suitable for content determination of umbelliferone and daphnoretin in Miao medicine W. indica simultaneously.

KEYWORDS Wikstroemia indica； Miao medicine； HPLC； Umbelliferone； Daphnoretin； Content determination

了哥王[Wikstroemia indica（L.）C. A.Mey.]為瑞香科蕘花屬植物[1]，為南方常用苗藥，其性寒、味苦、辛、微溫，有大毒，歸肺、肝經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、止痛等功效。目前，從了哥王中分離得到的80多種化合物可分為香豆素類(lèi)、木脂素類(lèi)、黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)、甾族類(lèi)、皂苷類(lèi)、萜類(lèi)、酰胺類(lèi)、多糖類(lèi)和揮發(fā)油等10大類(lèi)[2-14]。此外，了哥王中還含有大量的酯類(lèi)、酮類(lèi)、烯類(lèi)、醇類(lèi)等化合物。了哥王具有抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗腫瘤、抗瘧、利尿、引產(chǎn)、鎮(zhèn)咳祛痰、降低心肌耗氧量等藥理作用[15-20]，臨床廣泛用于呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、皮膚等急性扁桃體炎、慢性支氣管炎、急慢性感染性炎癥、頸淋巴結(jié)腫大、乳腺炎、肝炎、肝硬化、肝腹水、肢體疼痛、帶狀皰疹、皮下剝離傷、坐骨神經(jīng)痛和多種癌癥如乳腺癌、惡性淋巴癌、肺癌及各種體表癌等[21]。傘形花內(nèi)酯和西瑞香素為苗藥了哥王香豆素類(lèi)主要有效成分。本研究采用高效液相色譜（HPLC）-雙波長(zhǎng)法建立了同時(shí)測(cè)定苗藥了哥王乙醇提取物中傘形花內(nèi)酯和西瑞香素含量的方法，以期為苗藥了哥王中傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的含量測(cè)定及完善了哥王藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 HPLC儀，包括 G1311B四元泵、內(nèi)置真空脫氣機(jī)、G1329B標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器、G1315D二極管陣列檢測(cè)器、G1316A 柱溫箱、ChemStation 色譜工作站（美國(guó) Agilent 公司）；XL-10B粉碎機(jī)（浙江大鵬機(jī)械有限公司）；LT1002E電子天平（常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司）；SLG-1000滲漉提取罐（北京儀器廠）；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FA2004電子分析天平（上海衡平儀器儀表廠）； HH-S4恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；DZF-6020真空干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；KQ-3200DA數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

了哥王藥材采購(gòu)于廣西各中藥材市場(chǎng)，共10批，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李瑋教授鑒定為瑞香科蕘花屬植物了哥王[Wikstroemia indica（L.）C. A.Mey.]，使用時(shí)取藥材粉碎成粗粉（過(guò)1號(hào)篩），備用；了哥王藥材來(lái)源詳見(jiàn)表1。傘形花內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：BW5534，純度：>98%）購(gòu)自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；西瑞香素對(duì)照品（批號(hào)：111758，純度：>98%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） ；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；波長(zhǎng)：0～15 min，324 nm，>15～45 min，346 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 ?L；流動(dòng)相：乙腈（A相）-0.2%磷酸溶液（B相），梯度洗脫（0～5 min，22%～25%A；5～15 min，25%～25%A；15～20 min，25%～30%A；20～25 min，30%～33%A；25～30 min，33～30%A；30～35 min，30%～28%A；35～40 min，28%～25%A；40～45 min，25%～22%A）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱(chēng)取傘形花內(nèi)酯、西瑞香素對(duì)照品33.00、21.00 mg，分別置于 50 mL的量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.66、0.420 mg/mL的對(duì)照品貯備液，4 ℃保存，備用。

分別精密吸取傘形花內(nèi)酯、西瑞香素對(duì)照品貯備液 25.0 mL，置于同一 50 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.330、0.210 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，4 ℃保存，備用。

