關(guān)于新型冠狀病毒mRNA 疫苗臨床前藥學(xué)研發(fā)和評價的思考

趙欣，楊丹，金蘇

國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京100022

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）于 2019 年 12 月初在我國被發(fā)現(xiàn)，呈現(xiàn)出高傳染性及快速傳播的特點，并可導(dǎo)致一定比例患者出現(xiàn)重癥新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）。SARS-CoV-2 是一種與重癥急性呼吸道綜合癥冠狀病毒（SARS-CoV）關(guān)系密切的新型人類冠狀病毒［1-2］，已在世界范圍內(nèi)傳播并引發(fā)了全球性公共衛(wèi)生危機。SARS-CoV-2 引起的臨床表現(xiàn)包括無癥狀感染、輕度流感樣癥狀、肺炎、嚴(yán)重急性呼吸窘迫綜合征甚至死亡［3-4］。COVID-19 是一種新型人類疾病，尚無有效的治療方法，且SARSCoV-2 的保護(hù)性免疫程序目前仍尚不清楚，存在康復(fù)患者再次感染的可能性［5-7］。因此，研制安全有效的COVID-19 疫苗是防治SARS-CoV-2 的有效手段之一。

自COVID-19 疫情發(fā)生以來，我國疫苗研發(fā)及生產(chǎn)企業(yè)總體上采用滅活疫苗、重組蛋白疫苗、載體疫苗、減毒活疫苗、核酸疫苗共5 條技術(shù)路線進(jìn)行疫苗研發(fā)。mRNA 疫苗作為核酸類疫苗，憑借其自身特點，國內(nèi)外多家企業(yè)正積極進(jìn)行研發(fā)及申報。本文結(jié)合近年來國內(nèi)外mRNA 疫苗的發(fā)展趨勢及申報現(xiàn)狀，對SARS-CoV-2 mRNA 疫苗的技術(shù)特點進(jìn)行分析，結(jié)合審評實踐，著重就臨床前藥學(xué)研發(fā)和評價的一般考慮及評價要點展開探討，以期促進(jìn)此類藥物由研發(fā)順利轉(zhuǎn)入早期臨床試驗階段，并加強藥物研發(fā)的風(fēng)險控制。

1 mRNA 疫苗的概述

Jacob 和 Monod 在 1961 年提出 mRNA 的概念，1990 年 WOLFF 等［8］證明，將體外轉(zhuǎn)錄（in vitro transcribed IVT）mRNA 或質(zhì)粒DNA 直接注射至小鼠骨骼肌，可在注射的肌肉中表達(dá)其編碼蛋白。1995 年CONRY 等［9］首次將mRNA 作為疫苗進(jìn)行免疫測試。20 世紀(jì)90 年代，進(jìn)行了mRNA 疫苗多種臨床前應(yīng)用探索，包括癌癥mRNA 疫苗、傳染病mRNA 疫苗等［10-14］。隨著RNA 生物學(xué)、化學(xué)、穩(wěn)定性和遞送系統(tǒng)方面的技術(shù)進(jìn)步，克服了直接人體注射mRNA 免疫效果差、半衰期短的一系列障礙，加速了mRNA疫苗的發(fā)展［15-16］。

核酸疫苗包括 DNA 疫苗和 mRNA 疫苗［15］，mRNA 疫苗與其他核酸疫苗理論上的主要區(qū)別包括：mRNA 一旦到達(dá)細(xì)胞質(zhì)就會立即翻譯，不需進(jìn)入細(xì)胞核即可發(fā)揮功能；mRNA 不會整合至基因組中，不會造成插入突變的風(fēng)險；多數(shù)藥物應(yīng)用表明，mRNA 疫苗中mRNA 瞬時表達(dá)僅有短暫活性，通過人體的自然機制代謝和消除，因此被認(rèn)為是安全的；mRNA 的生產(chǎn)相對簡單、成本較低［16-17］。

