高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標法測定動物源性食品中玉米赤霉烯酮及其代謝產(chǎn)物

寧欣，王煉，王希希，李鵬昊

（成都市疾病預防控制中心，成都 610041）

玉米赤霉烯酮(ZEN)是一種由鐮刀菌屬禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌、木賊鐮刀菌和半裸鐮刀菌等幾種田間真菌產(chǎn)生的真菌毒素［1］，廣泛存在于許多重要農(nóng)作物如玉米、小麥、高粱、燕麥中。長期食用感染鐮刀菌屬病原菌的糧食和飼料，會導致玉米赤霉烯酮在動物組織中的殘留。玉米赤霉烯酮可以通過I 相和II 相代謝方式在植物、真菌和動物體內(nèi)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生還原性代謝物α-和β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、α-和β-玉米赤霉醇以及它們的葡萄糖苷、硫酸鹽和葡萄糖醛酸化產(chǎn)物［2］。玉米赤霉醇自1969 年起曾被廣泛用作家畜的生長促進劑，可以促進蛋白質(zhì)的合成，提高胴體瘦肉率及飼料轉(zhuǎn)化率［3］。玉米赤霉烯酮及其代謝產(chǎn)物(簡稱玉米赤霉烯酮類)的危害主要表現(xiàn)為高雌激素作用，因為它們的化學結(jié)構(gòu)類似于天然雌激素、雌二醇、雌二醇和雌三醇，能與哺乳動物體內(nèi)雌激素受體ERa 和ERb 結(jié)合，表現(xiàn)出激素紊亂現(xiàn)象，引起生殖系統(tǒng)功能障礙，甚至是流產(chǎn)、死胎和畸形等［4］。玉米赤霉烯酮類化合物的其它毒性作用還包括肝毒性、血液毒性、免疫毒性、遺傳毒性和致癌性［5-6］。為了保護消費者免受風險，歐盟于1998 年明確禁止將此類藥物用于畜禽養(yǎng)殖，我國農(nóng)業(yè)部第235 號公告明確規(guī)定所有食品動物及可食組織中不得檢出玉米赤霉醇［7］。

有文獻報道，玉米赤霉烯酮及其代謝產(chǎn)物α-和β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮，α-和β-玉米赤霉醇存在于動物樣本中［8-9］，對人類健康造成威脅，這使得建立動物源性食品中此類化合物的檢測方法具有重要意義。目前用于玉米赤霉烯酮類化合物的檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)［10］、薄層色譜法(TLC)［11］、高壓液相色譜法(HPLC)［12］、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)［13］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS／MS)［14-17］等。HPLC-MS／MS 具有專屬性強、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)勢，已成為生物樣品中真菌毒素測定的首選方法。目前，LC-MS／MS 測定動物源性食品中玉米赤霉烯酮類物質(zhì)多采用的是外標法定量，無法消除實驗過程中的偶然誤差以及測定過程中標準品和待測樣品基質(zhì)不同所造成的基質(zhì)效應(yīng)。筆者采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜-同位素內(nèi)標法檢測動物源性食品中玉米赤霉烯酮及其代謝物殘留量，能夠減小前處理過程中帶來的誤差且免于制備基質(zhì)曲線，該方法更加簡便、靈敏和準確。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)：Dionex Ultimate 3000 型高效液相色譜儀，德國Thermo Fisher 公司；QTrap3200 型串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國AB Sciex 公司。

固相萃取儀：GX-274 型，法國Gilson 公司。超純水系統(tǒng)：Milli-Q 型，美國Milli-pore 公司。大容量高速離心機：J-26XP 型，美國Beckman Coulter 公司。

恒溫培養(yǎng)振蕩器：ZWY-100H 型，上海智城分析儀器制造有限公司。

電 子 天 平：PL602E 型，感 量 為0.01g，瑞 士Mettler Toledo 公司。

渦旋混勻器：Vortex Genius 3 型，德國IKA 公司。

氮吹儀：N-EVAP 111 型，美國Organomation 公司。

氮氣：純度為99.99%，成都世茂氣體有限公司。

玉米赤霉烯酮(ZEN)、α-玉米赤霉醇(α-ZAL)、β-玉米赤霉醇(β-ZAL)、α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)、玉米赤霉酮(ZAN)標準溶液：10 μg／mL，美國Romer 公司。

