氣相色譜-質(zhì)譜法測定食用植物油中短鏈脂肪酸的測量不確定度評定

徐列兵，郭強，賈煜，朱軍，王丹

（河北中石油中心醫(yī)院，河北廊坊 065000）

測量不確定度是與測量結(jié)果關(guān)聯(lián)的一個參數(shù)，表明結(jié)果的可信賴程度，也是顯示測量結(jié)果質(zhì)量的重要指標(biāo)，尤其是對第三方檢驗檢測機構(gòu)來講，當(dāng)測量結(jié)果出現(xiàn)臨界值或需要對非標(biāo)準(zhǔn)方法的建立和確認(rèn)時［1］，不確定度評定具有重要意義。

筆者采用的氣相色譜-質(zhì)譜儀測定食用植物油中短鏈脂肪酸的方法［2］屬于實驗室自己制定的方法，主要是針對食用植物油品質(zhì)的研究，食用植物油的品質(zhì)一直是人們關(guān)注的重點，正常食用植物油中應(yīng)不含有低于16 個碳的脂肪酸酯，但經(jīng)反復(fù)高溫加熱，會發(fā)生氧化、裂解等反應(yīng)，產(chǎn)生異構(gòu)體、反式脂肪酸和短鏈脂肪酸等。因此對食用植物油中短鏈脂肪酸含量的測定可以作為食用植物油品質(zhì)鑒別的一種輔助指標(biāo)。目前，對食用植物油短鏈脂肪酸的研究報道較少［3-6］，也未見其不確定度評定的報道。因此筆者以辛酸的測定為例，根據(jù)JJF 1059.1-2012 《測量不確定度評定與表示》以及其它不確定度評定方法［7-15］對測量結(jié)果進行不確定度評定，分析其來源，并對不確定度分量進行量化，以獲得影響測量結(jié)果準(zhǔn)確性的因素，并在實驗過程中得以關(guān)注與控制。

1 實驗部分

1.1 原理

正常食用植物油中應(yīng)不含有低于16 個碳的脂肪酸酯，但經(jīng)反復(fù)高溫加熱，會發(fā)生氧化、裂解等反應(yīng)，產(chǎn)生異構(gòu)體、反式脂肪酸和短鏈脂肪酸等。采用皂化反應(yīng)原理，在植物油中加入適量NaOH 加熱除去長鏈脂肪酸，再經(jīng)酸化，用正己烷萃取，可得到游離的短鏈脂肪酸，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定短鏈脂肪酸的含量。

1.2 主要儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜儀：5973i／6890N 型，美國安捷倫科技有限公司。

電子天平：AE240 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

恒溫磁力攪拌器：85-2 型，上海司樂儀器有限公司。

正己烷：色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

辛酸鈉：分析純，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司。

氫氧化鈉：分析純，天津市天大化工實驗廠。

濃磷酸：優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。無水亞硫酸鈉：分析純，天津市佳興化工有限公司。

樣品：食用大豆油。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜

色譜柱：HP-5 MS 型色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司）；柱流量：0.5 mL／min；分流比：30∶1；進樣口溫度：220 ℃；高純氦氣；程序升溫：初始柱溫80 ℃，保持時間為2 min，以10 ℃／min 升至200 ℃，保持時間為18 min；進樣體積：1 μL。

1.3.2 質(zhì)譜

離子源：EI 源，溫度為230 ℃；溶劑延遲：4.00 min；總離子掃描質(zhì)量范圍：40～500 Da；用NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫檢索定性；選擇離子：m／z60、m／z73。

1.4 實驗步驟

1.4.1 樣品制備

短鏈脂肪酸的提?。悍Q取已放置冷卻的經(jīng)100 ℃加熱0.5 h 的油樣25 g 于圓底燒瓶中，加入3.4 g NaOH，加入適量水（約30 mL）使其溶解，再加入無水亞硫酸鈉0.1 g，100 ℃下冷凝回流1 h 后移入分液漏斗，室溫靜置2 h 使其分層。取水相至錐形瓶，在冰水浴中用濃磷酸調(diào)至pH 1，密塞，在冰箱中冷凍0.5 h，取出后，用正己烷萃取兩次并定容至10 mL 容量瓶中，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜（有機相）過濾，得游離的短鏈脂肪酸，取正己烷層1 μL 進樣。

