龍牙百合組織培養(yǎng)技術(shù)體系的優(yōu)化

陳海霞 王登輝 王茯苓 王建國(guó)

摘? ? 要：為降低龍牙百合組培苗生產(chǎn)成本，本試驗(yàn)以其種球鱗片為外植體，研究誘導(dǎo)、不定芽增殖和生根階段的優(yōu)化技術(shù)方案。結(jié)果表明：百合鱗片上端為最佳外植體，不定芽誘導(dǎo)率最高;不定芽初代誘導(dǎo)培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA，分化率高達(dá)到93%，分化系數(shù)為7.43;不定芽增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA +0.1 mg·L-1 NAA，其增殖系數(shù)高達(dá)到6.7;瓶?jī)?nèi)生根培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為1/2MS++0.1 mg·L-1 NAA，其生根率達(dá)93.33%，瓶外生根培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，采用濃度為300 mg·L-1 NAA溶液處理后，在河沙基質(zhì)中生根率為100%，平均根系數(shù)量高達(dá)8.6 ，根長(zhǎng)達(dá)到5.2 cm。上述結(jié)果可為龍牙百合的快速和高效繁殖提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：龍牙百合;組織培養(yǎng);初代誘導(dǎo)培養(yǎng);增殖培養(yǎng);生根培養(yǎng)

中圖分類(lèi)號(hào)：S664.1? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.12.002

Optimization of Tissue Culture Technology System of Lilium brownii var. viridulum

CHEN Haixia1，WANG Denghui1，WANG Fuling1， WANG Jianguo2

（1.College of Horticulture， Hunan Agricultural University，Changsha， Hunan 410128， China; 2. The Planting professional cooperative of Bletilla in Hongjiang， Huaihua， Hunan 418100， China）

Abstract： In order to reduce the production cost of tissue culture seedlings of Lilium brownii var. viridulum， the experiment used bulb scales as explants，and the optimized technical schemes for different cultivation stages were studied. The results showed that the upper end of lily scales was the best explant， and its adventitious bud induction rate was the highest.The optimum medium formula for the primary induction culture of adventitious buds was MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA， which the differentiation rate was up to 93%， and the differentiation coefficient was 7.43.The optimum medium formula for adventitious bud proliferation culture was MS+1.0 mg·L-1 6-BA +0.1 mg·L-1NAA， and its proliferation coefficient was up to 6.7.The optimum medium formula for in-bottle rooting culture was 1/2MS+0.1 mg·L-1 NAA， and its rooting rate reached by 93.33%. When rooting culture outside the bottle，it was found that the rooting rate was 100%， the average growth root coefficient was up to 8.6， and the root length reached by 5.2 cm in the river sand substrate after treatment with 300 mg·L-1 NAA solution. These results could provide a reference for the rapid and efficient reproduction of Lily.

Key words： Lilium brownii var. viridulum; tissue culture; primary induction culture; proliferation culture; rooting culture

龍牙百合（Lilium brownii var. viridulum Baker）是百合科百合屬多年生草本球根植物，是我國(guó)人工栽培的三大食用百合之一，具有重要的食用、藥用和觀賞價(jià)值[1-2]，其鱗莖由二三十瓣重疊在一起，鱗片肥大呈披針形，因形似龍牙而得名[3]。湖南邵陽(yáng)、隆回縣以及江西萬(wàn)載縣為龍牙百合的主要產(chǎn)地。龍牙百合病毒病感染嚴(yán)重，多年的無(wú)性繁殖造成病毒病積累和品種退化，嚴(yán)重影響食用百合產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，近年來(lái)圍繞龍牙百合組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)開(kāi)展大量研究，并獲得無(wú)病毒苗。由于生產(chǎn)成本高，食用百合脫病毒技術(shù)尚未應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)中，本研究擬建立高效率低成本的組培繁育體系，推進(jìn)無(wú)病毒百合種苗的應(yīng)用。

