加替沙星純度標準物質(zhì)研制

楊夢瑞，簡凌波，李鵬，王敏，周劍，王彤彤，張麗媛

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081）

加替沙星是第四代氟喹諾酮類廣譜抗菌藥物，具有強大的抗菌效能，是近年來增長迅速的氟喹諾酮類藥物代表之一，廣泛應(yīng)用于人類和各種動物疾病的控制、治療及預(yù)防［1-3］。然而，由于養(yǎng)殖過程不規(guī)范使用或濫用，容易造成該藥物在畜禽、水產(chǎn)等動物產(chǎn)品中殘留。雖然我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部235 號、2292號等公告中明確規(guī)定了恩諾沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星、沙拉沙星、洛美沙星、培氟沙星等氟喹諾酮類藥物的禁限用要求，但是加替沙星等新型的氟喹諾酮類藥物逃避監(jiān)管的風險仍然日益增大。目前，雖然已建立了動物源產(chǎn)品中加替沙星殘留分析檢測方法，但是相關(guān)的國家有證標準物質(zhì)還未見報道。因此研制加替沙星純度有證標準物質(zhì)，保證檢測數(shù)據(jù)的量值溯源與準確可靠非常有必要。

純度有證標準物質(zhì)主要有兩個重要作用，一是配制溶液標準物質(zhì)，用于儀器校準；二是為復雜樣品測量結(jié)果賦值，建立計量溯源性，保證測量結(jié)果可溯源至SI 基本單位［4-5］。純度標準物質(zhì)具有準確性、均勻性、穩(wěn)定性等主要特征，純度測量的過程也是給標準物質(zhì)定值的過程。標準物質(zhì)的定值通常有絕對權(quán)威方法定值、不同原理方法定值、實驗室合作定值、比對法定值等幾種方式，針對純度標準物質(zhì)，目前常見并廣泛應(yīng)用的定值方法主要有質(zhì)量平衡法、示差量熱掃描法、定量核磁法等［6-8］。質(zhì)量平衡法需要充分考察有機雜質(zhì)、水分、無機雜質(zhì)以及揮發(fā)性有機雜質(zhì)對主成分含量的影響，它是一種間接測定主成分純度的方法，涉及色譜、卡爾費休滴定、頂空氣相色譜、ICP-MS／OES、離子色譜、熱重分析等多種儀器測定［9］。近年來，隨著核磁技術(shù)的發(fā)展，核磁定量技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于純度標準物質(zhì)定值，該方法快捷、簡便，可通過有證標準物質(zhì)作為內(nèi)標，將測量結(jié)果直接溯源至SI 單位，但是內(nèi)標物的選取至關(guān)重要，首先必須是高純度有證標準物質(zhì)，其次與待測物在氘代試劑中不發(fā)生反應(yīng)，第三用于定量的核磁譜峰互不干擾［10-11］。示差量熱掃描法是基于Vant Hoff方程的純度測定方法，但是不適用于熱穩(wěn)定性差的化合物，且易受雜質(zhì)及樣品本身的物理化學性質(zhì)影響，具有一定的局限性［12］。

筆者針對加替沙星純度標準物質(zhì)缺失的現(xiàn)狀，選擇高純度純品原料，根據(jù)JJF 1006-1994 《一級標準物質(zhì)技術(shù)規(guī)范要求》［13］，采用兩種不同原理的方法對加替沙星純度標準物質(zhì)定值，基于卡爾費休法和熱重分析法準確測量了影響主成分純度的水分含量。考察了加替沙星純度標準物質(zhì)均勻性、穩(wěn)定性，并評估了標準物質(zhì)的不確定度。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：2695 型，美國Waters 公司。

核磁共振儀器：Avance III 型，德國Bruker 公司。

卡爾費休水分滴定儀：TOLEDO DL39 型，瑞士Mettler 公司。

熱重分析儀：TGA-50 型，日本Shimadzu 公司。

分析天平：XS105 型，瑞士Mettler 公司。

氣相色譜儀-氫火焰離子化檢測器：Agilent 6890 型，美國Agilent 公司。

加替沙星純品原料：加拿大TRC 公司。

苯甲酸基準物質(zhì)：編號為GBW 06117，質(zhì)量分數(shù)為99.993%±0.009%，中國計量科學研究院。

氘代乙酸：純度99%，美國Sigma-Aldrich 公司。

乙腈、甲醇有機溶劑：色譜純，德國Merck 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準物質(zhì)候選物選擇