1.4.2 溶液配制

用電子天平準(zhǔn)確稱取辛酸鈉0.011 6 g，用約2 mL 水溶解，以濃H3PO4調(diào)pH 1，用辛酸鈉酸化后游離出辛酸，然后用5 mL 正己烷萃取，將萃取液置于10 mL 容量瓶中，用正己烷稀釋，配制成濃度為1 000 μg／mL 的辛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

取7 支10 mL 容量瓶，用2 mL 分度吸量管分別量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1、2 mL 置于10 mL 容量瓶中，用正己烷定容，得濃度為50、100、200 μg／mL 辛酸溶液；用5 mL 分度吸量管取50 μg／mL 辛酸溶液5 mL 于10 mL 容量瓶中，定容，得濃度為25 μg／mL 辛酸溶液，再取25 μg／mL 辛酸溶液5 mL 于10 mL 容量瓶中，定容，得濃度為12.5 μg／mL 辛酸溶液；取12.5μ g／mL 辛酸溶液5 mL 于10 mL 容量瓶中，定容，得濃度為6.25 μg／mL 辛酸溶液，最終配制得到辛酸濃度分別為0、6.25、12.5、25、50、100、200 μg／mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按1.3 儀器工作條件進樣測定，以色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的質(zhì)量濃度（x，μg／mL）為橫坐標(biāo)進行線性回歸，計算得線性方程為y=1.39×104x-1.49×105。

1.4.3 油樣中辛酸含量計算

依次測量標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液，樣品溶液中辛酸濃度通過線性方程計算得出；油樣中辛酸的含量（mg／kg）按式(1)計算。

2 不確定度來源分析

測量不確定度評定分為標(biāo)準(zhǔn)不確定度A 類評定、標(biāo)準(zhǔn)不確定度B 類評定。多次重復(fù)測量采用A類評定，其它采用B 類評定，根據(jù)以上測定步驟建立的數(shù)學(xué)模型見式(1)。

測量結(jié)果不確定度來源于“人、機、料、法、環(huán)、測、抽、樣”八個方面。實驗人員均具備相應(yīng)的能力，人員操作的不確定度忽略不計，僅引入人員讀數(shù)誤差導(dǎo)致的不確定度；本實驗不涉及抽樣，抽樣的不確定度可不予考慮；樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液的進樣均采用自動進樣設(shè)備，進樣體積引入的不確定度可不予考慮。本方法測量結(jié)果的不確定度主要來源如下：

（1）樣品制備過程：包括25 g 油樣單次稱量引入的A 類不確定度，天平、樣品溶液體積定容引入的B 類不確定度。

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度的配制過程：包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)單次稱量引入的A 類不確定度，天平、容量瓶、分度吸量管引入的B 類不確定度，人員讀數(shù)引入的B 類不確定度等。

（3）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀引入的B 類不確定度。

（4）在相同條件下，同一樣品重復(fù)測量（cs）引入的A 類不確定度。

（5）加標(biāo)回收率（R）引入的A 類不確定度。

（6）環(huán)境溫度的變化引入體積相對變化的不確定度。

由于各不確定度分量量綱不一致，因此采用相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度進行評定。

3 不確定度評定

3.1 樣品前處理過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.1.1 樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1，rel

3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3，rel

按照實驗方法，此過程引入的不確定度包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)單次稱量引入的A 類不確定度和電子天平、2 mL 分度吸量管、5 mL 分度吸量管、10 mL 容量瓶引入的B 類不確定度，因試劑為色譜純，忽略試劑純度引入的測量不確定度。

3.2.1 辛酸鈉稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)

