牡荊素調控M1/M2型巨噬細胞極化抗肺腺癌轉移的作用研究①

趙 蓓 殷亦男 王程燕 畢 凌 許 玲 焦麗靜

(上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院腫瘤一科，上海200437)

肺癌是世界上最常見的癌癥，在男性中占所有癌癥死亡人數24%，女性占23%[1]。隨著手術、化療、靶向治療等各種治療方案的應用，肺癌5年生存率有了很大的提高，但近90%的肺癌患者因癌細胞發(fā)生轉移而死亡[1，2]。不可避免的癌細胞轉移依然是肺癌整體治療所面臨的主要難題[3]。免疫應答是人體防御腫瘤的天然屏障，而免疫效應的失衡是腫瘤發(fā)生和進展的重要原因。巨噬細胞是一種非特異性免疫效應細胞，在人體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用，具有免疫監(jiān)視、免疫防御、免疫調節(jié)以及抗原呈遞等多種免疫功能[4]。腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage，TAMs)，是浸潤在腫瘤組織中的巨噬細胞，是腫瘤微環(huán)境中最多的免疫細胞[5]。有研究發(fā)現，TAMs能夠分泌細胞因子如腫瘤壞死因子α 和血管內皮生長因子A等促進腫瘤形成新的血管，從而促進腫瘤的轉移[6]。

牡荊素是一種廣泛存在于植物中的天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、止痛等生物活性，并且對食管癌、淋巴瘤等有著明顯的增殖抑制效果，在腫瘤治療上有著較好的應用前景[7-9]。在本項目組的前期研究中，牡荊素能夠抑制非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)A549細胞增殖、遷移及侵襲，并且能夠上調Caspase3、Caspase9、Bcl-2和Bax基因表達，具有多靶點的抗肺癌效應。在此基礎上，本研究進一步探討牡荊素多靶點抗肺癌的機制，推動牡荊素在NSCLC中的應用。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠單核巨噬細胞株(RAW264.7細胞)，A549細胞株購自中國科學院上海細胞庫，支原體檢測陰性。中藥單體牡荊素(詩丹德生物技術公司)；脂多糖(LPS，Sigma)；IL-4(PeproTech)；PE anti-mouseCD206(Biolegend)；pSTAT3(Abcam)；RNA提取試劑，結晶紫染料(美國Sigma公司)；CCK8試劑盒(同仁化學研究所)；Transwell小室(美國Corning公司)；Perfect real time-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；SYBR Green RCR Kit(QuantiNova公司)；PCR引物設計和合成(生工生物工程有限公司)；DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清(美國Gibco公司)；Griess試劑盒(上海碧云天)。

1.2方法

1.2.1RAW264.7細胞的培養(yǎng) 用完全培養(yǎng)基(含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基)在37℃、 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)RAW264.7細胞，每日更換培養(yǎng)基，待細胞生長到80%左右傳代。

1.2.2A549細胞的培養(yǎng) 用完全培養(yǎng)基(含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基)在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549細胞，隔日更換培養(yǎng)基，待細胞生長到80%左右傳代。

1.2.3CCK8檢測牡荊素對RAW264.7細胞活力的影響 取對數生長期的RAW264.7細胞，按照每孔100 μl(密度為5×104個/ml)接種到96孔板，每組3個復孔。除空白對照組外，設置不同的給藥濃度組(200、100、50、25、12.5 μmol/L)，培養(yǎng)24 h。隨后，每孔加入10 μl的CCK8試劑避光孵育1.5 h，利用酶標儀于OD450nm波長處檢測各孔的吸光度A。細胞活力計算公式為：細胞活力(%)=各濃度給藥組的A/空白組的平均A×100%。