組培苗生產(chǎn)成本的降低主要從培養(yǎng)基成分、多途徑節(jié)能降耗、組培過(guò)程自動(dòng)化、加強(qiáng)環(huán)境質(zhì)量等方面著手[4]。張春芬等[5]為降低草莓脫毒組培苗的生產(chǎn)成本，用白砂糖代替蔗糖，用卡拉膠代替瓊脂粉，總成本降為原來(lái)的32.5%。謝文申等[6]用淺層液體培養(yǎng)與固體培養(yǎng)基相比，可節(jié)約成本57.44%，同時(shí)減少大量用工。張恒[7]為降低草莓脫毒苗的生產(chǎn)成本，將傳統(tǒng)組織培養(yǎng)模式中壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)合并為壯苗生根一步，通過(guò)組培模式的改進(jìn)，每株草莓試管苗成本可降低31.9%。早在1994年，日本三菱重工開(kāi)發(fā)出針對(duì)百合的鱗莖繼代培養(yǎng)開(kāi)發(fā)自動(dòng)化作業(yè)系統(tǒng)，日本Kirin Brewery公司成功應(yīng)用叢生狀組培苗的自動(dòng)化系統(tǒng)[8]。

本試驗(yàn)開(kāi)展龍牙百合組織培養(yǎng)技術(shù)體系的優(yōu)化研究，以期為龍牙百合的產(chǎn)業(yè)化降低成本，促進(jìn)無(wú)毒百合苗產(chǎn)業(yè)的工廠化、規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為龍牙百合（Lilium brownii var. viridulum），2018年7月采集于湖南省懷化市洪江市白芨藥材種植專(zhuān)業(yè)合作社的龍牙百合生產(chǎn)基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒與選擇 以龍牙百合商品球?yàn)橥庵搀w，將種球從外至里剝下鱗片，均放在1 L的大燒杯中，自來(lái)水下流水沖洗泥土30 min，之后用蒸餾水洗10 min，再投入0.1%HgCl2中消毒10 min，用無(wú)菌水沖洗3～5次，每次沖洗5 min，最后使用滅菌的濾紙吸干鱗片表面的水分。將消毒的鱗片從中部切開(kāi)，分成上下兩段，并分別斜插至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，篩選適宜的外植體部品。

1.2.2 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中蔗糖30 g·L-1、瓊脂7 g·L-1，pH 5.8，加入不同濃度的6-BA及NAA溶液，設(shè)計(jì)了6種培養(yǎng)基，如表1所示。每個(gè)處理接種30瓶，每瓶2個(gè)外植體，3次重復(fù)。百合組培苗生長(zhǎng)的環(huán)境條件為每日16 h光/8 h暗培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1 500 lx，溫度為（26±2） ℃。30 d后統(tǒng)計(jì)分化率。誘導(dǎo)分化率（%）=分化數(shù)/外植體數(shù)×100;分化系數(shù)=不定芽分化總數(shù)/分化數(shù)。

1.2.3 不定芽增殖培養(yǎng) 經(jīng)初代培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化后，待不定芽高度達(dá)到1～2 cm時(shí)，將龍牙百合不定芽切割成單個(gè)的芽體，接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)?；九囵B(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中蔗糖30 g·L-1、瓊脂7 g·L-1，pH 5.8，加入不同濃度的6-BA及NAA溶液，設(shè)計(jì)了6種培養(yǎng)基，如表2所示。每個(gè)處理接種30瓶，每瓶2個(gè)不定芽，設(shè)3次重復(fù)，培養(yǎng)條件同1.2.2。30 d后統(tǒng)計(jì)增殖情況并做記錄。不定芽增殖系數(shù)=增殖芽體數(shù)/接種芽體數(shù)。

1.2.4 瓶?jī)?nèi)生根培養(yǎng) 待叢生芽高度生長(zhǎng)至3 cm時(shí)，將長(zhǎng)勢(shì)健壯的芽切下分成單個(gè)的小鱗莖，接種于不同NAA濃度的生根培養(yǎng)基上。每個(gè)處理接種30瓶，每瓶2個(gè)小鱗莖，3次重復(fù)，培養(yǎng)條件同1.2.2。30 d后統(tǒng)計(jì)生根率及生根系數(shù)?；九囵B(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA溶液，分別為0.1，0.2，0.3 mg·L-1 NAA，分別記為C1、C2和C3。

