PD-1基因的表達(dá)調(diào)控分子機(jī)制研究進(jìn)展①

徐若楠 孫國(guó)鵬 何海汛 王選年

(新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究中心，新鄉(xiāng)453003)

程序性死亡因子-1(programmed cell death protein 1,PD-1)是由Pdcd1基因編碼的一種具有誘導(dǎo)表達(dá)模式的免疫調(diào)節(jié)受體，主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面[1]。作為調(diào)節(jié)或平衡機(jī)體外周及中樞免疫系統(tǒng)功能的重要分子，PD-1的過量表達(dá)與自身免疫性疾病、慢性病毒感染疾病，以及腫瘤等因素所導(dǎo)致的機(jī)體免疫耐受和免疫細(xì)胞功能耗竭密切相關(guān)[2-11]。PD-1的表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)調(diào)控過程，受到抗原信號(hào)刺激持續(xù)時(shí)間、炎癥環(huán)境、細(xì)胞種類及分化階段等多種因素影響。在正常生理?xiàng)l件下，PD-1僅以極低的基礎(chǔ)水平表達(dá)于未分化成熟的T細(xì)胞表面[12,13]。當(dāng)初始免疫激活TCR信號(hào)后，PD-1可在包括CD4+和CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等多種類型免疫細(xì)胞表面短暫上調(diào)表達(dá)[8，13-16]。如果初始免疫是被急性病毒(抗原)所激活，PD-1會(huì)隨著抗原在體內(nèi)的逐步清除而同時(shí)或提前被下調(diào)至正常生理水平。相反，在慢性病毒感染過程中，抗原的持續(xù)性刺激，以及炎癥環(huán)境等因素使PD-1始終維持較高水平的表達(dá)，最終可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受和免疫細(xì)胞功能耗竭[4,6,11,17,18]。阻斷PD-1與其配體的相互作用，則可在一定程度上使耗竭T細(xì)胞的免疫功能得到部分逆轉(zhuǎn)或恢復(fù)[19-26]。目前，PD-1阻斷療法的商品化制劑如Nivolumab等已成功應(yīng)用于包括黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌等多種晚期癌癥的抗腫瘤免疫治療[27-29]。然而，此種療法對(duì)于其他腫瘤類型，以及HIV、HBV和HCV等慢性病毒感染所導(dǎo)致的免疫耐受或免疫細(xì)胞功能耗竭方面的治療效果并不理想，其應(yīng)用仍存在較大的局限性。本文從PD-1表達(dá)調(diào)控入手，圍繞著順式作用元件、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及相關(guān)信號(hào)通路、表觀遺傳因素、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等幾個(gè)方面對(duì)相關(guān)研究的已有進(jìn)展情況進(jìn)行綜述，探討PD-1在不同條件下的表達(dá)特征及其表達(dá)調(diào)控的相關(guān)分子機(jī)制。以期進(jìn)一步深入理解PD-1表達(dá)的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為更精確、有效調(diào)控PD-1表達(dá)的新型免疫檢查點(diǎn)療法或治療方案的設(shè)計(jì)提供新的信息和思路。

1 Pdcd1基因表達(dá)調(diào)控的作用元件

基因在轉(zhuǎn)錄水平上受到啟動(dòng)子(Promoter)、增強(qiáng)子(Enhancer)、基因座控制區(qū)(Locus control regions)和邊界元件(Boundary elements)等多種元件的復(fù)雜調(diào)控作用。2008年，Oestreich等[30]在分析編碼PD-1的Pdcd1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start site,TSS)上游(-1.2～-0.1 kb)保守區(qū)域(conserved regions,CR)時(shí)，首先發(fā)現(xiàn)了兩段與Pdcd1轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)的兩個(gè)保守調(diào)控區(qū)域(CR-B和CR-C)。隨著相關(guān)研究的逐漸開展，在T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的CR-B和CR-C兩個(gè)區(qū)域內(nèi)及遠(yuǎn)端至少已發(fā)現(xiàn)10個(gè)與PD-1表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)的作用元件，見表1。其中，負(fù)向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子T-bet結(jié)合位點(diǎn)和激活蛋白1(activator protein 1,AP-1)結(jié)合位點(diǎn)分別定位于CR-B和CR-C區(qū)域內(nèi)[31,32]。相較而言，距TSS較遠(yuǎn)的CR-C區(qū)域內(nèi)調(diào)控Pdcd1轉(zhuǎn)錄的元件則更為集中和多樣，其中包括干擾素刺激應(yīng)答元件(IFN-stimulated response element,ISRE)、活化T-細(xì)胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1)結(jié)合位點(diǎn)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(forkhead box protein O1,FoxO1)結(jié)合位點(diǎn)、核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)結(jié)合位點(diǎn)[14，15，30,33,34]。值得注意的是，利用熒光素酶報(bào)告基因分析技術(shù)對(duì)CR-B和CR-C啟動(dòng)子活性比較結(jié)果表明，在缺少CR-C的情況下，各種刺激條件均無法誘導(dǎo)PD-1的表達(dá)發(fā)生變化，CR-C對(duì)Pdcd1基因的表達(dá)調(diào)控可能具有更為重要的作用及意義[15,30]。