1.2.4Real-time PCR法觀察牡荊素對細胞內iNOS、IL-1β、Arg-1、MR基因表達的影響 RAW264.7細胞培養(yǎng)于6孔板，設置空白對照組、M1模型組、M2模型組、M1模型牡荊素干預組、M2模型牡荊素干預組(25、50、100 μmol/L)，貼壁生長過夜。M1模型組和M1模型牡荊素組加入LPS，處理24 h后收集各組RNA樣品。M2模型組和M2牡荊素干預組加入IL-4(20 ng/ml)，協(xié)同刺激細胞，收集24 h各種的RNA樣品。用Trizol提取方法細胞總的RNA，用Perfect Real Time試劑盒逆轉錄提取總cDNA，反應體系37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存，后用RT-PCR進行檢測。PCR反應條件：95℃ 2 min，95℃ 5 s，60℃ 10 s，共40個循環(huán)。重復3次，β-肌動蛋白(β-actin) 作為內標基因。使用2-ΔΔCt法計算mRNA含量。

表1 檢測基因的引物序列

1.2.5Griess法測定RAW264.7細胞中NO含量 RAW264.7細胞以5×103個/孔接種于96孔板中，貼壁生長過夜，無血清培養(yǎng)24 h。分別設置空白對照組、M1模型組、給藥組，空白對照組不給予任何處理，M1模型組和給藥組采用LPS(500 μg/L)協(xié)同刺激細胞，同時牡荊素以25、50、100 μmol/L劑量處理給藥組。24 h后吸取上清液50 μl加入新的96孔板中，加入等量的Griess反應試劑，反應時間為10 min，在540 nm下讀數，計算細胞上清液中NO含量。

1.2.6Transwell小室遷移實驗觀察巨噬細胞誘導M2型巨噬細胞前后對肺腺癌A549細胞的遷移能力及牡荊素干預的影響 處于對數生長期的RAW264.7細胞以1×106個/孔培養(yǎng)于24孔板中，分別設置M2模型組和牡荊素組采用IL-4(20 μg/L)刺激細胞，同時牡荊素組以25、50、100 μmol/L劑量處理細胞，24 h后收集上清液，各取600 μl置于24孔板下室，放入Transwell小室，在Transwell小室上室加入無血清培養(yǎng)基調整密度為5×105個/ml的A549細胞，體積均為100 μl，作用24 h后，用4%多聚甲醛固定30 min，0.5%結晶紫染色30 min，水漂洗后用棉簽輕輕拭去Transwell小室上層未遷移的細胞，200倍顯微鏡下隨機5個視野觀察細胞并計數。

1.2.7流式細胞術檢測牡荊素對于巨噬細胞M2型的抑制作用 RAW264.7細胞分組同1.2.4，24 h后收集細胞，用預冷的PBS沖洗2遍，PBS重懸細胞，調整細胞濃度為1×107個/ml，取100 μl到流式管中，加入PE 抗鼠CD206抗體以及IgG2a的同型對照組，4℃避光孵育20 min；1 000 r/min離心5 min，收集細胞，棄上清，再加入200 μl PBS，Cytoflex流式細胞儀檢測。用Cytoflex軟件分析結果。

1.2.8Western blot和RT-PCR法考察牡荊素對蛋白的影響 細胞分組同1.2.4，24 h后，用冰PBS洗滌，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液后收集細胞，放置冰上30 min，離心(12 000 r/min，15 min，4℃)，取蛋白上清液進行蛋白測定。每孔加入 20 μg的蛋白上樣，80 V恒壓電泳30 min，再轉為120 V恒壓電泳分離蛋白，經200 mA恒流轉膜2 h，用5%脫脂牛奶封閉液常溫下封閉1 h，PBS洗滌3次，每次10 min，再加入p-STAT3和GAPDH抗體，置4℃孵育過夜(抗體稀釋比例1∶1 000)，用TBST洗滌3次，每次10 min，再加入二抗(1∶10 000)室溫下孵育1.5 h，再洗滌3次，曝光。

2 結果

2.1牡荊素對RAW264.7細胞活力的影響 不同濃度牡荊素作用于巨噬細胞，CCK8結果顯示，牡荊素25、50、100 μmol/L濃度時對靜息狀態(tài)下的巨噬細胞無明顯的細胞毒性，因此選用25、50、100 μmol/L用于后續(xù)的實驗，如圖1。

