傳統(tǒng)酵素源高效降膽固醇菌株的篩選、鑒定及膽鹽水解酶活性分析

瑪麗娜·庫爾曼，包怡紅，2*

（1 黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室 哈爾濱150040 2 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 哈爾濱150040）

酵素是指動物、植物、菌類以微生物發(fā)酵制得的具有特定活性成分的產(chǎn)品。酵素的發(fā)酵方式分為人工接種發(fā)酵和自然接種發(fā)酵，與人工發(fā)酵相比，采用自然選擇適應(yīng)性強的優(yōu)勢菌株發(fā)酵，具有更豐富的微生物多樣性，發(fā)酵過程中的微生物對酵素風(fēng)味、顏色和營養(yǎng)特性起著關(guān)鍵作用[1]。酵素是具有多種功效的營養(yǎng)體，含有多種酶、維生素、礦物質(zhì)等，具有抗氧化[2]，抗菌消炎[3]，美白養(yǎng)顏[4]，提高免疫力[5]等功效。近些年，微生物酵素發(fā)展較快，對酵素中益生菌分離純化的相關(guān)研究較多，其中主要益生菌為酵母菌和乳酸菌屬。益生菌是當(dāng)機體攝入一定量時能夠平衡腸道菌群，并對宿主起到健康功效的活體微生物[6]。益生菌在降脂，增強免疫[7]，改善酒精性脂肪肝[8]，抑制腸病[9]，抗過敏[10]，抗腫瘤[11]，治療炎癥[12]以及強化營養(yǎng)方面均有一定效果。Teoh 等[13]從紅茶菌酵素中分離得到具有較好耐酸和耐高糖的接合酵母；Kim 等[14]將干酪乳桿菌接種于土豆泥中發(fā)酵，得到具有抗氧化功能的酵素飲品。

高濃度的血清膽固醇是引起動脈粥樣硬化、冠心病等心腦血管疾病的主要原因[15]。在膳食中膽固醇的推薦攝入量為250～300 mg/d[16]，過量攝入膽固醇將會危害身體健康。近年來，益生菌降血清膽固醇的作用已引起研究者的關(guān)注。眾多研究者以體內(nèi)和體外試驗證實了一些益生菌有降低膽固醇的作用，如王霄鵬[17]測定了10 株益生菌的降解膽固醇和甘油三酯能力，發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌的降膽固醇能力最強，降解率達(dá)48.13%；Kim 等[18]研究發(fā)現(xiàn)短乳桿菌OK56 能降低高脂肪誘導(dǎo)的肥胖小鼠體重及附睪脂肪質(zhì)量，抑制LPS 刺激的巨噬細(xì)胞TNF-α，IL-1β 和IL-6 的表達(dá)，降低血漿及結(jié)腸液中LPS 的水平，起到降脂的作用。菌株降低膽固醇主要為以下3 個機制：1） 在一定條件下，膽固醇與非結(jié)合型膽酸鹽的共沉淀作用，如Klaver等[19]提出共沉淀理論，在酸性條件下，發(fā)生共沉淀作用；2） 菌株細(xì)胞的同化吸收作用，如Gilliland等[20]證實嗜酸乳桿菌的同化作用；3）菌株產(chǎn)生膽鹽水解酶（BSH），使結(jié)合型膽酸鹽轉(zhuǎn)化成游離型膽酸鹽，從而與膽固醇結(jié)合，排出體外，如Taranto等[21-22]證實BSH 降膽固醇的機理。

本研究從民間自制的傳統(tǒng)酵素中篩選具有降膽固醇功能的菌株，通過測定菌株的體外降膽固醇能力、膽鹽耐受性、耐酸性、疏水性、自凝聚力及膽鹽水解酶活性，分析比較篩選菌株的降脂作用，并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，為進(jìn)一步研究利用微生物影響脂代謝提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)民間酵素，由具有多年制作經(jīng)驗并長期飲用的哈爾濱市某家庭提供，服用此酵素具有明顯降脂、減肥的作用。