2 mRNA 疫苗的研發(fā)進(jìn)展

陽離子聚合物和脂類具有將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞的能力，將其制成納米顆粒轉(zhuǎn)運mRNA，并進(jìn)行了廣泛的研究，結(jié)果表明，納米顆粒載體具有能穿過生物屏障、提高生物相容性和延長循環(huán)時間等優(yōu)點，能有效地將核酸傳遞至靶細(xì)胞，提高了核酸類藥物疾病治療的成功率，加速了mRNA 疫苗的發(fā)展。納米顆粒載體對mRNA 藥物的轉(zhuǎn)運效率很大程度上取決于其逃逸溶酶體的能力，即納米顆粒載體進(jìn)入細(xì)胞后，經(jīng)膜泡包被并傳遞進(jìn)入溶酶體，保護(hù)包裹mRNA 免受溶酶體降解及破壞，從溶酶體成功逃離至細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮藥效［18-19］。

香港大學(xué)袁國勇團隊報告了COVID-19 康復(fù)患者發(fā)生再次感染的第1 例病例，研究表明，盡管由于自然感染或接種疫苗產(chǎn)生了群體免疫力，但SARSCoV-2 可能持續(xù)在人群中傳播。對再次感染患者的進(jìn)一步研究將闡明對SARS-CoV-2 免疫保護(hù)的重要因素，對疫苗的設(shè)計、研發(fā)具有重要意義［6］。

綜上所述，mRNA 疫苗人體免疫的過程一定程度上模仿了病毒入侵過程，能激發(fā)人體細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。對于mRNA 疫苗的開發(fā)及質(zhì)量研究，在滿足常規(guī)納米制劑藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Critical Quality Attribute，CQA）前提下，還應(yīng)重點關(guān)注以下質(zhì)量研究的相關(guān)方面：制劑電荷（Zeta 電位）不僅影響納米顆粒的穩(wěn)定性，還會影響納米制劑的入胞、內(nèi)體逃逸以及不良反應(yīng)；mRNA 疫苗在生產(chǎn)過程中、終產(chǎn)品、穩(wěn)定性研究等不同階段納米顆粒粒徑分布的變化；制劑中陽離子聚合物及脂質(zhì)成分的選擇是為包裹mRNA 以達(dá)到相應(yīng)藥效，因此制劑的pH、脂質(zhì)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)、mRNA 包封率等，均會影響制劑成分與mRNA 復(fù)合形成納米顆粒的穩(wěn)定性、體內(nèi)藥物釋放、藥效等；mRNA 納米顆粒在體內(nèi)外表達(dá)及免疫原性相關(guān)研究，是非臨床質(zhì)量研究中對藥物有效性、安全性研究的重要技術(shù)支持。上述藥品CQA 不僅是mRNA 疫苗在人體內(nèi)發(fā)揮作用機制的關(guān)鍵影響因素，也是藥品研發(fā)及質(zhì)量研究的關(guān)注點。

在COVID-19 疫情爆發(fā)以前，mRNA 疫苗已在預(yù)防性疫苗和治療性腫瘤疫苗領(lǐng)域開展了多個臨床研究，其中進(jìn)展最快的尚在Ⅱ期臨床試驗階段［20-23］。

自COVID-19 疫情發(fā)生以來，國內(nèi)外多家企業(yè)正積極研發(fā)、申報SARS-CoV-2 mRNA 疫苗。國外已有兩家企業(yè)對SARS-CoV-2 mRNA 疫苗的臨床試驗情況進(jìn)行了相關(guān)報道。Moderna 公司候選疫苗mRNA-1273，采用脂質(zhì)納米顆粒包裹經(jīng)核酸修飾的SARSCoV-2 Spike 糖蛋白，Ⅰ期臨床試驗顯示，間隔28 d 2 次免疫后，抗體隨接種劑量及次數(shù)增高，不良事件包括疲勞、寒戰(zhàn)、頭痛、肌痛和注射部位疼痛［24］；BioNtech 公司候選疫苗BNT162b1，采用脂質(zhì)納米顆粒包裹SARS-CoV-2 三聚化Spike 糖蛋白受體結(jié)合區(qū)域（receptor-binding domain，RBD），Ⅰ／ Ⅱ期臨床中期試驗顯示，間隔21 d 2 次免疫后，血清中RBD 結(jié)合IgG 濃度和SARS-CoV-2 綜合抗體滴度隨接種劑量及次數(shù)增高，幾何平均綜合效價達(dá)到COVID-19 恢復(fù)期人血清的1.8 ～2.8 倍，局部及全身不良反應(yīng)呈劑量依賴性，一般是輕度到中度，并且是短暫的［17］。

