白羽肉雞群中芙蓉沙門氏菌的分離鑒定

張開臣

摘? 要：本研究旨在通過調(diào)查山東省某白羽肉雞規(guī)?；B(yǎng)殖場的沙門氏菌感染和流行情況，為沙門氏菌病防控提供參考依據(jù)。采集該白羽肉雞群未出殼死胚樣品共60枚，進行沙門氏菌的分離與鑒定。結果顯示：從60個雞胚樣品中供分離到23株沙門氏菌，分離率為38.33%，分離菌株均為芙蓉沙門氏菌。

關鍵詞：沙門氏菌;芙蓉沙門氏菌;白羽肉雞;分離鑒定

沙門氏菌（Salmonella）是一種無宿主特異性的革蘭氏陰性菌，沙門氏菌感染家禽后會引起其發(fā)病死亡，給養(yǎng)殖場造成嚴重的經(jīng)濟損失[1]。目前，全世界范圍內(nèi)已知的沙門氏菌血清型超過3 000種，分屬不同的血清型，不同血清型沙門氏菌的鑒定具有流行病學意義[2]。沙門氏菌感染雞群不僅嚴重影響種蛋的孵化率、雛雞存活率和產(chǎn)蛋率，甚至造成人畜死亡[3]。因此，控制沙門氏菌在家禽和在食品中的污染對于獸醫(yī)公共衛(wèi)生和食品安全均具有重要的意義。

目前，我國常見的致病性沙門氏菌血清型主要包括雞白痢沙門氏菌、腸炎沙門氏菌及鼠傷寒沙門氏菌等多種血清型[2]，但目前國內(nèi)外對芙蓉沙門氏菌流行狀況的研究和調(diào)查資料很少。本研究應用白羽肉雞群未出殼的死胚，完成了沙門氏菌的分離鑒定，評估了白羽肉雞群中沙門氏菌的感染狀態(tài)，補充了白羽肉雞群沙門氏菌的流行病學資料，為今后芙蓉沙門氏菌的理論研究奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 試劑? 緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鹽煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、半固體營養(yǎng)瓊脂，均購自青島高科園海博生物技術有限公司;酵母提取粉、胰蛋白胨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉，均購自天際時開通化學試劑有限公司;瓊脂粉，購自北京索萊寶科技有限公司;瓊脂糖，購自南京生興生物科技有限公司;TAE緩沖液，購自北京康為世紀科技有限公司;2×Taq Master Mix，購自南京諾唯贊生物科技有限公司;DuRed核酸染料，購自北京泛博生物化學有限公司;沙門氏菌屬診斷血清，購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品的采集? 收集未出殼的死胚60枚，在無菌環(huán)境下取出肝臟、卵黃和部分腸道。在分離組織樣品操作過程中應注意避免樣品交叉污染，可用無菌鑷子夾取1 g左右新鮮雞胚樣品放于1.5 mL離心管內(nèi)，研磨混合后做好記錄并放于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 沙門氏菌的分離鑒定? 準確稱取0.5 g（mL）研磨碎后的樣品放入含有4.5 mL BPW的滅菌搖管中，反復吹打混勻，記錄編號，放入恒溫搖床中37 ℃、220 rpm/min培養(yǎng)大約8～12 h。輕搖混勻培養(yǎng)的菌液，轉移0.5 mL的液體分別至含有4.5 mL的SC培養(yǎng)基與TTB培養(yǎng)基的滅菌搖管中，然后放置于恒溫搖床中，37 ℃、220 rpm/min培養(yǎng)18～24 h。用無菌接種環(huán)分別蘸取TTB和SC的增菌液，利用三線法劃線接種于XLD瓊脂培養(yǎng)基， 置37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h。

在XLD培養(yǎng)基上小心挑取3～5個疑似沙門氏菌的黑色圓潤或無色透明、光滑單菌落，用500 μL LB液增菌4～6 h。根據(jù)張富友等[4]設計的引物進行PCR擴增，交由上海生工生物生物工程技術服務有限公司合成引物。擴增目的片段FimW基因的長度為495 bp，上下游引物分別為5'-AAC AGT CAC TTT GAG CAT GGG TT-3'和5'-GAG TGA CTT TGT CTG CTC TTC A-3'。反應程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃結束。PCR擴增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳后進行凝膠成像分析。