加替沙星純度標準物質(zhì)原料來自于市售純品，產(chǎn)品包裝規(guī)格為100 g。為了進一步確認原料的準確可靠，分別采用紅外光譜法、質(zhì)譜法等手段對購買的原料進行了主成分定性分析。將經(jīng)過主成分定性分析且充分混合好的標準物質(zhì)原料，分裝至5 mL潔凈樣品瓶中，置于潔凈干燥器內(nèi)干燥24 h 后，加蓋密封。每個包裝量為100 mg，共400 個包裝單元。置于4℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 定值方法

(1)質(zhì)量平衡法［14］中主要儀器工作條件。

高效液相色譜儀：色譜柱為Agilent Eclipse Plus SB-Aq 型(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱；流動相：乙腈-水(0.05 mol／L 磷酸二氫鉀溶液-3%磷酸，用三乙胺調(diào)節(jié)至pH 3.3)(體積比為15∶85)；流量：1.0 mL／min；進樣體積：10 μL；紫外檢測器：檢測波長為291 nm。

卡爾費休法測定水分：采用水分標準物質(zhì)校準儀器后，稱取5～7 mg 待測樣品，待滴定結(jié)束，記錄水分含量。

TGA 法水分測定升溫程序：先以5℃／min 勻速升溫至105℃，保持5 min，之后繼續(xù)以5℃／min升溫至恒重，記錄失重質(zhì)量分數(shù)。

(2)核磁共振定量法。

選擇苯甲酸基準物質(zhì)為內(nèi)標，將準確稱量的加替沙星標準物質(zhì)與苯甲酸內(nèi)標物共溶解于1 mL 氘代乙酸溶劑中，待充分溶解后，移取至石英核磁管中，參照文獻［15］測定加替沙星的純度。

1.2.3 均勻性檢驗

隨機抽取15 個包裝單元，每個單元取3 個子樣，采用液相色譜法測定主成分，同時采用卡爾費休法測定15 個抽取單元中水分含量，主成分扣除水分后進行均勻性檢驗。測量的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析法進行統(tǒng)計檢驗，通過比較F檢驗值與F臨界值的大小來判定。

1.2.4 穩(wěn)定性考察

長期穩(wěn)定性：在分裝儲藏后的0、1、3、6 個月抽樣測定。

短期穩(wěn)定性：模擬運輸過程溫度變化，分別在20、40、60℃條件下監(jiān)測9 天的穩(wěn)定性。每個溫度時間條件下隨機抽取2 個包裝，采用液相色譜法測定主成分，平行測定3 次，同時測定每個單元的水分含量，主成分扣除水分后進行穩(wěn)定性考察，采用趨勢分析法評價穩(wěn)定性監(jiān)測結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 定值研究

采用質(zhì)量平衡法對經(jīng)過定性確認分析并分裝好的加替沙星純度標準物質(zhì)候選物進行純度定值?；谇捌诜Z酮類標準物質(zhì)的研究基礎(chǔ)，認為SB-Aq 色譜柱更適用于此類藥物純度標準物質(zhì)中雜質(zhì)的色譜響應(yīng)與分離，因此選擇0.3%磷酸溶液與磷酸二氫鉀-磷酸(三乙胺，pH 3.3)的緩沖溶液作為水相，乙腈作為有機相，并進一步優(yōu)化了流動相比例，加替沙星及其雜質(zhì)的高效液相色譜圖見圖1。如圖1 所示，當有機相與水相比例為15∶85 時，主峰對稱性好，圖1 中1、2、3、4 均為雜質(zhì)峰，由圖1 可以看出雜質(zhì)峰充分響應(yīng)，并且主成分及4 個雜質(zhì)峰能夠很好的實現(xiàn)基線分離，滿足面積歸一化定值要求。采用上述條件，對隨機抽取的7 個單元，測量了加替沙星主成分及結(jié)構(gòu)相似有機雜質(zhì)的含量。