稱 量0.011 6 g 辛 酸 鈉(C8H16NaO2)，實 際 稱量1 次，辛酸鈉稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度同3.1.1，uc1=0.30 mg，則辛酸鈉稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)：

3.2.2 相對分子質(zhì)量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

因辛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液采用辛酸鈉配制，因此存在相對分子量的不確定度，辛酸鈉是由C、H、O、Na 四種元素組成，查1993 年國際上公布的元素相對原子質(zhì)量表，得到C、H、O、Na 四種元素相對原子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：u(C)=0.000 8 g，u(H)=0.000 07 g，u(Na)=0.000 002 g，u(O)=0.003 g。

辛酸鈉相對分子質(zhì)量為167.190 41，辛酸鈉相對分子質(zhì)量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel［M(C8H16NaO2)］=uc2／167.190 41=0.003%

計算結(jié)果表明，在進行測量不確定度評定時，相對分子量不準(zhǔn)引入的不確定度值較小，可以忽略不計。

3.2.3 計量器具引入的不確定度

本實驗方法中，計量器具引入的不確定度來源于2 mL 分度吸量管、5 mL 分度吸量管量、10 mL 容量瓶，此外，還有環(huán)境溫度變化引入體積相對變化的不確定度和人員讀數(shù)引入的不確定度。

（1）2 mL 分度吸量管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(2 mL)。

根據(jù)《常用玻璃儀器檢定規(guī)程》［10］，2 mL A 級分度吸量管允許誤差為±0.012 mL，最小分度值為0.02 mL。按均勻分布考慮，k= 3，2 mL 分度吸量管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(2mL)=0.012／ 3 =0.006 9 mL；假設(shè)人員讀數(shù)誤差不超過最小分度值的 1／3，按均勻分布考慮，k= 3，則人員讀數(shù)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(e)=0.006 7／ 3 =0.003 9 mL。

合成得2 mL 分度吸量管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.3 測量設(shè)備引入的不確定度u4，rel

查閱氣相色譜質(zhì)譜校準(zhǔn)證書：質(zhì)譜(MS)靈敏度擴展不確定度U=8%(k=2)，測量重復(fù)性為3.9%，則質(zhì)譜靈敏度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(MS)=U／k=8%／2=4%。計算得氣相色譜質(zhì)譜引入的相對不確定度：

測量設(shè)備的不確定度在實驗中是無法避免的，因此要使用經(jīng)過檢定合格的或經(jīng)過校準(zhǔn)的測量設(shè)備，并且在使用過程中要進行期間核查，確保設(shè)備穩(wěn)定性。

3.4 樣品重復(fù)測定引入的A 類不確定度u5，rel

3.5 回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u6，rel

平行制備3 份空白樣品的加標(biāo)溶液，辛酸加標(biāo)濃度為50 μg／mL，測得回收率分別為102%、101%、103%。按照極差法評定回收率引入的不確定度urel(R)，極差R=103%-101%=2%，測量次數(shù)n=3，查表得極差系數(shù)C=1.69，則s(x)=R／C=2%／1.69=1.18%。計算得回收率引入的A 類不確定度：

3.6 不確定度評定結(jié)果

以上各個不確定度分量互不相關(guān)，則合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

根據(jù)數(shù)學(xué)模型計算得25 g 油樣中辛酸含量為13.1 mg／kg，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

取包含因子k=2(近似95%置信區(qū)間)，則擴展不確定度：U=0.86×2=1.8 mg／kg。

該食用植物油樣品中辛酸的含量：(13.1±1.8)mg／kg(k=2)。

4 結(jié)語

從實驗結(jié)果的不確定度評定過程可以看出，標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制過程以及測量設(shè)備對結(jié)果的不確定度影響較大，建議在實驗中選用高純的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或者有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，盡量減少計量器具使用的次數(shù)，使用經(jīng)檢定合格或校準(zhǔn)的測量設(shè)備。通過不確定度評定，不僅可確定影響測定結(jié)果準(zhǔn)確性的因素，還對實驗方法的建立具有指導(dǎo)意義。