假病毒在腸道病毒相關研究中的應用

霍雅倩 綜述，毛群穎，李秀玲 審校

1.上海生物制品研究所有限責任公司，上海200050；2.中國食品藥品檢定研究院肝炎病毒疫苗室，北京100050

腸道病毒（enterovirus，EV）屬于小 RNA 病毒科腸道病毒屬，是一類無包膜病毒，包括EV-A ～L 共12 個組，約 163 種病毒（https：／ ／ talk.ictvonline.org.）。EV為20 ～30 nm 的二十面體立體對稱球形顆粒，由1個裸露在外的病毒蛋白衣殼和內含的一條單股正鏈RNA 構成，引起的重癥疾病包括無菌性腦膜炎、腦干腦炎、心肌炎和脊髓灰質炎［1-3］等。20 世紀上半葉，脊髓灰質炎病毒曾在全球范圍內流行，直至疫苗的普及和應用，有效控制了疾病流行。WHO 提出了全球消除脊髓灰質炎的倡議和目標［4］，使人類進入后脊髓灰質炎時代。自20 世紀90 年代以來，由EV71、CV-A16 等多種EV 引起的嬰幼兒手足口?。╤and-foot-mouth disease，HFMD）在亞太地區(qū)出現(xiàn)持續(xù)大范圍暴發(fā)流行，呈現(xiàn)出流行強度高、范圍廣、重癥和死亡人數(shù)多的特點［5］，引起了人們高度關注。

2015 年12 月，在國家的重點支撐下，經過8 年的聯(lián)合攻關，由我國自主研發(fā)的EV71 全病毒滅活疫苗獲批上市。上市后我國HFMD 死亡病例持續(xù)降低，至2018 年我國HFMD 的死亡病例已較該疫苗上市前（2010—2015 年均值）下降了93%（http：／／www.nhc.gov.cn.），使我國成為全球唯一可以有效防控EV71所致HFMD 的國家。而由CV-A16、CV-A6 及CV-A10等其他EV［6］引起的HFMD 仍呈持續(xù)高流行態(tài)勢，近年來由EV71 為核心的多價HFMD 疫苗的研發(fā)得到越來越多的重視［7］。相關領域的病原學、流行病學、動物模型、檢測方法等相關研究均得到了快速發(fā)展。

假病毒由于可攜帶報告基因，且只能進行一個細胞周期的感染，具有生物安全性高、與真病毒特性相近、定量準確客觀、研發(fā)速度快等優(yōu)勢，已被廣泛應用于多種病毒的相關研究中。本文就假病毒在EV 中和抗體檢測方法、抗病毒藥物篩選、可視化動物模型建立等方面的研究進展作一綜述。

1 假病毒的定義

假病毒是一種人工構建的不具有完整基因組的病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs），與天然病毒相比，其表達包膜蛋白或衣殼蛋白的序列被刪除或被修飾，通常由報告基因代替，使其保持了天然病毒可感染宿主細胞的特性，但又不能擴增、復制，無法產生具有感染性的子代病毒顆粒，因此不會污染環(huán)境，生物安全性高，不需要在BSL-3 及以上級別實驗室進行操作［8］。同時假病毒還可通過攜帶特定報告基因，如熒光素酶等，利用化學發(fā)光，達到對病毒客觀、準確定量的目的，也可通過活體成像、定位，直觀反映病毒在動物體內的動態(tài)轉歸［9］。近年來已越來越多地應用于病毒進入宿主細胞過程和特異性受體、中和抗體表位、假病毒疫苗、中和抗體滴度檢測方法、抗病毒藥物篩選、病毒基因治療、可視化動物模型建立等研究中［10］。另外，假病毒由于其整合衣殼蛋白的能力及較高的轉染效率，具有宿主范圍廣泛、可抵抗血清補體的滅活等作用［10］。

2 假病毒的構建

病毒的構建是假病毒研究的關鍵環(huán)節(jié)。以人EV、乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）為代表的非包膜病毒［11］通常使用多質粒共轉染，或RNA與質粒共轉染哺乳動物細胞構建假病毒［4］。多質粒共轉染系統(tǒng)是將T7 RNA 聚合酶質粒、復制子質粒、衣殼子質粒共轉染至敏感細胞，復制子在T7 RNA 聚合酶的作用下在細胞內轉錄。RNA 與質粒共轉染系統(tǒng)是先將復制子質粒進行體外轉錄獲得RNA，再與衣殼子質粒共轉染至敏感細胞獲得假病毒。而包膜病毒通常使用人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）、鼠白血病病毒（murine leukemia virus，MLV）等商業(yè)化載體構建假病毒［12］。

3 EV 假病毒的構建

EV 基因組為1 條長約 7 500 nt 的單股正鏈RNA，包括5′UTR、1 個開放閱讀框（open reading frame，ORF）和 3′Poly（A）尾。ORF 編碼 1 個多聚前體蛋白，可進一步水解為 P1、P2、P3 3 個前體蛋白，P1 編碼VP1、VP2、VP3、VP4 4 個衣殼蛋白，P2、P3 編碼 2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D 7 個非結構蛋白［14］。