鄰苯二甲醛，上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)五聯(lián)化工廠；膽固醇，上海藍(lán)季生物；?；悄懰徕c、巰基乙酸鈉、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白、二硫蘇糖醇、牛磺酸，上海源葉生物；二甲苯，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑場；茚三酮，天津市鑫鉑特化工有限公司。

MRS 培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20.0、蛋白胨10.0、牛肉膏10.0、酵母浸粉5.0、無水乙酸鈉5.0、檸檬酸二鈉2.0、K2HPO42.0、MgSO40.58、MnSO40.17、瓊脂15.0，吐溫-80 1.0 mL，pH 6.5，121 ℃滅菌20 min。MRS-CHOL 培養(yǎng)基、M17-CHOL 培養(yǎng)基、PDA-CHOL 培養(yǎng)基：分別在MRS 液體培養(yǎng)基、M17 肉湯培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基中添加3 mg/mL 膽鹽和1 mg/mL 膽固醇。BSH 篩選培養(yǎng)基：在MRS瓊脂平板的基礎(chǔ)上，添加3 g/L ?；悄懰徕c，2 g/L巰基乙酸鈉和0.37 g/L CaCl2。

1.2 儀器與設(shè)備

滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；722 型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；生物顯微鏡，麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司；pH 計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；XK96-A 快速混合機，江蘇新康醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 膽固醇含量的測定 參考馮雁波等[23]的方法，以膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A550nm）為縱坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0067x+0.001（R2=0.9991）。

廣東省是學(xué)生溺水事故的高發(fā)省份，在自然水域或在游泳池中因不當(dāng)游泳、搭救同伴、不小心跌滑發(fā)生的悲劇并不鮮見。究其原因，一是學(xué)生缺乏自我生命安全保護(hù)意識；二是家長安全監(jiān)護(hù)不利；三是在校內(nèi)沒有系統(tǒng)地學(xué)習(xí)水中自救與水上救助的知識與技能。長期以來，華南師范大學(xué)附屬中學(xué)注重學(xué)生游泳及水上安全意識和技能的培養(yǎng)，并開發(fā)一系列校本游泳課程培養(yǎng)學(xué)生的游泳自救與水上救助能力，取得了豐碩的經(jīng)驗成果。

1.3.2 降膽固醇菌株初篩 從原料中接菌進(jìn)行平板培養(yǎng)得單菌落，分別挑選單菌落于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，將活化的菌株接種至含1 mg/mL 膽固醇 的MRS-CHOL、M17-CHOL、PDA-CHOL 培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h 后滅菌處理，5 000 r/min離心15 min，取上清液用鄰苯二甲醛比色法[24]測定A550nm。按照式（1）計算膽固醇去除率。

式中，B——對照組在波長550 nm 處的OD值；A——試驗組在波長550 nm 處的OD 值。

1.3.3 降膽固醇菌株復(fù)篩

1.3.3.1 菌株膽鹽耐受性測定 將活化后的菌株，按3%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種于含有2 g/L 膽鹽的MRS、M17、PDA 液體培養(yǎng)基中，不加膽鹽的MRS、M17 和PDA 液體培養(yǎng)基為對照組。37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h，測各組菌液的OD600nm值。按照式（2）計算菌株的耐膽鹽存活率。

1.3.3.2 菌株耐酸性測定 將MRS、M17、PDA 液體培養(yǎng)基的pH 值分別調(diào)至3.0，6.0，其中pH 6.0的液體培養(yǎng)基為對照組。將2 次活化后的菌種按3%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種于上述培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16 h 后取樣，測定OD600nm值[25]。按照式（3）計算菌株的耐酸率。

1.3.3.3 菌株疏水性的測定 采用細(xì)菌黏著物質(zhì)法（BATS）測定菌株的疏水性[26]。按5%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，5 000 r/min 離心15 min，收集菌體，用無菌的PBS緩沖液（pH 6.8）洗滌2 次，將沉淀用緩沖液懸浮。緩沖液作為空白對照，用緩沖液調(diào)整菌體濃度，使其初始濃度在波長600 nm 下吸光值約為1，取4 mL 調(diào)整濃度后的菌液，加入0.8 mL 二甲苯（或氯仿），高速渦旋2 min，靜置10 min 分層，取下層水相（或上層水相）在波長600 nm 處測其吸光度A。按照式（4）計算菌株細(xì)胞表面的疏水率。

