金黃色葡萄球菌生物膜形成及其與持留菌關(guān)系研究進(jìn)展

景雙艷 綜述，魏蓮花 審校

1.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅蘭州730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州730000

金黃色葡萄球菌是人類最重要的病原體之一，屬革蘭陽性球菌，可引起皮膚和軟組織感染、骨髓炎、心內(nèi)膜炎、手術(shù)部位感染、肺炎及敗血癥等多種疾病，是引起醫(yī)院感染常見菌。全球抗生素耐藥性的出現(xiàn)對(duì)醫(yī)學(xué)產(chǎn)生了嚴(yán)重的威脅，近年來，隨著耐藥菌株的不斷增加，葡萄球菌感染的治療變得越來越困難。在美國，耐抗生素的患者至少200 萬人，每年造成2.3 萬名患者死亡。金黃色葡萄球菌耐藥菌株引起的感染已在全球范圍內(nèi)傳播和流行［1］，而耐藥病原體（如糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌）形成的對(duì)抗生素高度耐受的生物膜進(jìn)一步加重了病情，最終導(dǎo)致疾病的持續(xù)性及復(fù)發(fā)性感染［2］。1940年，先后發(fā)現(xiàn)抗金黃色葡萄球菌及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA），因此，迫切需要采用新作用機(jī)制的治療方法。而生物膜及持留菌的形成是導(dǎo)致金黃色葡萄球菌難治療的主要因素，目前，在防治金黃色葡萄球菌生物膜感染方面還處在體外及表觀研究階段，細(xì)菌感染治療的困難很大程度上是由于一小部分持留菌的存在。持留菌是一種耐藥細(xì)胞亞群，通常與慢性和復(fù)發(fā)性感染有關(guān)，持留菌最終恢復(fù)率＜1%［3］，這些細(xì)菌或是完全休眠的，或是選擇性滅活的，通常為抗生素的靶點(diǎn)，其表型變異具有短暫的抗生素耐受性，能夠承受廣泛的抗生素治療，當(dāng)抗生素壓力下降時(shí)，可恢復(fù)生長。金黃色葡萄球菌中的持留菌可通過多種抗生素刺激產(chǎn)生［4］。

本文對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的形成及調(diào)控、持留菌對(duì)生物膜的影響及兩者的相互關(guān)系作一簡(jiǎn)要綜述，并對(duì)未來治療潛在抗持留菌的方法進(jìn)行展望。

1 金黃色葡萄球菌生物膜形成及群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控因素

生物膜為高度結(jié)構(gòu)化的表面相關(guān)的微生物群落，被封閉在一個(gè)自我生產(chǎn)的保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)中［5］，其與抗微生物化合物耐藥性的增加有關(guān)，且較少受宿主免疫因子的影響。已知細(xì)菌生物膜能導(dǎo)致75%以上的人類被微生物感染［6］，因此，迫切需要抗菌藥物，不僅針對(duì)耐多藥的病原體，減少抗生素的使用及降低其副作用，而且要消除生物膜。幫助解決耐藥性問題的一項(xiàng)重要潛在戰(zhàn)略是發(fā)現(xiàn)和開發(fā)能部分或完全抑制細(xì)菌耐藥性機(jī)制的新型活性藥物。

葡萄球菌感染很難根除的原因是生物膜中的細(xì)胞對(duì)抗菌藥物具有高度耐藥性［7］。生物膜為一種多細(xì)胞的三維細(xì)菌集合體，嵌入由多糖、細(xì)胞外DNA、蛋白質(zhì)和（或）酯質(zhì)組成的基質(zhì)中［8］，是適應(yīng)環(huán)境壓力而形成的。金黃色葡萄球菌的生物膜由于能附著在活體組織及植入的醫(yī)療設(shè)備上（人工心臟瓣膜、導(dǎo)管、關(guān)節(jié)假體等），以及對(duì)抗生素固有的頑固性［9-10］，其相關(guān)的感染導(dǎo)致發(fā)病率、死亡率及醫(yī)療費(fèi)用的增加。生物膜相關(guān)的葡萄球菌感染廣泛存在，生物膜除提供一個(gè)環(huán)境生態(tài)位之外，還在慢性疾病的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，近年來用于治療細(xì)菌感染的抗菌藥物并不能根除生物膜。此外，細(xì)菌病原體適應(yīng)及耐受抗生素為臨床治療增加了難度。