1.2.3? 沙門氏菌血清學分型? 利用沙門氏菌屬診斷血清試劑盒進行沙門氏菌血清型的鑒定，具體操作如下：取保存?zhèn)溆玫纳抽T氏菌菌液劃線接種于XLD固體培養(yǎng)基上，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h，蘸取可疑菌落繼續(xù)接種于半固體瓊脂平板上，放入恒溫培養(yǎng)箱37 ℃條件下培養(yǎng)16～24 h;選擇XLD固體培養(yǎng)基上的單個菌落進行O相血清凝集鑒定，首先在干凈的玻片上滴加5 μL O多價A～F群血清，再點取XLD固體培養(yǎng)基上的單個菌落與血清混合均勻，1 min后肉眼觀察并判斷結果，然后依次用O單因子血清進行凝集試驗，最終確定O抗原型。取無菌的生理鹽水與診斷血清混勻，以此作為陰性對照;挑取半固體瓊脂周邊擴散的鞭毛進行H相血清診斷，鑒定方法同上，確定鞭毛抗原;將本試驗的O相和H相結果與沙門氏菌的血清分型表進行比較分析，可以確定沙門氏菌的抗原類型以及其相應的血清型。沙門氏菌的血清型鑒定參考中華人民共和國國家標準GB/T 4789.4-2010：沙門氏菌檢驗標準。

2? 結果

2.1? 沙門氏菌的菌落形態(tài)與培養(yǎng)特性? 將所有陽性樣品進一步純化接種XLD培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后平板上呈現(xiàn)出黑色中心、光滑，外周有一圈透明帶的圓形菌落。

2.2? 沙門氏菌的分離鑒定? 用FimW引物進行PCR鑒定結果顯示：從60個未出殼死胚樣品中共分離到23株沙門氏菌，陽性檢出率為38.33%，見圖1。

2.3? 沙門氏菌血清分型? 血清分型試驗結果表明：23株沙門氏菌均為芙蓉沙門氏菌。

3? 討論

本研究對該白羽肉雞群死胚樣品進行沙門氏菌的流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)：60個未出殼死胚樣品中共分離到23株沙門氏菌，陽性檢出率為38.33%，高于范玉霞在2008年從青海省的養(yǎng)殖場死胚樣品中的分離率21.43%（9/42）[5]和張麗芳等人從四川某種雞場死胚樣品的檢出率15.38%（24/156）[6]，分離率高說明該雞群沙門氏菌污染情況較為嚴重，引起雞胚死亡的原因可能與沙門氏菌有關，但真正確定原因還需進一步的研究。

本研究分離得到的23株沙門氏菌，經(jīng)血清分型鑒定后均為芙蓉沙門氏菌。目前國內(nèi)只有呂素玲等在2012年報道禽肉中分離到1株芙蓉沙門氏菌[7]。本研究分離到的沙門氏菌分型鑒定結果，與宋艷2019年調(diào)查山東省部分養(yǎng)殖場沙門氏菌流行情況分離到的沙門氏菌血清型主要為雞白痢沙門氏菌和腸炎沙門氏菌[8]的結果明顯不同。美國2015年報道，70%的人感染沙門氏菌是由于禽類產(chǎn)品污染所致[9]，關于芙蓉沙門氏菌的致病性、毒力和耐藥性鮮為人知，具體等待進一步的研究。

參考文獻：

[1]? 傅宏慶，劉莉，姚志蘭，等.蘇北地區(qū)白羽肉雞父母代種雞及其商品雞中沙門氏菌的分離、鑒定與生物特性[J/OL].微生物學通報，2020.[2020-09-18].https：//doi.org/10.13344/j.microbiol.china.200631.

[2]? 蔣勇軍.肉雞鼠傷寒沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2014，30（11）：46-47.

[3]? 趙玉梅，范玉霞.肉雞死胚中沙門氏菌的分離及血清學鑒定[J].山東畜牧獸醫(yī)，2013，34（05）：1-3.

[4]? 張富友，宋艷，徐煜琳，等.禽沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基和PCR檢測方法的建立[J].山東畜牧獸醫(yī)，2019，40（10）：1-3.

[5]? 范玉霞.肉雞死胚中沙門氏菌的分離及血清學鑒定[J].四川畜牧獸醫(yī)，2008（08）：27-28.

[6]? 張麗芳，肖橋，羅薇.成都某種禽場雞胚沙門氏菌的檢測[J].中國畜牧獸醫(yī)，2015，42（6）：1571-1579

[7]? 呂素玲，韋程媛，姚雪婷，等.2010年廣西食品中沙門氏菌污染狀況和血清型分布及耐藥譜的研究[J].應用預防醫(yī)學，2012，18（03）：137-141+170

[8]? 宋艷.山東省部分種雞場死胚中沙門氏菌的鑒定及耐藥特性研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2020.

[9]? ANDINO A，HANNING I.Salmonella enterica： survival，colonization，and virulence differences among serovars[J].The scientific world journal，2015：1-16.

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