式中，A0——與二甲苯（或氯仿）混合前菌液在波長600 nm 下測量得到的吸光值；A——與二甲苯（或氯仿）混合后，菌液在波長600 nm 下測量得到的吸光值。

1.3.3.4 菌株自凝聚力測定 按5%接種量接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，5 000 r/min 離心15 min，收集菌體，用無菌的PBS 緩沖液（pH 6.8）洗滌2 次，將沉淀用緩沖液懸浮。緩沖液作為空白對照，用緩沖液調(diào)整菌體濃度，使其初始濃度在波長600 nm 下吸光值約為1。菌液在試管中靜置1，24，48 h，取1 mL 上層菌液測定光密度值，每個菌株每個時間點做3 個平行[27]。按照式（5）計算菌株的自凝聚力百分比。

式中，A0——于600 nm 波長處測得的光密度值；At——靜置不同時間測得的光密度值。

1.3.3.5 菌株膽鹽水解酶定性測定 在液體培養(yǎng)基中添加3 g/L ?；悄懰徕c、2 g/L 巰基乙酸鈉、0.37 g/L CaCl2和15 g/L 瓊脂，121 ℃滅菌15 min，傾倒入無菌平板中，待凝固后把無菌濾紙片均勻放入平板中，在每個濾紙片上滴加10 μL 菌液（108～109CFU/mL），于37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h。若濾紙片周圍有白色沉淀物，則認(rèn)為具有膽鹽水解酶活性[28]。

1.3.4 菌株膽鹽水解酶定量分析

1.3.4.1 粗酶解液的制備 按5%接種量接種于相應(yīng)培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，5 000 r/min 離心15 min，收集上清液與菌體沉淀。上清液用超濾膜（30 ku）過濾濃縮，保存?zhèn)溆?。菌體用0.1 mol/L 磷酸緩沖溶液（pH 7.0）洗滌2 次，調(diào)整菌體濃度使其在波長600 nm 下的吸光度約為1.0。加入10 mmol/L 二硫蘇糖醇以減少BSH 的氧化，取1 mL上述細(xì)胞懸濁液，冰浴超聲破碎4 min，離心去除細(xì)胞碎片，得到無細(xì)胞提取液[29]。

1.3.4.2 酶活力測定 在10 μL 上述粗酶解液中加入180 μL 0.1 mol/L 磷酸緩沖溶液（pH 6.0），10 μL 200 mmol/L 結(jié)合膽鹽（TDCA） 和10 μL 0.1 mol/L 的石蠟油，混合后置于37 ℃培養(yǎng)30 min（以反應(yīng)后加入結(jié)合膽鹽的樣品為對照）。立即在上述反應(yīng)液中加入等體積的0.15 mg/mL 三氯乙酸終止反應(yīng)，混合均勻，離心15 min，取上清液。將0.1 mL 上清液（樣品或?qū)φ眨┡c1.9 mL 茚三酮顯色液混合，振蕩混勻，沸水浴14 min，用自來水冷卻3 min 后測定波長570 nm 下的吸光度。以?；撬釢舛龋é蘭ol/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值（A570nm）為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=1.9791x-0.0066（R2=0.9995）。酶活力定義：單位時間、單位體積的粗酶，結(jié)合膽鹽水解產(chǎn)生氨基酸的物質(zhì)的量，單位：μmol/（min·mL）。

1.3.4.3 蛋白質(zhì)含量測定 參考考馬斯亮藍(lán)G-250 法[30-31]測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Origin 9 和SPSS 20.0 分析軟件進(jìn)行處理，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±s）表示，顯著性水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 降膽固醇菌株的初篩