1.2.5 瓶外生根培養(yǎng) 瓶外生根法分別采用河沙和混合基質(zhì)（珍珠巖∶蛭石∶泥炭土=1∶1∶1），無(wú)根苗移栽前，用0.1%～0.2%高錳酸鉀溶液對(duì)基質(zhì)進(jìn)行消毒，種植時(shí)表面噴灑多菌靈溶液再次進(jìn)行消毒，覆膜保持適宜的濕度。當(dāng)無(wú)根苗鱗莖直徑大于1 cm時(shí)，置于無(wú)強(qiáng)烈直射光的煉苗室內(nèi)進(jìn)行煉苗。煉苗4 d后，將組培苗從瓶?jī)?nèi)取出，洗凈殘留的培養(yǎng)基，在不同濃度的NAA的溶液（表3）中浸泡15 s左右，移栽到基質(zhì)中。將其置于遮陰處，濕度控制在80%～90%，移栽溫度以20～25 ℃為宜。30 d后統(tǒng)計(jì)生根情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 21.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用單因素方差分析各處理差異以P<0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體對(duì)百合不定芽誘導(dǎo)的影響

由圖1-A～D可以看出，取材部位不同，不定芽的誘導(dǎo)率也不同。以上端鱗片為外植體，其不定芽的分化時(shí)間早，接種后10～20 d時(shí)，上端鱗片的不定芽生長(zhǎng)速度快，且不定芽分化數(shù)量也多;鱗片接種40 d時(shí)，上端鱗片的不定芽發(fā)育完成，數(shù)量多且生長(zhǎng)健壯，并開(kāi)始抽生新葉。由圖1-E～H可以看出，下端鱗片不定芽發(fā)育速度慢和數(shù)量少，抽生的新葉呈淡綠色，葉片纖細(xì)。在同一激素水平下，分析龍牙百合鱗片取材部位與不定芽的分化率和分化系數(shù)的關(guān)系，結(jié)果（表4）表明，龍牙百合上端鱗片的分化率達(dá)到90%，分化系數(shù)高達(dá)6.33，均大于下端鱗片。綜合說(shuō)明龍牙百合上端鱗片適合誘導(dǎo)培養(yǎng)。

2.2 激素對(duì)百合不定芽誘導(dǎo)的影響

激素種類(lèi)和濃度也影響不定芽的誘導(dǎo)，以2.1篩選的外植體在含不同濃度及其配比NAA和6-BA的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，結(jié)果如圖2所示。在培養(yǎng)基A2和A6中百合幼苗纖弱，不定芽形成幼葉很快，并在基部長(zhǎng)出新根;在A4和A5培養(yǎng)基中分化的不定芽數(shù)量最多，形成的小鱗莖鱗片肥厚，幼葉色澤濃綠。分析不同濃度及其配比的NAA和6-BA對(duì)龍牙百合不定芽的誘導(dǎo)效果有影響，結(jié)果（表5）表明，當(dāng)NAA激素濃度不變時(shí)，隨著6-BA濃度的升高，小鱗莖的分化率及分化系數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì);當(dāng)6-BA濃度不變時(shí)，高濃度的NAA更有利于不定芽的分化;A4培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)最高，分化率達(dá)到93%，分化系數(shù)為7.43，均顯著高于其他培養(yǎng)基。綜合說(shuō)明，A4（MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA）培養(yǎng)基更適合龍牙百合不定芽的誘導(dǎo)。

2.3 不同濃度激素對(duì)百合不定芽增殖的影響

如圖3所示，不定芽接種在增殖培養(yǎng)基上40 d時(shí)，不同濃度激素對(duì)不定芽的增殖的影響表現(xiàn)為：培養(yǎng)基B3、B4、B5和B6中不定芽數(shù)量多，長(zhǎng)勢(shì)旺盛;而B(niǎo)1和B2培養(yǎng)基中不定芽數(shù)量較少，葉色略有發(fā)黃;其中B3培養(yǎng)基中不定芽長(zhǎng)勢(shì)旺盛，葉片寬大。分析不同濃度6-BA與NAA對(duì)龍牙百合不定芽增殖率的影響，結(jié)果（表6）表明，在相同NAA水平下，隨著6-BA濃度的升高，不定芽增殖系數(shù)先增加再下降;當(dāng)6-BA濃度不變時(shí)，低濃度的NAA更有利于不定芽的增殖生長(zhǎng);其中B3培養(yǎng)基中龍牙百合不定芽的增殖系數(shù)最大為6.7，顯著高于除B1和B4外的其他培養(yǎng)基。綜合說(shuō)明，龍牙百合最佳增殖培養(yǎng)基為B3，即MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。2.4 不同濃度激素對(duì)百合生根培養(yǎng)的影響