13C18-玉米赤霉烯酮(13C18-ZEN)標準溶液：25 μg／mL，美國Romer 公司。

D7-α-玉米赤霉烯醇(D7-α-ZOL)：98%，加拿大Toronto Research Chemicals 公司。

D7-β-玉米赤霉烯醇(D7-β-ZOL)：97%，加拿大Toronto Research Chemicals 公司。

D5-α-玉米赤霉醇(D5-α-ZAL)：99.6%，德國Witega 公司。β-葡萄糖苷酶／硫酸酯酶：德國Merck 公司。固相萃取柱：Oasis HLB 型，6 mL／500 mg，美國Waters 公司。

甲醇、乙腈、叔丁基甲基醚：色譜純，賽默飛世爾科技中國有限公司。

三水合乙酸鈉、冰醋酸、三氯甲烷、氫氧化鈉、磷酸：分析純。

乙酸鈉-乙酸緩沖液：0.05 mol／L，稱取6.8 克三水合乙酸鈉，溶于900 mL 超純水中，用冰乙酸將其pH 調(diào)至4.8 后，再用超純水定容至1 L。

磷酸-水溶液(體積比為1∶4)：量取10 mL磷酸與40 mL 超純水混合而成。

實驗用水為實驗室自制超純水。

1.2 標準溶液的配制

混合標準應(yīng)用溶液：分別吸取ZEN、α-ZAL、β-ZAL、α-ZOL、β-ZOL、ZAN 6 種玉米赤霉類物質(zhì)標準溶液各50 μL 用乙腈稀釋至1 mL，得到6 種待測物質(zhì)量濃度均為0.5 μg／mL 的混合標準應(yīng)用溶液。

混合內(nèi)標應(yīng)用溶液：以乙腈為溶劑，配制含有D7-α-ZOL，D7-β-ZOL，D5-α-ZAL 和13C18-ZEN 的混合內(nèi)標應(yīng)用溶液，內(nèi)標濃度均為1.0 μg／mL。

系列混合標準工作溶液：分別吸取2，10，20，40，100，200 μL 混合標準應(yīng)用溶液，再分別加入100 μL 混合內(nèi)標應(yīng)用溶液，以水-乙腈(體積比為9∶1)作溶劑，稀釋至1 mL 配制成濃度分別為1.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 μg／L 的系列混合標準工作溶液，各標準溶液點均含有濃度為50.0 ng／mL 的四種同位素標記內(nèi)標物。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品酶解

準確稱取搗碎后的動物性樣品(豬肉、牛肉等)5 g(精確至0.01 g)，置于50 mL 聚丙烯塑料離心管中，加入0.05 mL 濃度為1.0 μg／mL 的混合內(nèi)標溶液和10 mL乙酸鈉-乙酸緩沖液(0.05 mol／L，pH 4.8)，再加入0.025 mLβ-葡萄糖苷酸／硫酸酯復合酶，在渦旋混勻器上渦旋30 s，置于37℃搖床中振蕩酶解16 h。

1.3.2 樣品提取與凈化

酶解后加入15 mL 叔丁基甲基醚，渦旋混勻后振蕩提取5 min，以8 000 r／min 離心2 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一50 mL 塑料離心管中，樣品再重復用15 mL 叔丁基甲基醚提取一次，合并兩次提取液，在35℃水浴中氮吹至近干。在殘渣中加入1.0 mL 三氯甲烷，超聲波輔助溶解2 min，再加入3.0 mL 氫氧化鈉溶液(0.5 mol／L)，漩渦提取1 min，以8 000 r／min 離心2 min，將上層氫氧化鈉萃取液吸取至10 mL 離心管中，再重復上述步驟用3.0 mL 氫氧化鈉溶液(0.5 mol／L)重復萃取一次，合并兩次氫氧化鈉層萃取液，在萃取液中加入1.0 mL 磷酸-水溶液(1∶4)，將pH 調(diào)至弱酸性，混勻后轉(zhuǎn)入固相萃取上樣管待凈化。將樣品提取液通過用5 mL 甲醇和5 mL 水活化平衡好的HLB 固相萃取柱(6 mL／500 mg)，待溶液全部通過小柱后，用5 mL 水和5 mL 50%甲醇水溶液淋洗除去雜質(zhì)，減壓抽干小柱中的水分后，用10 mL 甲醇洗脫，洗脫液在40 ℃水浴中用氮氣吹干。加入1.0 mL 乙腈-水溶液(1∶9)復溶，過0.22 μm 濾膜，供HPLC-MS／MS 測定。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 液相色譜