假病毒主要由復制子質粒、衣殼子質粒兩部分構成。其中，復制子質粒通常采用T7 啟動子、EV 5′UTR、熒光素酶報告基因、2A 蛋白酶切割序列、EV非結構蛋白 P2 和 P3 序列及 3′Poly（A）尾構建；衣殼子質粒通常采用增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）、2A 蛋白酶切割序列和 EV 衣殼蛋白P1 序列構建。通過多質粒共轉染系統(tǒng)或RNA與質粒共轉染系統(tǒng)獲得假病毒［14］。近年腸道病毒假病毒的構建情況和應用現(xiàn)狀見表1。

表1 已構建的EV 假病毒的應用現(xiàn)狀Tab.1 Application of constructed pseudoviruses

衣殼蛋白是決定EV 特性的核心區(qū)域，因此衣殼子質粒需使用目的病毒的衣殼蛋白區(qū)基因序列構建，而復制子質?；驈椭谱覴NA 通常可由與目的病毒同型或同組病毒的基因組（除衣殼蛋白外）所構建。除CV-B5 假病毒外，通常使用與衣殼子同組病毒的復制子（如均為EV-A 的EV71 復制子與CV-A16衣殼子）共轉染可成功獲得假病毒；但使用與衣殼子不同組病毒的復制子（如EV71 復制子與CV-B3 衣殼子、CV-B5 復制子與CV-A6 衣殼子）均無法成功獲得有效的假病毒，可能是由于同一種類的病毒包裝機制有共同點或相似點，但不同種病毒的包裝機制均不相同［29］。見表2。CHEN 等［14］采用多質粒共轉染系統(tǒng)與RNA 及質粒共轉染系統(tǒng)均無法獲得以CVB5 基因組為復制子的CV-B5 假病毒，最終使用CVB3 復制子構建假病毒，可能是由于CV-B5 的基因結構本身不太穩(wěn)定，而采用報告基因替換P1 序列的假病毒構建方式加重了該結構的不穩(wěn)定性。

表2 EV 假病毒的構建Tab.2 Construction of pseudoviruses

4 假病毒在EV 相關研究中的應用

4.1 中和抗體檢測 中和抗體是評價疫苗有效性、人體保護效果等方面的關鍵指標。因此，經驗證的中和抗體方法對疫苗生產的質控和評價十分重要。傳統(tǒng)中和抗體檢測（conventional neutralization test，cNT）通常采用細胞病變（cytopathic effect，CPE）法或蝕斑減少法進行，即通過中和抗體可特異性抑制目的病毒對細胞的致病變能力，反映抗體對病毒的中和能力，但由于cNT 需要人為觀察CPE 來判定結果，具有主觀性強、精確度低、耗時長、操作繁瑣［14］及實驗室安全級別要求高等問題。為縮短檢測周期，近年來，改良的酶聯(lián)免疫吸附斑點試驗（enzyme-linked immunosorbent spot assay）采用包被的HRP 標記單克隆抗體，可捕獲病毒感染后細胞分泌的蛋白，通過酶聯(lián)斑點顯色的方式反映中和抗體對病毒感染細胞的能力，檢測周期短（14 h）［30］、特異性高［31］，但仍需使用活病毒，且靈敏度低、線性差［27］。而基于假病毒的中和試驗（pseudovirus-based neutralization test，pNT）僅需將一定拷貝數(shù)的假病毒與血清樣本于37 ℃，5%CO2條件下中和數(shù)小時，隨后加入病毒的敏感細胞，孵育10 ～16 h，經清洗、裂解細胞內假病毒后，加入報告基因底物，經化學發(fā)光儀檢測即可準確得到假病毒含量。結果以相對光單位（relative light unit，RLU）表示，通過標準曲線的線性方程即可得到中和抗體效價，從而避免了人為觀察的主觀性，具有客觀、準確、快速、安全性高的優(yōu)勢。

臨床樣本考核是評價檢測方法的有效手段。部分 EV pNT 的臨床樣本考核結果［14-15，21-23］見表 3，可見 EV71、CV-A6、CV-A10、CV-B5 4 種 pNT 試驗的敏感性均 ＞ 90%，敏感性較高；EV71、CV-A6、CV-A10的特異性較好，而CV-B5 的特異性較低，導致其假陽性率偏高；pNT 試驗的陽性預測值均 ＞95%；EV71、CV-A6、CV-A10 的陰性預測值較高，CV-B5 較低；EV71、CV-A6、CV-A10 的約登指數(shù)較高，CV-B5相對較低。