2.2.2 供試品溶液 精密稱(chēng)取了哥王乙醇滲漉法提取物粉末（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“乙醇提取物”）[22]約0.5 g，精密稱(chēng)定，置于具塞三角燒瓶中，加80%甲醇30 mL超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz ）提取30 min，過(guò)濾，揮干濾液，殘?jiān)眉状既芙?，溶液轉(zhuǎn)移至10 mL的量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 空白溶液 取流動(dòng)相作為空白溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果，在該色譜條件下，傘形花內(nèi)酯和西瑞香素之間及與其他成分達(dá)到較好的分離，分離度大于1.5。供試品溶液和混合對(duì)照品溶液的傘形花內(nèi)酯、西瑞香素分別在9.0、35.5 min左右出現(xiàn)，理論板數(shù)以傘形花內(nèi)酯計(jì)不低于3 000，詳見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、10.0 mL分別至10 mL的量瓶中，甲醇定容，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，收集續(xù)濾液，即得。分別吸取20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得傘形花內(nèi)酯、西瑞香素回歸方程分別為y=57.086x+37.736（r=0.999 7）、y=41.162x+2.962 8（r=0.999 2）。結(jié)果表明，傘形花內(nèi)酯、西瑞香素進(jìn)樣量分別在0.33～6.60 μg、0.21～4.20 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 檢測(cè)限與定量限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測(cè)限；當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限。結(jié)果，傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的檢測(cè)限分別為6.60、4.20 ng，定量限分別為18.90、12.60 ng。

2.6 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液（傘形花內(nèi)酯、西瑞香素對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為0.330、0.210 mg/mL） 適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，傘形花內(nèi)酯和西瑞香素峰面積的RSD分別為1.73%、1.51%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取了哥王乙醇提取物粉末（批號(hào)：20160304）供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24、48 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，傘形花內(nèi)酯、西瑞香素峰面積的RSD分別為1.30%、0.74%（n=7），表明供試品溶液室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取了哥王乙醇提取物粉末（批號(hào)：20160304）0.5 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共 6 份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，傘形花內(nèi)酯、西瑞香素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.751、43.62 mg/g（n=6），RSD分別為1.25%、0.73% （n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的了哥王乙醇提取物粉末（批號(hào)：20160304，含傘形花內(nèi)酯、西瑞香素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.751、43.62 mg/g）約0.10 g，共9份，分別加入相當(dāng)于了哥王乙醇提取物原有含量的 80%、100%和 120% 對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見(jiàn)表2。

2.10 樣品含量測(cè)定

取10批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果詳見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 提取條件的選擇

筆者在前期試驗(yàn)中考察了回流提取法和超聲提取法對(duì)樣品中傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的提取量的影響。結(jié)果表明，回流提取法傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的提取量分別為0.750 2、43.587 5 mg/g，超聲提取法傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的提取量分別為0.751 0、43.620 0 mg/g，兩者間沒(méi)有顯著差異，且超聲提取法簡(jiǎn)單、方便，故確定超聲提取法為樣品提取方法。在前期試驗(yàn)中，筆者還對(duì)水、乙醇、甲醇和80%的甲醇等不同溶劑進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，采用80%甲醇為溶劑效果更好。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)對(duì)傘形花內(nèi)酯和西瑞香素進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果表明傘形花內(nèi)酯和西瑞香素分別在324、346 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。在分析過(guò)程中筆者還發(fā)現(xiàn)，傘形花內(nèi)酯的出峰時(shí)間要早于西瑞香素。為了既能同時(shí)檢測(cè)這2個(gè)香豆素類(lèi)成分，又不影響這2個(gè)成分的吸收強(qiáng)度，筆者選擇在不同時(shí)間段內(nèi)切換檢測(cè)波長(zhǎng)以同時(shí)檢測(cè)這2個(gè)成分，即在0～15 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為324 nm；15～45 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為346 nm。

3.3 檢測(cè)方法的選擇

在研究過(guò)程中，筆者對(duì)檢測(cè)方法的流動(dòng)相也進(jìn)行了優(yōu)選，包括對(duì)不同比例的甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸等流動(dòng)相進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，當(dāng)選用乙腈-0.2%磷酸為流動(dòng)相時(shí)，峰和分離度較好。在該流動(dòng)相條件下筆者還進(jìn)行了等度和不同梯度洗脫試驗(yàn)，考察了流速為0.8、1.0 mL/min時(shí)對(duì)傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的出峰時(shí)間和分離效果的影響。結(jié)果表明，選擇梯度洗脫、流速為1.0 mL/min時(shí)，傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的出峰時(shí)間和分離效果較好。

綜上所述，HPLC-雙波長(zhǎng)法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性和重復(fù)性好，適用于苗藥了哥王中傘形花內(nèi)酯和西瑞香素含量的同時(shí)測(cè)定。

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（收稿日期：2018-04-07 修回日期：2018-07-11）

（編輯：余慶華）