國內(nèi)軍科院聯(lián)合蘇州艾博公司申報的SARSCoV-2 mRNA 疫苗ARCov 已獲批進(jìn)入臨床試驗，目前尚無相關(guān)臨床試驗數(shù)據(jù)的報道。臨床前研究表明，候選疫苗ARCoV 采用脂質(zhì)納米顆粒包裹SARSCoV-2 RBD，經(jīng)肌肉免疫小鼠和非人靈長類動物，可誘導(dǎo)SARS-CoV-2 中和抗體及偏向Th1 的細(xì)胞免疫反應(yīng)。在小鼠中接種2 劑ARCoV 可完全保護(hù)小鼠免受SARS-CoV-2 小鼠適應(yīng)株病毒的攻擊。ARCoV以液體配方制備，可在室溫下儲存至少1 周，目前正處于一期臨床試驗階段［25］。

3 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗申報臨床藥學(xué)研究一般原則及評價思考

SARS-CoV-2 mRNA 疫苗研發(fā)總體工藝路線為選取SARS-CoV-2 蛋白，制備體外轉(zhuǎn)錄mRNA，研發(fā)制劑組成、開發(fā)制劑工藝、以mRNA 原液制備納米顆粒，獲得終產(chǎn)品。

目前全球范圍內(nèi)尚無mRNA 疫苗批準(zhǔn)上市，對該類疫苗用于人體的安全性和有效性尚在探索中。同時，mRNA 疫苗創(chuàng)新程度較高，制劑工藝及成分相對復(fù)雜，綜合考慮疫苗應(yīng)用于健康人群，對其質(zhì)量和安全性也提出了較高的要求。對于SARS-CoV-2 mRNA 疫苗的開發(fā)和藥學(xué)技術(shù)審評，基本理念應(yīng)滿足疫苗產(chǎn)品的常規(guī)要求，此外，還應(yīng)結(jié)合本品mRNA分子結(jié)構(gòu)、制劑處方組成、作用機制的新特點以及不同于以往疫苗的生產(chǎn)工藝、質(zhì)量控制等方面，進(jìn)行相應(yīng)的研究。下面擬結(jié)合具體藥學(xué)評價實踐，對相關(guān)技術(shù)審評思考進(jìn)一步闡述。

3.1 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗研發(fā)風(fēng)險控制相關(guān)思考

ICH Q8 提出質(zhì)量源于設(shè)計（Quality by Design，QbD）的藥品質(zhì)量管理理念，即藥物開發(fā)的目的是設(shè)計出高質(zhì)量的產(chǎn)品，其制造過程始終如一的提供產(chǎn)品預(yù)期的性能。從藥物研發(fā)及生產(chǎn)中獲得的對產(chǎn)品的科學(xué)認(rèn)知及理解有助于建立設(shè)計空間及產(chǎn)品質(zhì)量控制體系［26］。

SARS-CoV-2 mRNA 疫苗藥學(xué)評價以風(fēng)險控制為核心，研發(fā)企業(yè)應(yīng)結(jié)合現(xiàn)有科學(xué)認(rèn)知及相關(guān)產(chǎn)業(yè)經(jīng)驗，在充分研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行產(chǎn)品設(shè)計及工藝開發(fā)，藥學(xué)研究應(yīng)明確潛在的目標(biāo)質(zhì)量概況（Quality Target Product Profile，QTTP）、CQA、有害雜質(zhì)等，SARS-CoV-2 mRNA 疫苗藥學(xué)評價風(fēng)險控制相關(guān)思考如下。