2.2牡荊素對不同表型細胞內iNOS、IL-1β、Arg-1、MR基因表達的影響 正常狀態(tài)下，iNOS、IL-1β、Arg-1、MR基因在巨噬細胞中呈低表達，經LPS誘導刺激后iNOS和 IL-1β的表達均顯著升高；與M1組相比，牡荊素在25、50、100 μmol/L濃度下可明顯抑制M1表型相關基因iNOS和IL-1β的表達，且呈濃度依賴性。而IL-4可誘導M2組中的Arg-1和 MR的表達上升，牡荊素可呈濃度依賴下調Arg-1和MR的基因表達，如圖2。

2.3牡荊素對LPS誘導下RAW264.7細胞分泌NO的影響 與靜息狀態(tài)下的巨噬細胞相比，經LPS干預后的RAW264.7細胞上清液中NO明顯升高；與M1組相比，加入25、50、100 μmol/L的牡荊素均可抑制NO的釋放量，且隨著濃度的增高，NO的釋放量越低，如圖3。

2.4牡荊素對IL-4誘導M2型巨噬細胞對肺癌A549的遷移能力變化 與空白對照組比較，經IL-4誘導的M2型巨噬細胞上清液可顯著增強 NSCLCA549體外遷移能力；而牡荊素低、中、高三個劑量干預組的細胞上清液能夠顯著抑制M2型A549細胞遷移，圖4。

圖1 牡荊素對巨噬細胞的細胞活力的影響Fig.1 Effect of vitexin on cell viability of macrophagesNote:Compared with control group,△△.P<0.01.

2.5牡荊素對IL-4誘導M2型巨噬細胞表型CD206的變化 靜息狀態(tài)下的巨噬細胞CD206表型不明顯，經過IL-4誘導的M2型巨噬細胞顯著提升了巨噬細胞表型CD206的表達；而牡荊素可以明顯抑制M2型巨噬細胞CD206的表達，并且存在濃度依賴性，圖5。

2.6牡荊素對IL-4誘導M2型巨噬細胞IL-4/STAT3通路的影響 在正常的巨噬細胞中，STAT3蛋白磷酸化水平低表達，經刺激劑IL-4激活后巨噬細胞磷酸化水平顯著提高。牡荊素低劑量和高劑量均能夠顯著降低STAT3的磷酸化水平，呈劑量依賴性，圖6。

圖2 牡荊素對 M1/M2型巨噬細胞中IL-1β、iNOS、MR和Arg-1的mRNA表達的影響 Fig.2 Effects of vitexin on mRNA expression of IL-1β,iNOS,MR and Arg-1 in M1/M2 macrophagesNote:Compared with control group,△△△.P<0.01； compared with M1 group，*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001；compared with M2 group，#.P<0.05,##.P<0.01,###.P<0.001.

圖3 牡荊素對M1型巨噬細胞上清液中NO含量的影響Fig.3 Effect of vitexin on NO content in supernatant of M1 macrophageNote:Compared with M1 group,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖4 M2型巨噬細胞對非小細胞肺癌A549細胞的體外遷移及牡荊素干預的影響(×200)

圖5 牡荊素對M2型巨噬細胞CD206表型的影響

圖6 牡荊素對M2型巨噬細胞STAT3蛋白磷酸化水平的影響Fig.6 Effect of vitexin on phosphorylation of STAT3 protein in M2 macrophageNote:Compared with control group,△△△.P<0.001;compared with M2 group,##.P<0.01,###.P<0.001.

3 討論

肺癌作為全球人類死亡的重要原因，給人類健康造成沉重負擔，并給臨床醫(yī)生和患者帶來重大的挑戰(zhàn)[1]。NSCLC是肺癌的一種亞型，約占肺癌的85%～90%，是癌癥死亡最常見的類型[10]。目前在NSCLC治療中已經引入一些新的治療方法，如免疫治療、靶向治療[11]。巨噬細胞是炎癥效應細胞和宿主防御腫瘤，巨噬細胞在腫瘤中具有豐富的表達[6]。但是與其他細胞不同，巨噬細胞存在著高度異質，可以通過局部微環(huán)境刺激從M0階段極化到不同的亞型即M1和M2，顯示完全相反的功能[12，13]。