2.4.1 瓶?jī)?nèi)生根 培養(yǎng)30 d后，不同培養(yǎng)基中百合組培苗根系生長(zhǎng)情況如圖4所示，C1培養(yǎng)基中試管苗葉片生長(zhǎng)粗壯且顏色翠綠，根系發(fā)達(dá)粗壯，數(shù)量多; C2培養(yǎng)基中百合根系較纖細(xì);C3培養(yǎng)基中百合根系生長(zhǎng)不整齊，顏色發(fā)黃。分析不同培養(yǎng)基龍牙百合的生根情況，結(jié)果（表7）表明，隨著培養(yǎng)基中NAA濃度的增加，百合生根數(shù)、株高及生根率均降低，根長(zhǎng)有增加趨勢(shì)。綜上說(shuō)明低濃度的NAA溶液（0.1 mg·L-1）有利于百合組培苗根系的生長(zhǎng)。

2.4.2 瓶外生根 以河沙為培養(yǎng)基質(zhì)時(shí)（圖5），隨著NAA溶液濃度的升高，百合根系的長(zhǎng)度和新根數(shù)量逐步增加，可見(jiàn)河沙基質(zhì)中NAA溶液有利于龍牙百合無(wú)根苗的瓶外生根培養(yǎng)。在混合基質(zhì)中（圖6），隨著NAA溶液濃度的升高，百合新根的數(shù)量與長(zhǎng)度在增長(zhǎng)。通過(guò)比較兩種基質(zhì)中試管苗的生長(zhǎng)情況可知，在河沙中新葉發(fā)生數(shù)量少，根系生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)且數(shù)量多;在混合基質(zhì)中，龍牙百合幼苗葉片數(shù)量多，且開(kāi)展，地上部分生長(zhǎng)速度明顯優(yōu)于地下部分。

分析基質(zhì)與激素對(duì)百合瓶外生根的影響，結(jié)果（表8）表明，以河沙為基質(zhì)，龍牙百合無(wú)根苗生根速度快、根系數(shù)量多且粗壯，其表現(xiàn)優(yōu)于混合基質(zhì);對(duì)無(wú)根苗進(jìn)行NAA預(yù)處理發(fā)現(xiàn)，龍牙百合幼苗的根系生長(zhǎng)情況與NAA濃度的增加成正比，發(fā)根數(shù)和新生根的長(zhǎng)度均呈上升趨勢(shì)，當(dāng)NAA濃度達(dá)到300 mg·L-1時(shí)，龍牙百合幼苗的根系最發(fā)達(dá)，根數(shù)為8.6條，根長(zhǎng)為5.2 cm。

3 結(jié)論與討論

3.1 外植體的類(lèi)型影響組培苗的生長(zhǎng)

在百合離體培養(yǎng)過(guò)程中外植體有鱗片、花器官、葉片、莖段、種子等，其中鱗片最常用。潘佑找等[9]以蘭州百合的鱗片、葉片、根的不同部位為外植體進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不同外植體分化能力存在差異，其差異由強(qiáng)到弱為：鱗片>根>葉片。羅鳳霞等[10]以新鐵炮百合葉片、花瓣、花絲、鱗片和種子為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)再生研究，結(jié)果表明分化能力：種子>鱗片>花絲>花瓣>葉片。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上選擇鱗片作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)，大大的降低了組培的污染率，提高了外植體誘導(dǎo)的成活率，減少了試驗(yàn)材料的浪費(fèi);同時(shí)，試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，以龍牙百合鱗片的上端為外植體時(shí)，誘導(dǎo)率高達(dá)到90%，分化系數(shù)高達(dá)6.33，比鱗片下端更優(yōu)，且分化時(shí)間短，不定芽生長(zhǎng)健壯。