3.1.1 安全性風(fēng)險方面 可能來源于mRNA、脂質(zhì)納米顆粒（LNP）兩個方面，建議重點關(guān)注脂質(zhì)相關(guān)毒性?？蓮姆翘禺愋悦庖叻磻?yīng)、制劑及貯存期間產(chǎn)生的降解產(chǎn)物、陽性聚合物材料本身的安全性、各類雜質(zhì)累積的安全性風(fēng)險等方面進(jìn)行綜合考慮。

3.1.2 mRNA 方面 應(yīng)充分研究mRNA 修飾比例、poly A 加尾效率、加帽效率、去磷酸化程度、mRNA降解片段、mRNA 的完整性及序列的準(zhǔn)確性、dsRNA、mRNA 含量等。其中未加帽、磷酸化mRNA、dsRNA具有非特異免疫刺激作用，是免疫學(xué)方面重點關(guān)注的雜質(zhì)；mRNA 修飾具有兩面性，一方面增加mRNA的穩(wěn)定性，但也會增強mRNA 的非特異性免疫反應(yīng)；加帽率、poly A 長度、mRNA 完整性將可能影響產(chǎn)物的有效性。mRNA 加帽工藝、加帽結(jié)構(gòu)、加帽原材料雜質(zhì)、加帽mRNA 體內(nèi)外表達(dá)效率、體內(nèi)外免疫原性等方面也是藥學(xué)研究關(guān)注點。

3.1.3 脂質(zhì)納米顆粒CQA 除常規(guī)納米制劑的CQA 外，還應(yīng)重點關(guān)注：①電荷。zeta 電位不僅影響納米粒的穩(wěn)定性，還會影響納米制劑的入胞、內(nèi)體逃逸及不良反應(yīng)；②粒徑分布；③pH。制劑中含有陽離子聚合物，pH 會影響材料和mRNA 的復(fù)合；④納米顆粒對mRNA 的包封率；⑤包封后mRNA 的完整性、功能性及含量；⑥mRNA 釋放問題。

3.1.4 雜質(zhì)方面 質(zhì)量研究中的雜質(zhì)主要包括工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，對影響安全性的雜質(zhì)應(yīng)高度重視，對其進(jìn)行充分研究，包括相關(guān)雜質(zhì)的產(chǎn)生／引入、工藝去除、可監(jiān)測程度等。制劑相關(guān)雜質(zhì)應(yīng)重點關(guān)注：①聚正電荷材料相關(guān)雜質(zhì)，包括材料合成產(chǎn)生的雜質(zhì)及mRNA 復(fù)合過程中可能產(chǎn)生的雜質(zhì)；②不飽和脂質(zhì)的氧化及相關(guān)降解產(chǎn)物；③納米顆粒聚集產(chǎn)生的顆粒物也是潛在雜質(zhì)，應(yīng)基于實際情況來評估；④未組裝的脂質(zhì)分子、陽離子物質(zhì)、游離mRNA。未組裝的脂質(zhì)分子會影響LNP 的穩(wěn)定性；游離mRNA 易降解，同時也可能引起非特異免疫刺激，影響產(chǎn)品的安全有效性。

3.2 目標(biāo)抗原選擇及DNA 模板設(shè)計 目的抗原的選擇是mRNA 疫苗開發(fā)的基礎(chǔ)，需對選擇的抗原序列進(jìn)行較為充分的研究。明確目的抗原選擇的依據(jù)及其表達(dá)蛋白在預(yù)防SARS-CoV-2 中的作用機理，明確抗原序列載體構(gòu)建原件結(jié)構(gòu)，如帽子結(jié)構(gòu)、5′非翻譯區(qū)（Untranslated region，UTR）、編碼抗原蛋白的開放閱讀框（Open reading frame，ORF）、3′UTR、PolyA尾長度等，提供相應(yīng)的選擇依據(jù)及相關(guān)研究數(shù)據(jù)，需關(guān)注目的序列的優(yōu)化、核苷酸的化學(xué)修飾、表達(dá)效率、免疫原性、二級結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性等方面。