色 譜 柱：XSelect?HSS T3 柱(100 mm×2.1 mm，2.5 μm，美國Waters 公司)；柱溫：40 ℃；進樣體積：10 μL；流量：300 μL／min；流動相：A 為乙腈，B 為超純水，洗脫方式為梯度洗脫，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.4.2 質(zhì)譜

電離模式：ESI-；氣簾氣：氮氣，壓力為172 kPa；碰撞氣：氮氣，壓力為34 kPa；離子源電壓：-4 500 V；離子源溫度：500 ℃；霧化氣：氮氣，壓力為345 kPa；輔助加熱氣壓力：345 kPa；掃描模式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)；監(jiān)測離子及主要電壓參數(shù)見表2。

表2 監(jiān)測離子及電壓參數(shù)

1.5 樣品測定與結(jié)果計算

在與標準溶液測定相同條件下，采用“4 分法”規(guī)則對待測物進行定性分析；以保留時間為橫坐標，二級碎片離子中定量離子峰面積為縱坐標，待測物所對應(yīng)的同位素內(nèi)標物為基準，對樣品中玉米赤霉烯酮及其代謝物進行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜流動相選擇

在玉米赤霉烯酮的代謝物中，α-和β-玉米赤霉醇、α-和β-玉米赤霉烯醇與玉米赤霉酮為兩對同分異構(gòu)體，具有相同的母離子和子離子，因此，必須在色譜行為上將這些異構(gòu)體分開，否則會干擾檢測結(jié)果。本實驗考察了0.1%甲酸溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-乙腈、水-甲醇、水-乙腈作為流動相的分離效果。結(jié)果表明，不同體系作流動相分離效果差異很大，當流動相分別為0.1%甲酸溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-乙腈、水-甲醇時，α-玉米赤霉烯醇與玉米赤霉酮不能完全分開。因此本試驗采用水-乙腈體系作為流動相，并對洗脫梯度進行了優(yōu)化。實驗結(jié)果表明，6 種待測組分以及4 種同位素內(nèi)標中的同分異構(gòu)體能夠完全實現(xiàn)基線分離，避免了對質(zhì)譜檢測產(chǎn)生干擾，色譜圖見圖1 和圖2。

2.2 質(zhì)譜條件的建立

玉米赤霉烯酮及其代謝物結(jié)構(gòu)上具有酚羥基，在質(zhì)譜電離時易失去質(zhì)子，采用負離子模式進行檢測。將每種分析物濃度為1.0 μg／mL 的甲醇-水(體積比為50∶50)溶液通過蠕動注射方式注入質(zhì)譜，在ESI-模式下進行掃描。首先進行一級質(zhì)譜掃描，確定各自的母離子，再在二級質(zhì)譜掃描模式下分析，選擇相對響應(yīng)強度較高的離子作為定量和定性離子。最后在MRM 模式下通過優(yōu)化去簇電壓、碰撞能量、入口電壓、碰撞池入口電壓和出口電壓等質(zhì)譜參數(shù)，使各待測物和內(nèi)標的特征碎片離子的離子強度達到最大。

2.3 樣品提取液的選擇

玉米赤霉烯酮及其代謝物可溶于堿性溶液及乙醚、苯、乙腈、氯仿、丙酮和醇類等有機溶劑，但不溶于水。GB／T 21982-2008 方法［17］采用乙醚作為提取溶劑，考慮到乙醚液體易揮發(fā)，具有麻醉性，對人體危害較大，本實驗通過在樣品中添加10 μg／kg待測物標準品，分別考察了乙醚，乙酸乙酯，叔丁基甲基醚的提取效率。結(jié)果顯示叔丁基甲基醚能達到較好的提取效果，6 種目標待測物的提取回收率均大于80%。