圖1 加替沙星及其雜質(zhì)的高效液相色譜圖

然而，對于藥物純度標準物質(zhì)，水分含量是影響純度的關(guān)鍵因素，由于加替沙星具有一定的吸濕性，水分含量的控制與準確測定是該純度標準物質(zhì)研制的重要環(huán)節(jié)。因此本研究重點采用熱重分析(TGA)和卡爾費休兩種不同原理的方法，對封裝好的標準物質(zhì)候選物中水分含量進行了較為充分的分析與測定。實驗采用TGA 法測定水分，結(jié)果如圖2所示，整個升溫過程失重質(zhì)量6.237%，由圖2 中升溫曲線的平臺部分可以看出，失重基本發(fā)生在保持105℃恒溫5 min 階段之前，我們推測失重主要是以水分失去造成的。同時采用了卡爾費休法準確測定了加替沙星純度標準物質(zhì)中水分含量，兩種方法水分測定結(jié)果基本一致，結(jié)果表明TGA 法也可用于加替沙星中水分準確測定，實驗采用卡爾費休法測定值為水分含量最終結(jié)果。采用頂空氣相色譜和ICP-MS 分別測量了有機揮發(fā)性雜質(zhì)和無機雜質(zhì)，結(jié)果顯示其總含量小于0.014%，對純度定值結(jié)果影響可忽略，不作詳細討論。定值結(jié)果如表1 所示，質(zhì)量平衡法測定的加替沙星純度值為93.23%。

圖2 加替沙星純度標準物質(zhì)TGA 曲線圖

表1 加替沙星的質(zhì)量平衡法定值結(jié)果 %

綜上所述，加替沙星純度質(zhì)量分數(shù)定值結(jié)果為93.1%。

圖3 苯甲酸與加替沙星樣品的1H-NMR 譜圖

表2 加替沙星的定量核磁法(1H-NMR)定值結(jié)果 %

2.2 均勻性檢驗

均勻性檢驗采用高效液相色譜峰面積歸一化法，針對機抽取的樣品從1 到15 編號，潔凈干燥環(huán)境下平衡至室溫后，每個單元取3 個子樣，分別配制成質(zhì)量濃度為100 mg／L 的加替沙星甲醇溶液，上機測定。同時采用卡爾費休法測定15 個抽取單元中水分含量。定值結(jié)果采用單因素方差分析法進行統(tǒng)計檢驗［16］,加替沙星均勻性檢驗結(jié)果見表3。

表3 加替沙星純度標準物質(zhì)均勻性檢驗結(jié)果 %

2.3 穩(wěn)定性考察

根據(jù)JJF 1343-2012 《標準物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》的要求，重點考察了長期保存和短期運輸條件下，環(huán)境溫度對加替沙星純度標準物質(zhì)特性量值的影響。由于加替沙星具有較強的吸濕性，因此在穩(wěn)定性考察時也充分考慮了其中水分含量的變化及其對特性量值的影響。按照先密后疏的原則，長期穩(wěn)定性分別在第0、1、3、6 個月進行穩(wěn)定性考察。每次隨機抽取2 個包裝，采用重量-容量法配制溶液，高效液相色譜法測定主成分含量，每個單元平行測定三次，同時利用卡爾費休法測定每個包裝的水分含量。圖4 和圖5 分別為加替沙星純度與包裝單元內(nèi)水分含量半年的監(jiān)測結(jié)果。以監(jiān)測時間和測定結(jié)果擬合直線，采用趨勢分析法［16］進行穩(wěn)定性檢驗，結(jié)果見表4。

圖4 加替沙星純度標準物質(zhì)中加替沙星6 個月穩(wěn)定性趨勢圖

圖5 加替沙星純度標準物質(zhì)中水分含量的6 個月穩(wěn)定性趨勢圖

表4 加替沙星純度標準物質(zhì)穩(wěn)定性監(jiān)測結(jié)果 %

由 表4 計 算 得，b1=0.023 1，b0=93.32，s2=0.009 322 70，s(b1)=0.021 069 83，t0.95，n-2=4.3，s(b1)t0.95，n-2=0.090 6。結(jié)果：|b1|＜t0.95，n-2s(b1)，無顯著性差異。說明6 個月內(nèi)加替沙星純度及其包裝單元內(nèi)的水分含量沒有明顯的變化趨勢，穩(wěn)定性檢驗合格。