3.3 mRNA 疫苗遞送系統(tǒng)開發(fā) mRNA 遞送系統(tǒng)的應(yīng)用保證了mRNA 疫苗的免疫原性，由于使用陽離子聚合物、脂質(zhì)體等相關(guān)成分，在一定程度上增加了質(zhì)量控制的難度，因此，mRNA 疫苗遞送系統(tǒng)的開發(fā)為本產(chǎn)品的難點之一。

研發(fā)者應(yīng)對遞送系統(tǒng)的組成成分、配比等進(jìn)行篩選研究，提供遞送系統(tǒng)各組分的選擇依據(jù)、來源，對各組分生產(chǎn)工藝、特性鑒定、質(zhì)量控制、穩(wěn)定性、雜質(zhì)等進(jìn)行質(zhì)量研究，應(yīng)按照相應(yīng)法規(guī)和指導(dǎo)原則的要求提供申報資料。

由于國外相關(guān)企業(yè)對mRNA 疫苗研發(fā)多年，對相關(guān)技術(shù)進(jìn)行了專利申報，研發(fā)企業(yè)應(yīng)關(guān)注相應(yīng)專利申報情況，避免專利侵權(quán)。

3.4 生產(chǎn)工藝及質(zhì)量研究 工藝開發(fā)階段，應(yīng)進(jìn)行各步工藝參數(shù)對mRNA 和 ／ 或制劑質(zhì)量特性影響的研究；研發(fā)階段應(yīng)通過工藝參數(shù)的研究和優(yōu)化，確立mRNA 和／ 或制劑的生產(chǎn)工藝及工藝過程控制策略。

臨床樣品制備工藝應(yīng)具備一定規(guī)模，并且還應(yīng)具有一定的生產(chǎn)連續(xù)性和放大可行性，臨床樣品應(yīng)在符合GMP 的條件下生產(chǎn)。產(chǎn)品開發(fā)進(jìn)程中應(yīng)不斷積累數(shù)據(jù)，持續(xù)確認(rèn)工藝的一致性和可控程度。

mRNA 原液生產(chǎn)工藝應(yīng)關(guān)注生產(chǎn)工藝設(shè)置的合理性，對生產(chǎn)工藝開發(fā)及確定提供研究資料，原液生產(chǎn)工藝優(yōu)化應(yīng)提高產(chǎn)品純度及質(zhì)量。mRNA 原液質(zhì)量研究應(yīng)關(guān)注mRNA 序列完整性、加帽率、去磷酸化、Poly A 尾長度、純度、mRNA 序列生物活性表達(dá)、工藝相關(guān)雜質(zhì)的去除、產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)殘留等相關(guān)方面。

mRNA 疫苗納米顆粒生產(chǎn)工藝設(shè)備的選用應(yīng)考察現(xiàn)有制劑規(guī)模、放大能力、耗材使用次數(shù)、GMP符合情況等。納米顆粒質(zhì)量研究應(yīng)關(guān)注包封率、粒徑分布、納米粒的穩(wěn)定性、純度、不完整LNP、納米顆粒各成分含量、工藝相關(guān)雜質(zhì)的去除、免疫原性等相關(guān)方面。

3.5 佐劑 鑒于mRNA 遞送系統(tǒng)的復(fù)雜性及可能存在的佐劑作用，結(jié)合國內(nèi)外在研mRNA 遞送平臺的實際情況，目前不建議添加單獨的佐劑成分。如果需要添加佐劑，應(yīng)保證添加的佐劑不會引起不可接受的毒性。臨床前須通過明確的功能指標(biāo)及試驗研究證實佐劑發(fā)揮的具體的免疫調(diào)節(jié)作用，同時關(guān)注添加該佐劑成分后可能引入的風(fēng)險，如對mRNA結(jié)構(gòu)、非預(yù)期免疫反應(yīng)及免疫損傷和免疫病理等。使用佐劑所帶來的增強免疫應(yīng)答的潛在獲益必須超過其所帶來的風(fēng)險等。應(yīng)參照佐劑相關(guān)研究指南提交全套的佐劑藥學(xué)研究資料。