從傳統(tǒng)民間酵素中分離出51 株菌分別編號為S-1～S-12（MRS 培養(yǎng)基）、M-1～M-19（M17 培養(yǎng)基）和P-1～P-20（PDA 培養(yǎng)基）。如表1所示，菌株降膽固醇能力在8.03%～47.41%，只有S-5 菌的降膽固醇能力低于10%，多數(shù)菌的降膽固醇能力在20%以上，M-16 菌的膽固醇去除率為47.41%，對應(yīng)的膽固醇降低量為474.1 μg/mL。黃燕燕等[28]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳酸菌DMDL 9010 的膽固醇降解率為37.58%；嚴(yán)玉婷等[32]研究表明，從新疆酸馬奶中分離出的菌株降膽固醇能力在15.12%～66.82%，初篩出23 株降膽固醇能力較高的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 降膽固醇菌株的復(fù)篩

2.2.1 菌株的耐受性 膽鹽耐受性和耐酸性是益生菌的重要特征，菌株發(fā)揮益生作用，需要經(jīng)過胃酸屏障以及耐受腸道中的膽鹽。由表2可知，初篩出的23 株菌對膽鹽和酸呈現(xiàn)出不同的耐受性，在pH 值為3 的環(huán)境下，23 株菌都能夠生長，Wang等[33]從發(fā)酵芥末中篩選出的3 株菌均能在低酸環(huán)境下存活。M-7、S-8、M-2、M-16 的膽鹽耐受性較高，分別為65.64%，42.09%，23.96%和22.80%；M-7、M-16、S-8、M-19 的耐酸性比較高，分別為86.94%，72.68%，71.53%和70.32%；P-12 和P-14 的耐受性較高。因此，篩選出M-7、M-16、S-8、P-12 和P-14 共5 株菌進(jìn)一步研究。

2.2.2 菌株的疏水性 疏水性與菌株的黏附性具有高度相關(guān)性，益生菌對腸上皮細(xì)胞的黏附能力涉及各種類型的相互作用，包括疏水性和自凝聚力[34]。Wadstroum 等[35]證實了疏水性高的乳酸菌對腸上皮細(xì)胞具有強的黏附性。本研究以二甲苯和氯仿為吸附劑，研究了菌株的疏水性，由圖1可知，P-12 和P-14 疏水性差異較小；S-8 在二甲苯中呈較高的疏水性，達(dá)35.91%，超過了陳明等[36]篩選的XS40 菌株的疏水性（31.92%）；M-7 在氯仿中疏水能力強，疏水率為45.22%，S-8 和M-7 菌間存在顯著差異，且疏水性比其它3 株菌高。

表1 降膽固醇菌株的初篩Table 1 Primary screening of cholesterol-lowering strains

表2 菌株的膽鹽耐受性和耐酸性Table 2 Bile tolerance and acid resistance of strains

2.2.3 菌株的自凝聚力測定 由圖2可知，隨時間的延長，菌株的自凝聚力提高，在24 h 后，S-8、M-7、P-12 菌懸液上層呈現(xiàn)澄清狀態(tài)，自凝聚力在80%以上。S-8 菌的自凝聚力達(dá)88.42%。菌株的疏水性決定自凝聚力，同時與黏附性相關(guān)[37]。對腸道的黏附性強弱依次為：M-7＞S-8＞M-16＞P-12＞P-14，篩選出的菌株均具有良好的疏水性與自凝聚性，在腸道中具有較高的穩(wěn)定性，能夠很好的定殖于腸道。