針對短期穩(wěn)定性考察，為了模擬運輸條件，將隨機抽取的樣品分別置于20、40、60℃的恒溫箱中，分別在第1、3、5、7、9 天測定。測定方法與長期穩(wěn)定性相同，結(jié)果見表5～表7。

表5 20℃下加替沙星固體純度標準物質(zhì)測定結(jié)果

根據(jù)表5 數(shù)據(jù)計算得：b1=-0.037 7，b0=93.516，s2=0.010 629 8，s(b1)=0.016 301 7。t0.95，n-2=3.18，s(b1)t0.95，n-2=0.051 839 478，|b1|＜s(b1)t0.95，n-2，說明20℃下短期穩(wěn)定性檢驗合格。

表6 40℃下加替沙星固體純度標準物質(zhì)測定結(jié)果

根據(jù)表6 數(shù)據(jù)計算得：b1=-0.012 1，b0=94.17，s2=0.064 093 4，s(b1)=0.040 029 2。t0.95，n-2=3.18，s(b1)t0.95，n-2=0.127 292 8，|b1|＜s(b1)t0.95，n-2，說明40℃下短期穩(wěn)定性檢驗合格。

表7 60℃下加替沙星固體純度標準物質(zhì)測定結(jié)果

根據(jù)表7 數(shù)據(jù)計算得：b1=0.085 9，b0=93.773，s2=0.072 649 5，s(b1)=0.016 301 7。t0.95，n-2=3.18，s(b1)t0.95，n-2=0.135 523 2，|b1|＜s(b1)t0.95，n-2，說明60℃下短期穩(wěn)定性檢驗合格。

圖6～圖8 為不同溫度模擬下9 天時間范圍內(nèi)加替沙星純度值變化。圖6 和圖7 中替沙星純度值無明顯的變化趨勢，圖8 顯示加替沙星質(zhì)量分數(shù)有升高的趨勢。圖9 為不同溫度條件下水分變化趨勢，由圖9 可以看出，40、60℃時水分含量隨時間變化有顯著的降低，推測是由于在較高的溫度條件下，加替沙星固體粉末中吸附水揮發(fā)所致，進一步揭示了圖8 中加替沙星純度升高的原因。

圖6 20 ℃時加替沙星的短期穩(wěn)定性趨勢圖

圖7 40 ℃時加替沙星的短期穩(wěn)定性趨勢圖

圖8 60 ℃時加替沙星的短期穩(wěn)定性趨勢圖

圖9 水分含量的短期穩(wěn)定性趨勢圖

綜上所述，加替沙星純度標準物質(zhì)6 個月長期穩(wěn)性定良好。短期穩(wěn)定性在40、60℃條件下，由于水分變化導致加替沙星質(zhì)量分數(shù)有增大的趨勢，為了保證量值的準確可靠，應(yīng)確保將運輸溫度控制在20℃以下。

2.4 不確定度評定

基于前期研究報道的不確定度評估與計算方法［14］，系統(tǒng)分析與評估了加替沙星純度標準物質(zhì)研制過程中的不確定度，結(jié)果見表8。加替沙星純度標準物質(zhì)純度值為93.1%，擴展不確定度為0.6%(k=2)

表8 加替沙星純度標準物質(zhì)不確定度評估結(jié)果 %

3 結(jié)語

研制了加替沙星純度標準物質(zhì)。該標準物質(zhì)定值結(jié)果準確可靠、一致性好，水分含量穩(wěn)定，特性量值的均勻性良好，6 個月內(nèi)穩(wěn)定性可靠。該純度標準物質(zhì)的研制，填補了國內(nèi)加替沙星純度標準物質(zhì)空白，保證了加替沙星相關(guān)檢測結(jié)果的計量溯源性。