3.2 植物激素影響百合組培苗的生長(zhǎng)

在百合的植物組織培養(yǎng)中，常用激素有NAA、2，4-D、IAA、IBA、BR、6-BA、KT、TDZ等。任峻和宋迎亞[11]研究表明，生長(zhǎng)素類(lèi)化學(xué)物質(zhì)（如NAA、2，4-D等）有利于植物愈傷組織的形成，而細(xì)胞分裂素類(lèi)化學(xué)物（6-BA、KT等）主要是促進(jìn)細(xì)胞分裂或不定芽的分化。目前大多數(shù)常用的6-BA的濃度為0.4～2.0 mg·L-1，NAA常用濃度為0.1～0.5 mg·L-1[12]。本試驗(yàn)將植物激素濃度設(shè)置在在常用濃度范圍內(nèi)，有利于不定芽的分化與增殖。通過(guò)不同激素配比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，龍牙百合初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1NAA對(duì)不定芽誘導(dǎo)效果最好，與唐東芹[13]的研究結(jié)果相似。龍牙百合不定芽增殖最佳培養(yǎng)基配方為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1 NAA，與龐新霞[14]的研究結(jié)果一致。當(dāng)6-BA濃度過(guò)高 （高于1.0 mg·L-1），芽增殖情況較差，且有大量愈傷組織出現(xiàn)，這與王剛等[15]試驗(yàn)結(jié)果一致。在瓶?jī)?nèi)生根培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)NAA溶液濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，百合根系的生長(zhǎng)情況最好，這與王宏梅[16]的研究結(jié)果相似，即鐵炮百合添加NAA的處理其生根率與平均生根條數(shù)比添加IAA、IBA的處理都要多， 且NAA濃度為0.1～0.2 mg·L-1時(shí)根系生長(zhǎng)情況好。

3.3 瓶外生根法降低組培苗的生產(chǎn)成本

瓶外生根法實(shí)質(zhì)就是將無(wú)根試管苗直接移植至適宜的基質(zhì)中培養(yǎng)。本試驗(yàn)分別采用了河沙基質(zhì)和混合基質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)河沙基質(zhì)的生根數(shù)量和根系長(zhǎng)度都優(yōu)于混合基質(zhì)。百合適合生長(zhǎng)在總孔隙度和通氣孔隙度大的土壤中，并且百合的根系屬于肉質(zhì)根，而沙質(zhì)土壤的透氣性、透水性都十分良好，十分適合龍牙百合根系的生長(zhǎng)?；旌匣|(zhì)的保水性很好，基質(zhì)的表層出現(xiàn)輕微板結(jié)現(xiàn)象，易造成鱗莖腐爛，地下部分無(wú)法呼吸，從而導(dǎo)致植物死亡，這與百合扦插繁殖試驗(yàn)結(jié)果[17]一致。本試驗(yàn)還采用NAA對(duì)龍牙百合進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果表明濃度為300 mg·L-1的NAA溶液，促進(jìn)龍牙百合的生根和根系生長(zhǎng)，這與藍(lán)莓組培苗瓶外生根試驗(yàn)結(jié)果[18]相似。組培苗瓶外生根技術(shù)已在藍(lán)莓、草莓、甘蔗、八仙花、牡丹、梔子和蝴蝶蘭等園藝植物上成功運(yùn)用[19]。有研究表明，瓶?jī)?nèi)生根法產(chǎn)生的單株試管苗生根成本比瓶外生根法產(chǎn)生的單株試管苗生根成本高51%[20]。究其原因是瓶?jī)?nèi)生根法操作環(huán)節(jié)多，對(duì)操作技術(shù)和環(huán)境要求高，且生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，占用室內(nèi)空間大，耗能大;而瓶外生根法操作簡(jiǎn)單，管理粗放。因此，瓶外生根法不僅有利于幼苗生長(zhǎng)，而且節(jié)省了人力物力，降低生產(chǎn)成本，促進(jìn)龍牙百合種苗高效、優(yōu)質(zhì)和低能耗生產(chǎn)。

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