3.6 生物活性檢測 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗為新生事物，納米顆粒制劑組成及制備較為復(fù)雜，相應(yīng)研發(fā)候選疫苗均處于研發(fā)早期，細(xì)胞水平表達(dá)活性、體內(nèi)效力等綜合質(zhì)控指標(biāo)較為重要，在研發(fā)過程中需積累相關(guān)數(shù)據(jù)。

生物學(xué)活性檢測可采用體外或體內(nèi)檢測。研發(fā)早期階段建議根據(jù)質(zhì)量研究部分選擇適宜的方法建立體內(nèi)效力質(zhì)控檢測；必要時，根據(jù)產(chǎn)品的作用機理建立細(xì)胞免疫檢測活性的質(zhì)控檢測。由于生物學(xué)活性方法存在較大的變異性，建議設(shè)立參考疫苗以適宜的比值方法予以擬定標(biāo)準(zhǔn)限度。

3.7 研發(fā)期間的工藝變更 變更是維持產(chǎn)品生產(chǎn)工藝先進(jìn)性、提高產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)效率的重要手段。SARS-CoV-2 mRNA 疫苗在研發(fā)階段，尤其是研發(fā)早期，藥學(xué)變更往往不可避免。變更應(yīng)以持續(xù)提升產(chǎn)品的安全性、有效性和質(zhì)量可控性為原則，對研發(fā)產(chǎn)品進(jìn)行持續(xù)的質(zhì)量研究和趨勢分析，改進(jìn)生產(chǎn)工藝，提高生產(chǎn)過程控制能力，持續(xù)提升質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，提升中間產(chǎn)品和成品的質(zhì)量控制水平［27-28］。

鼓勵采用臨床試驗樣品的工藝代表性批次開展臨床前藥理毒理研究。如存在臨床前到臨床批次的藥學(xué)變更，需提供變更前后詳細(xì)的藥學(xué)對比信息并對變更后工藝進(jìn)行詳細(xì)描述、分析和風(fēng)險評估，應(yīng)提供相應(yīng)的可比性研究數(shù)據(jù)證明變更未對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。需提前進(jìn)行可比性研究的設(shè)計，對取樣批次、步驟、需要開展的檢測予以提前布局，尤其需關(guān)注各個研發(fā)階段的代表性留樣問題。

如質(zhì)量可比性分析研究不足以證實變更未對產(chǎn)品產(chǎn)生不利影響時，可能需要補充非臨床、甚至臨床研究數(shù)據(jù)，如免疫原性比較和必要的安全性比較等。鑒于mRNA 疫苗的復(fù)雜性及目前的有限認(rèn)知，對于臨床期間的重大變更，建議開展變更前后體液免疫、細(xì)胞免疫等全面的效力研究的比較分析。

4 結(jié) 語

SARS-CoV-2 自流行以來，我國已采取強有力的防控措施，并較好地控制了COVID-19 在我國的流行，但世界范圍內(nèi)COVID-19 的流行傳播仍未得到有效控制。目前尚無有效治療COVID-19 的方法，疫苗的開發(fā)及應(yīng)用對于COVID-19 的防治尤為重要。

目前全球范圍內(nèi)尚無mRNA 疫苗批準(zhǔn)上市，對該類疫苗用于人體的安全性和有效性尚在探索中。結(jié)合SARS-CoV-2 mRNA 疫苗國內(nèi)外申報情況及相關(guān)臨床試驗，對于這種新型疫苗開發(fā)模式，藥學(xué)研究應(yīng)充分考慮其作為“創(chuàng)新藥”的研發(fā)規(guī)律及技術(shù)特點，在保證臨床用藥足夠安全、有效和質(zhì)量可控性的前提下，應(yīng)對其進(jìn)行充分的風(fēng)險獲益評估，以評價其是否可進(jìn)入人體臨床試驗。相信在工業(yè)界創(chuàng)新驅(qū)動、技術(shù)研發(fā)不斷積累、對mRNA 疫苗藥學(xué)研究不斷深入的情況下，以及與監(jiān)管風(fēng)險管控的互動推進(jìn)下，未來將不斷有SARS-CoV-2 mRNA 疫苗獲批進(jìn)入臨床試驗以驗證其對人體的安全性和有效性。