相關性分析是反映新建檢測方法的另一關鍵指標。作為目前公認的金標準，pNT 常以cNT 為依據(jù)，通過統(tǒng)計學手段進行相關性與一致性分析。已建立的 EV71、CV-A6、CV-A10、CV-A16、CV-B3 5 種 pNT均表現(xiàn)出了與cNT 良好的相關性（P 均＜0.000 1）和較高的一致性［4，14-15，21，23-24，26］，見表 4。PV pNT 的相關性較高（P 均＜0.01），其一致性分析采用口服脊髓灰質炎疫苗（oral poliomyelitis vaccine，OPV）、野毒株脊髓灰質炎滅活疫苗（inactivated poliovirus vaccine from salk strain，wIPV）、Sabin 株脊髓灰質炎滅活疫苗（inactivated poliovirus vaccine from sabin strain，sIPV）的免疫血清進行評價，結果表明，pNT 與cNT 的檢測結果相近，均具有較高一致性。研究還使用PV-2 和PV-SabinⅡ的pNT 與cNT 檢測不同疫苗免疫血清中和滴度，結果表明，當采用同一型檢測毒株，兩種方法具有較高的一致性［27］。提示已建立的EV pNT結果準確，可作為cNT 的替代方法用于臨床樣本的檢測和評價［14］。

表3 EV pNT 的臨床樣本考核評價Tab.3 Evaluation of EV pNT in clinical samples

4.2 可視化動物模型 動物模型是疾病研究及相關疫苗、藥物研發(fā)和評價的另一關鍵工具。由于多數(shù)EV 可對新生實驗動物具有一定致病能力，但對成年實驗動物不敏感，因此多數(shù)EV 動物模型只能采用新生動物模型建立，如EV71、CV-A16 等乳鼠模型。但由于新生動物免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全，在疫苗保護效果等研究中只能通過免疫母體，通過母傳抗體保護新生動物的能力間接進行保護效果評價。而假病毒由于可帶有發(fā)光報告基因，同時又具有活病毒相應的感染能力和特性，可用于建立直觀、且可動態(tài)觀察的可視化動物感染模型建立，并可通過活體成像技術檢測報告基因的RLU 值，定量反映病毒在動物體內特定部位的相對含量。同時，由于不需要觀察動物發(fā)病或死亡情況，從而避免了只能采用乳鼠間接評價保護效果的局限性，通過活體成像技術直接檢測成年小鼠的感染情況，直接反映疫苗對病毒感染的保護效果。

ZHOU 等［19］采用導入 hSCARB2 基因的 C57BL ／6小鼠建立了EV71 報告基因假病毒的可視化感染模型，通過將滅活病毒疫苗注射至動物體內，隨后采用一定劑量假病毒對實驗動物進行攻擊，評價疫苗主動免疫的保護效果，結果顯示，滅活病毒疫苗的平均保護率為88%。以BALB／c 小鼠建立的CV-B5 假病毒可視化感染模型［9］與CV-A6 假病毒可視化感染模型［22］也已成功構建，并證實了滅活病毒疫苗的免疫保護效果，為CV-A6、CV-B5 疫苗研發(fā)提供了有效的研究工具。

表 4 EV cNT 與pNT 的比較分析Tab.4 Comparison of EV cNT and pNT

4.3 抗病毒藥物篩選 與中和抗體檢測的方法相近，傳統(tǒng)的抗病毒藥物篩選也往往以活細胞為載體，即通過觀察病毒在活細胞上引起的CPE 評價藥物的抗病毒作用［32］。除具有與cNT 方法相同的缺點和問題外，還難以區(qū)分因藥物本身可能對細胞存在毒性的問題。包含報告基因的假病毒可有效避免以上問題，實現(xiàn)快速、高通量地檢測病毒感染情況，從而準確反映藥物對病毒的抑制能力。但由于假病毒的報告基因在病毒粒子包裝之前已經表達，對作用于病毒轉錄后的藥物難以進行評價，使假病毒在抗病毒藥物篩選中的應用存在一定局限性［32］。

SU 等［21］使用 EV71 和 CV-A16 的假病毒及感染性克隆建立了藥物篩選方法，并應用該方法對400 種天然化合物庫進行抗EV71 和CV-A16 藥物的初篩，發(fā)現(xiàn)了44 種化合物可抑制報告基因的表達，經活細胞法復篩確認，證明木犀草素、高良姜素和榭皮素3 種化合物可有效抑制EV71 和CV-A16 對活細胞的感染。

5 小結及展望

目前已建立了 EV71、CV-A6，10，16、CV-B3，5、PV-1 ～ 3，SabinⅡ等 7 種 EV 的 pNT 法及 EV71、CV-A6、CV-B5 可視化動物模型，EV71 和 CV-A16 假病毒已在藥物篩選中初步應用，顯示了良好的應用效果和前景，但仍存在檢測病原單一、方法標準化、替代野毒株cNT 法的驗證等問題。應充分利用可人工構建的優(yōu)勢，進一步開展高通量多通道pNT 方法研究，加強pNT 與cNT 法的比較，完善方法驗證和轉換的依據(jù)，為EV 的疫苗評價和藥物篩選提供工具。