圖1 菌株的疏水性Fig.1 Hydrophobicity property of strains

圖2 菌株的自凝聚力Fig.2 Self-agglomeration ability of strains at different standing time

2.2.4 菌株的膽鹽水解酶定性分析 膽鹽水解酶（BSH）是一種胞內(nèi)酶，能夠?qū)⒔Y(jié)合型膽鹽轉(zhuǎn)變成游離型膽鹽，游離膽鹽會與膽固醇結(jié)合形成復(fù)合體，排出體外[38]。在酸性條件下，游離型膽鹽與Ca2+結(jié)合，形成白色沉淀。因此，BSH 能夠作為篩選降膽固醇菌株的一個重要指標(biāo)。由圖3可知，篩選出的5 株菌中S-8、M-7 和M-16 產(chǎn)生明顯的沉淀，說明這3 株菌具有BSH 活性，其它2 株菌沒有表現(xiàn)膽鹽水解酶活性。菌株中膽汁鹽水解酶（BSH）的存在使得它們對膽汁鹽更耐受，這也有助于降低宿主的血液膽固醇水平[39]。

圖3 菌株膽鹽水解酶定性測定Fig.3 Determination of bile salt hydrolytic enzyme activity in solid medium

2.2.5 菌株的膽鹽水解酶定量分析 通過茚三酮法測定膽鹽水解酶活力，由表3可知，S-8、M-7 和M-16 菌株均對?；悄懰徕c體現(xiàn)出膽鹽水解酶活性，M-16 菌的胞內(nèi)酶比活力最高，達(dá)1.2807 U/mg，高于董自星[40]測定的羅伊氏乳桿菌BBE6 菌的酶比活力（0.149 U/mg）。這3 株菌的胞內(nèi)酶活力均高于胞外酶活力，篩選出的菌株胞內(nèi)酶比活力是胞外酶比活力的近7 倍，由此可得出，篩選出的菌株降脂酶可能源于胞內(nèi)酶。胞外蛋白質(zhì)含量高于胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量，而蛋白質(zhì)與降膽固醇作用沒有直接相關(guān)性，由此可知，S-8、M-7 和M-16 菌是具有高效降膽固醇潛能的菌株。

2.3 菌落及菌株形態(tài)學(xué)觀察

如圖4所示，A 圖中菌落呈中等大小，不透明，邊緣光滑整齊，凸起，為乳白色圓形；B 圖中菌落為淡黃色圓形，形態(tài)略比A 圖中的菌落大；C 圖中菌落較大，濕潤，透明，隆起，邊緣光滑，黏稠。在顯微鏡下觀察，D 圖中菌株細(xì)胞為短桿狀，成對或者鏈狀排列，E 細(xì)胞為圓形，單個或成串狀聚集，均無芽孢，無鞭毛，為革蘭氏陽性菌；F 圖中菌呈卵圓形，無鞭毛，不能游動。

表3 胞內(nèi)和胞外粗酶液酶活力比較Table 3 Comparison of enzyme activity between intracellular and extracellular crude enzymes

圖4 篩選菌株的形態(tài)Fig.4 The morphology of the strains

2.4 菌株的16S rDNA 分子生物學(xué)鑒定

提取S-8、M-7 和M-16 菌的基因組DNA 后，用16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴增，各菌株的擴增產(chǎn)物序列長度在1 500 bp 左右，見圖5。

圖5 16S rDNA 片段PCR 擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.5 Agarose gel electrophoresis patterns of PCR amplified-products of 16S rDNA fragments

將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站上做Blast 序列分析，各菌株與參考菌株的同源性在99%以上（表4），用MEGA5 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6），呈現(xiàn)菌株間的親緣關(guān)系。

如表4所示，M-7 和M-16 菌株與人葡萄球菌極相似，同源性達(dá)100%；系統(tǒng)發(fā)育樹中顯示S-8 與副干酪乳桿菌的親緣關(guān)系最近，因此，鑒定S-8 為副干酪乳桿菌，M-7 和M-16 菌為人葡萄球菌。

表4 16S rDNA 序列分析結(jié)Table 4 16S rDNA sequence analysis results

圖6 S-8 菌株16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of S-8 strain based on the 16S rDNA sequence