群體感應(yīng)為一種細(xì)胞與細(xì)胞之間的交流機(jī)制，細(xì)菌利用該機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)以應(yīng)對(duì)細(xì)胞密度的變化。金黃色葡萄球菌群體感應(yīng)（quorum sensin，QS）系統(tǒng)在附屬基因的控制下監(jiān)管agr，agr 被認(rèn)為是毒力的主要調(diào)節(jié)因子，其通過調(diào)節(jié)大量毒力相關(guān)分泌產(chǎn)物（包括細(xì)胞溶酶、蛋白酶、酚溶調(diào)節(jié)素、脂肪酶和超抗原［11］）表面蛋白來控制生物膜的形成［12］。

2 持留菌對(duì)生物膜的影響

2． 1 持留菌的形成 持留菌為細(xì)菌種群中所占比例不到 0． 1%的一類特殊亞群，具有與種群內(nèi)普通菌及抗性突變菌所不同的特征，其形成機(jī)制復(fù)雜，不易分離培養(yǎng)。持留菌可通過“休眠-生長-增殖”應(yīng)對(duì)逆境的脅迫，維持自身生存及菌體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在生物膜的多藥耐受性及多金屬耐性中發(fā)揮著重要作用，對(duì)維持微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有重要意義。有研究證實(shí)，耐藥細(xì)胞在新鮮的不含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，可恢復(fù)對(duì)抗生素敏感的狀態(tài)，表明這些細(xì)胞不是突變體，而是具有可逆耐藥的持留菌［13］。

持留菌的形成通常與抗生素耐藥機(jī)制有關(guān)，歸因于接種條件、培養(yǎng)生長階段、抗生素的使用以及操作過程中的嚴(yán)格控制，這是一種既不生長也不死亡的細(xì)胞亞群［14］，在環(huán)境及生理變化的反應(yīng)中，有時(shí)是自發(fā)的，細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生不同類型的特定亞群，以更好地生存。持留菌具有暫時(shí)的耐抗生素表型，與公眾認(rèn)知的耐藥菌不同，其藥物作用的靶點(diǎn)未變異，僅是被抑制，處于休眠狀態(tài)。1944 年，BIGGER［15］在實(shí)驗(yàn)中無法用青霉素完全消除培養(yǎng)的葡萄球菌，在去除抗生素治療后，存活下來的持留菌重新接種到一個(gè)新的遺傳多樣性群體中，該群體與原始群體不同，耐藥性細(xì)胞的比例與在原始培養(yǎng)中觀察到的相同，結(jié)果表明，持留菌由于短暫的轉(zhuǎn)換而具有多藥耐受性。持留菌的形成最初被認(rèn)為是一個(gè)隨機(jī)過程，是由基因相同群體中單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的基因及蛋白表達(dá)水平的波動(dòng)引起的［16］，因此，持留菌被認(rèn)為是獨(dú)立于抗生素及其他環(huán)境信號(hào)的存在而形成的。持留菌通常是從靜止期培養(yǎng)物中分離出來的，這是一個(gè)主要的營養(yǎng)限制條件，被認(rèn)為是持留菌形成的主要觸發(fā)信號(hào)之一。隨后，LEWIS［17］及 FISHER 等［18］陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，在所有主要病原體中均有持留菌。BIGGER［15］認(rèn)為，在非治療期間，部分或間歇的滅菌可使存活下來的持留菌復(fù)蘇。綜上證據(jù)表明，持留菌為慢性感染頑固性的罪魁禍?zhǔn)祝渥璧K了有效的治療。