巨噬細胞的極化現象在腫瘤發(fā)展中廣泛存在，M1型巨噬細胞通過分泌促炎因子和趨化因子參與機體的炎癥反應，M2型巨噬細胞則是分泌抑制細胞炎癥的因子，抑制炎癥，降低機體免疫反應，促進腫瘤的轉移[14，15]。其極化調節(jié)主要是通過一些核內信號蛋白發(fā)揮作用[16]。M1型巨噬細胞被IFN-γ、LPS或TNF-α激活，使IL-1β和iNOS在M1型巨噬細胞中高表達。其中iNOS是一氧化氮合酶(NOS)的一種，細胞中的NOS以L-精氨酸為底物，生成大量的NO，誘導致炎信號通路，過度的炎癥則對機體造成一定的損傷[17，18]。牡荊素濃度低于200 μmol/L，可以下調M1型巨噬細胞iNOS和IL-1β細胞因子mRNA的水平，并且顯著抑制M1型巨噬細胞中NO，抑制炎癥反應。M2型巨噬細胞由IL-4和IL-13誘導，特異性表達Arg-1和甘露糖(MR，CD206)。而Arg-1是M2型巨噬細胞的標記物，它將L-精氨酸水解成尿素和鳥氨酸，并通過與iNOS競爭共同底物L-精氨酸來抑制NO介導途徑，給腫瘤細胞提供營養(yǎng)，協(xié)助腫瘤的遠端轉移和免疫逃逸[19，20]。M2型巨噬細胞能夠調節(jié)炎癥反應和適應性Th2免疫，主要發(fā)揮免疫抑制作用[21]，通過調節(jié)免疫應答，驅動腫瘤的生長和促進腫瘤微血管系統(tǒng)的形成[22]。CD206是M2型巨噬細胞特異性標志物，高表達能夠促進腫瘤細胞的轉移[23]。TAMs大多是M2型巨噬細胞，促進腫瘤轉移，侵襲和免疫逃逸，其數量與多種腫瘤預后呈負相關[24]。所以阻斷巨噬細胞的M2型極化是抑制腫瘤進展的一個重要的策略。

黃酮類藥物具有抗炎的生物活性，能夠顯著抑制LPS誘導M1型巨噬細胞的炎癥介質，能夠調節(jié)M2型巨噬細胞的極化[25-27]。牡荊素具有低細胞毒性，能夠通過LPS激活RAW264.7，降低TNF-α、IL-1β、NO、PGE2的釋放，促進IL-10釋放，同時還能夠調節(jié)促炎介質的轉錄因子，降低LPS誘導細胞中pP38、p-ERK1/2和p-JNK的表達[28]。但是牡荊素對于M2型巨噬細胞的生物作用尚缺少深入研究，本研究通過研究牡荊素對小鼠巨噬細胞極化的影響發(fā)現，牡荊素可以抑制IL-4誘導的M2型標志物MR、Arg-1和CD206的表達，發(fā)揮M2型極化抑制的作用。據文獻報道，JAK/STAT3信號通路在多種腫瘤細胞系中均有異常，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要的作用。在正常組織中，STAT3信號處于失活狀態(tài)，而在腫瘤細胞中過度活化[29]。在巨噬細胞靜息的狀態(tài)下，STAT3信號通路并不活化，IL-4能夠激活STAT3信號的通路。文獻報道，天然產物成分可以通過抑制STAT3的激活來抑制腫瘤細胞增殖和巨噬細胞向M2表型極化的進程[30]。本研究發(fā)現牡荊素可以降低STAT3蛋白的磷酸化水平，使得IL-4/STAT3信號通路失活，從而影響巨噬細胞M2型的極化。

綜上，牡荊素調節(jié)M1型巨噬細胞iNOS、IL-1β的基因表達；牡荊素通過抑制STAT3信號通路活化，影響M2型巨噬細胞Arg-1、MR和CD206的表達，減弱M2表型促非小細胞肺癌的體外轉移的能力，最終發(fā)揮抗肺癌的作用。