3 結(jié)論與討論

近些年，酵素成為市場上的熱銷降脂產(chǎn)品，其中益生菌起主要降脂功效，益生菌可產(chǎn)生降低膽固醇的酶類，或本身細(xì)胞結(jié)構(gòu)對膽固醇有吸附作用。Chiu 等[41]研究發(fā)現(xiàn)44 名志愿者食用日本阿馬托酶公司提供的酵素8 周后，志愿者體重和體脂肪等參數(shù)降低，總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇下降更為明顯。自然發(fā)酵的傳統(tǒng)酵素中微生物群體較為復(fù)雜，其中最為主要的是乳酸菌發(fā)酵，眾多研究者從中分離出植物乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌等[42]，也有分離出酵母菌，如Jayabalan 等[43]從自然發(fā)酵的紅茶中分離得到拜氏接合酵母和克勞森酒香酵母。

國內(nèi)外的研究已證實乳酸菌具有高效降膽固醇的功效，并研究了相應(yīng)的降脂機理。黃燕燕等[28]從開菲爾粒和陳年泡菜中分離得到降低膽固醇的乳酸菌，并從基因水平上分析了其可能的機理。本文采用民間自然發(fā)酵的傳統(tǒng)酵素，經(jīng)多年服用具有很好降脂減肥功效的樣品，從中分離出51 株菌，多數(shù)菌株的膽固醇去除率在20%～40%之間，M-16 菌的降脂率達(dá)47.41%，明顯高于劉曉強[44]篩選出的消化乳桿菌的降低膽固醇能力（去除率為31.23%，降低量為62.89 μg/mL）。通過試驗發(fā)現(xiàn)，菌株的膽鹽耐受性差異較大，M-7、S-8 的膽鹽耐受性較高，分別為65.64%，42.09%，與李利等[25]研究的植物乳桿菌SN1 和鼠李糖乳桿菌SN6（0.3%膽鹽）結(jié)果相近。菌株平均耐酸性為66.28%，明顯高于高玉榮等[45]篩選的4 株菌的耐酸性（31.5%～48.8%）。菌株不僅以高活性到達(dá)腸道，也要定殖于腸道，生長繁殖，成為優(yōu)勢菌群，菌株的黏附性與疏水性和自凝聚力等特征密切相關(guān)。M-7 菌在氯仿中的疏水性比較高，與溫賀等[27]研究的結(jié)果相反，可能與不同菌株對有機溶劑的吸附性不同有關(guān)。自凝聚力與疏水性呈正相關(guān)，證實了疏水性決定自凝聚力[38]。在靜置24 h 后，菌液上層為澄清狀態(tài)，說明菌株對腸黏膜細(xì)胞具有較高的黏附性，具有較好的穩(wěn)定性，能夠在復(fù)雜的腸道系統(tǒng)中形成保護(hù)機制[46]。膽鹽共沉淀作用被認(rèn)為是降低膽固醇機制的核心[47]，因此，本文從膽鹽水解酶角度分析降膽固醇作用，發(fā)現(xiàn)分離得到的P-12 和P-14 不產(chǎn)生膽鹽水解酶（BSH），其降脂作用可能與細(xì)胞的吸附作用等機制有關(guān)。S-8、M-7、M-16 菌的胞內(nèi)酶比活力是胞外酶比活力近7 倍，丁苗等[48]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵酸肉中篩選出的消化乳桿菌RS10的胞內(nèi)酶比活力是胞外酶的8.7 倍，因此，可以認(rèn)為菌株降低膽固醇的降脂酶主要源于胞內(nèi)酶。通過16S rDNA 序列分析，S-8 為副干酪乳桿菌，M-7 和M-16 為人葡萄球菌，資料表明人葡萄球菌一般是具有較弱致病力的病原菌，屬于凝固酶陰性葡萄球菌[49]，常定殖于人的皮膚、毛囊中。而本試驗發(fā)現(xiàn)這2 株球菌具有很好的降膽固醇能力以及良好的菌株特性，能夠表現(xiàn)膽鹽水解酶活性，并且提供酵素的制作者個人、家人和周圍人多年服用，表現(xiàn)出較好的降血脂和降體重的功效，對于該菌株的致病力及益生性有待進(jìn)一步研究。提醒廣大消費者，民間傳統(tǒng)自制酵素雖有多種功效，但需謹(jǐn)慎飲用。