2． 2 持留菌與生物膜之間的聯(lián)系 持留菌在微生物中定義為隨機(jī)形成或?qū)毫Γò▽?duì)細(xì)菌的抗生素）作出反應(yīng)的常規(guī)細(xì)胞的休眠體。持留菌的形成可誘導(dǎo)細(xì)菌種群內(nèi)的非遺傳異質(zhì)性（尤其是“生物膜”），進(jìn)而可能有助于對(duì)環(huán)境變化的功能適應(yīng)［18］。有研究發(fā)現(xiàn)，在菌落生物膜培養(yǎng)過程中，這種持留菌的增強(qiáng)及其記憶效應(yīng)在其他細(xì)菌物種中或多或少是常見的，不僅適用于革蘭陰性菌（不動(dòng)桿菌及沙門菌），也適用于革蘭陽性菌（葡萄球菌和及芽孢桿菌）［4，17］。生物膜中的細(xì)菌細(xì)胞比浮游生物表現(xiàn)出更高的抗生素耐藥性［19］，該抗性與持留菌形成之間的關(guān)系已被證實(shí)。LEWIS［17］提出持留菌在生物膜耐受中可能發(fā)揮作用。LEVIN 等［20］提供了數(shù)學(xué)證據(jù)證明持留菌的存在確實(shí)會(huì)阻礙細(xì)菌感染的有效治療。多數(shù)與慢性或難以治療的感染相關(guān)的病原體中均存在持留菌，包括大腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、結(jié)核分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及真核白色念珠菌。持留菌通過生物膜基質(zhì)從物理上保護(hù)人類免疫系統(tǒng)，從而確保在抗生素治療停止時(shí)的生存。生物膜在細(xì)菌中可作為一種屏障保護(hù)持留菌在高濃度的抗生素環(huán)境中幸存，當(dāng)高濃度抗生素存在時(shí)，生物膜中游離的細(xì)胞均被殺死，而持留菌進(jìn)入休眠狀態(tài)，游離的持留菌被人體的自身免疫系統(tǒng)所清除，而存在于生物膜中的持留菌在生物膜的保護(hù)下逃逸免疫系統(tǒng)的攻擊，當(dāng)抗生素的壓力降低或環(huán)境再度適宜該持留菌時(shí)，即結(jié)束休眠并恢復(fù)生長［21］。在每一種病原體中均能發(fā)現(xiàn)持留菌，這有助于觀察抗生素在生物膜中的耐受性及其導(dǎo)致疾病的慢性感染性原因。因此，對(duì)持留菌細(xì)胞的有效治療可極大改善患者的預(yù)后。

在生物膜中，細(xì)菌可定位于營養(yǎng)有限的小環(huán)境，然后可能進(jìn)入一種暫時(shí)的生理狀態(tài)，使他們能夠耐受抗生素［17］。菌落生物膜培養(yǎng)對(duì)持留菌形成的促進(jìn)作用及由此產(chǎn)生的記憶效應(yīng)，在多種細(xì)菌中常見。有研究表明，菌落-生物膜培養(yǎng)后所形成的的持留菌細(xì)胞狀態(tài)至少可維持4 周［22］，已經(jīng)證明抗生素確實(shí)能穿透生物膜并在不殺死細(xì)菌的情況下到達(dá)細(xì)胞內(nèi)［23］。

2． 3 持留菌的根除 慢性持續(xù)性細(xì)菌感染是重要的臨床問題，多種細(xì)菌可引起持續(xù)性感染，包括結(jié)核分枝桿菌、沙門氏菌、衣原體、布魯氏菌、博氏菌、假單胞菌、致病性大腸埃希菌、葡萄球菌、鏈球菌［24］。如何找到有效的治療方案來根除頑固性細(xì)菌感染是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。一種方法是延長使用現(xiàn)有抗生素治療慢性感染的時(shí)間［25-26］，目前已提出對(duì)結(jié)核分枝桿菌及銅綠假單胞菌的固定培養(yǎng)物進(jìn)行消毒［27］。裂解性噬菌體已被證明可感染大腸埃希菌，當(dāng)細(xì)菌恢復(fù)生長時(shí)，這些噬菌體可裂解細(xì)菌，表明噬菌體療法可能是一種很有希望根除持留菌的策略［28］。另一種有效方法通過小分子化合物（化學(xué)文庫的篩選已確定了一些化合物）影響個(gè)體，迫使其恢復(fù)到抗生素敏感的狀態(tài)而起特定作用［29］，或通過影響種群的所有細(xì)菌細(xì)胞而起特定作用［30］。LEWIS［17］小組證明，一種小型化合物（酰基脫硫肽，ADEP4）可在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)箱培養(yǎng)生物膜及小鼠感染模型，從而有效殺死金黃色葡萄球菌。

3 小 結(jié)

本文總結(jié)了金黃色葡萄球菌的生物膜及持留菌的關(guān)系，對(duì)持留菌臨床重要性的普遍認(rèn)識(shí)有促進(jìn)作用，對(duì)持留菌的研究主要集中在其特定抗生素耐受方面，因此，抗生素暴露是解釋持留菌存在的一種方式。隨著對(duì)控制不同病原體持留菌機(jī)制了解的不斷深入，生物膜及持留菌的調(diào)控因素均可能是藥物潛在的靶點(diǎn)，從而為臨床更好治療復(fù)發(fā)性和難治性細(xì)菌感染提供理論依據(jù)，為臨床抗細(xì)菌治療提供方向。