2.4 固相萃取小柱的選擇

圖1 6 種玉米赤霉烯酮類物質(zhì)標準溶液的MRM 圖譜

圖2 4 種同位素內(nèi)標標準溶液的MRM 圖譜

固相萃取被廣泛應(yīng)用于動物源性樣品中玉米赤霉烯酮類物質(zhì)的凈化，比較了HLB 固相萃取柱與氨基固相萃取柱、多功能凈化柱(Mycosep226)的凈化效果以及方法回收率。多功能凈化柱(Mycosep226)提取凈化步驟：樣品經(jīng)乙腈-水溶液(體積比為84∶16)提取后，樣液直接經(jīng)Mycosep226凈化柱純化。氨基固相萃取柱提取凈化步驟：待測組分經(jīng)甲醇提取，正己烷脫脂，氮氣吹干后用乙酸乙酯和正己烷復溶后通過加有無水硫酸鈉的氨基固相萃取小柱凈化。試驗結(jié)果見表3，使用氨基固相萃取小柱時，β-玉米赤霉醇和α-玉米赤霉醇的回收率偏高，α-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉烯醇的回收率偏低。HLB 固相萃取柱和Mycosep226 凈化柱在加標回收率方面優(yōu)于氨基固相萃取小柱，6 種組分的加標回收率均大于80%。使用Mycosep226凈化柱的提取凈化方法雖然簡單，但是樣品雜質(zhì)峰較多；HLB 柱的凈化效果更好，因此本試驗采用了HLB 固相萃取柱凈化樣品。

表3 不同凈化柱對6 種玉米赤霉烯酮類物質(zhì)的回收率

2.5 同位素內(nèi)標的選擇

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析過程中存在基質(zhì)效應(yīng)，樣品中的基質(zhì)成分和前處理過程中引入的外來雜質(zhì)會嚴重抑制或增強待測組分在噴霧接口處的離子化，從而影響到檢測的選擇性和靈敏度以及測定結(jié)果的精密度和準確度［18］。基質(zhì)效應(yīng)不可能被完全消除，通常采用空白基質(zhì)標準加入法補償基質(zhì)效應(yīng)，不同的樣品基質(zhì)需要制備不同的基質(zhì)曲線，操作繁瑣。同位素內(nèi)標物與待測組分在整個檢測過程具有相似的行為，是補償基質(zhì)效應(yīng)最理想的方法。

樣品前處理過程步驟較多，多次采用液液萃取，反復轉(zhuǎn)移提取物容易帶來目標分析物的損失。通過在樣品中加入同位素內(nèi)標，不但能有效地去除基質(zhì)效應(yīng)影響，還可以避免前處理過程中待測物的損失對測定結(jié)果帶來的誤差。玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇和α-玉米赤霉醇分別以其同位素標記化合物(13C18-玉米赤霉烯酮、D7-α-玉米赤霉烯醇、D7-β-玉米赤霉烯醇和D5-α-玉米赤霉醇)作內(nèi)標，其它化合物以色譜保留時間相近的同位素化合物為內(nèi)標，β-玉米赤霉醇以D7-β-玉米赤霉烯醇作內(nèi)標，玉米赤霉酮以13C18-玉米赤霉烯酮為內(nèi)標。

2.6 線性方程、檢出限、定量限

對1.2 中配制的系列混合標準工作液進樣分析，得到玉米赤霉烯酮及其代謝物的標準曲線線性范圍為1.0～100.0 μg／L，相關(guān)系數(shù)r均大于0.996。以3 倍信噪比(S／N=3)所對應(yīng)的待測物濃度為檢出限，以10 倍信噪比(S／N=10)所對應(yīng)的待測物濃度為定量限，玉米赤霉烯酮及其代謝物檢出限范圍為0.04～0.13 μg／kg，定量限范圍為0.11～0.43 μg／kg，結(jié)果見表4。

表4 檢出限、定量限、線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)

2.7 回收試驗與精密度試驗

在空白試樣中分別添加三水平(1，4，10 μg／kg)的玉米赤霉烯酮及其代謝物，每個添加水平重復測定6 次，計算平均回收率和精密度，結(jié)果見表5。由表5 可知，平均回收率在77.7%～105.5%之間，相對標準偏差均小于10%，該方法可以滿足玉米赤霉烯酮及其代謝物痕量分析的要求。

3 結(jié)語

結(jié)合玉米赤霉烯酮類物質(zhì)的理化性質(zhì)，對前處理方法以及色譜質(zhì)譜條件進行了優(yōu)化，以4 種同位素標記物作為內(nèi)標，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中玉米赤霉烯酮及其代謝物殘留量的方法。該方法靈敏度高、重復性好，具有較高的回收率和精密度，能夠滿足動物源性食品中玉米赤霉烯酮及其代謝物殘留分析的要求。