在CR-B和CR-C這兩個(gè)與Pdcd1轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)主要調(diào)控區(qū)域之外，也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些與PD-1表達(dá)調(diào)控相關(guān)的作用元件。定位于CR-B和CR-C(-786～-775 bp)之間的B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白-1(B lymphocyte induced maturation protein-1,Blimp-1)結(jié)合位點(diǎn)，通過與Blimp-1的結(jié)合可以顯著抑制CD8+T細(xì)胞PD-1的上調(diào)表達(dá)，直接參與Pdcd1轉(zhuǎn)錄調(diào)控[35,36]。在激活的CD8+T細(xì)胞中，Notch信號(hào)通路相關(guān)的重組信號(hào)結(jié)合蛋白(recombination signal binding protein-Jk,RBPJk)可通過與位于CR-C上游(-1960～-1950 bp)的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，激活Pdcd1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[37]。另外，在Pdcd1基因TTS的5′和3′遠(yuǎn)端位于-3.7 kb和+17.1 kb附近存在編碼NFATc1和信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription,STATs)結(jié)合位點(diǎn)序列，并發(fā)現(xiàn)其可在TCR和IL-6或IL-12刺激后，通過與NFATc1和STAT3(或STAT4)的結(jié)合直接調(diào)控PD-1在激活CD8+T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[38]。與上述已鑒定元件調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的方式有所不同，位于Pdcd1兩側(cè)(-25.7 kb和+17.5 kb)的兩個(gè)CCCTC結(jié)合因子(CCCTC binding factor,CTCF)結(jié)合位點(diǎn)在NFAT刺激下分別結(jié)合相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子(CTCF)，形成并增強(qiáng)CTCF-CTCF的相互作用，從而改變被調(diào)控基因的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，使位于Pdcd1啟動(dòng)子區(qū)域中具有調(diào)控潛能的元件集中，并結(jié)合在一起形成長(zhǎng)期的相互作用，進(jìn)而控制基因的表達(dá)[38]。

表1 已鑒定的Pdcd1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)元件

2 Pdcd1基因表達(dá)的調(diào)控因子及相關(guān)信號(hào)通路

參與Pdcd1基因表達(dá)的相關(guān)調(diào)控因子及信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，會(huì)根據(jù)免疫細(xì)胞種類、細(xì)胞激活情況及分化階段，甚至抗原(病原)種類的不同而有所差異。PD-1作為調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫功能的重要負(fù)調(diào)節(jié)因子，其在CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)與TCR信號(hào)通路的強(qiáng)度和持續(xù)性具有極為密切的正向關(guān)聯(lián)性[4，13,39-41]。TCR信號(hào)通過介導(dǎo)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路(Calcineurin pathway)激活啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使轉(zhuǎn)錄因子NFATc1活化并移位與CR-C區(qū)域內(nèi)對(duì)應(yīng)元件結(jié)合啟動(dòng)PD-1轉(zhuǎn)錄，且Calcineurin或NFATc1特異性抑制劑能夠顯著降低PD-1在CD8+T細(xì)胞中的上調(diào)表達(dá)，TCR/Calcineurin/NFATc1很可能是激活抗原特異性T細(xì)胞PD-1轉(zhuǎn)錄表達(dá)的主要起始上游信號(hào)通路之一[30]。除了通過TCR/Calcineurin/NFATc1通路介導(dǎo)直接調(diào)控PD-1轉(zhuǎn)錄之外，激活的CD8+T細(xì)胞在IL-6或IL-12刺激的條件下，NFATc1與STAT3(IL-6)或STAT4(IL-12)也可共同結(jié)合至位于Pdcd1基因TTS -3.7 kb和+17.1 kb的調(diào)控元件上激活PD-1的轉(zhuǎn)錄，且NFATc1在此區(qū)域的結(jié)合對(duì)于STAT3或STAT4調(diào)控PD-1上調(diào)表達(dá)是必要條件之一[38]。值得注意的是，PD-1在TCR信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子NFATc1介導(dǎo)下的上調(diào)表達(dá)微弱且短暫，正常生理情況下其在體內(nèi)外激活1周后的T細(xì)胞表面幾乎無法檢測(cè)到[33]。進(jìn)一步研究表明，T細(xì)胞通過TCR/NFATc1啟動(dòng)激活PD-1的初始轉(zhuǎn)錄之后，在抗原持續(xù)性刺激、細(xì)胞因子異常分泌，以及腫瘤微環(huán)境影響等條件下，仍有其他信號(hào)通路及因子單獨(dú)或協(xié)同參與到PD-1的后續(xù)表達(dá)調(diào)控過程。

IFN-α作為機(jī)體自身固有免疫的重要細(xì)胞因子，除了在抵御病原早期感染，以及CD8+T細(xì)胞向CTLs或記憶T細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮重要作用之外[11,42-45]，也可通過Ⅰ型干擾素相關(guān)的JAK/STATs信號(hào)通路激活，形成由STAT1-STAT2異源二聚體與干擾素調(diào)節(jié)因子9(interferon response factor 9,IRF9)組成的干擾素刺激基因因子3(IFN-stimulated gene factor 3,ISGF3)復(fù)合物，并結(jié)合至位于CR-C區(qū)域內(nèi)的ISRE元件，調(diào)控PD-1在巨噬細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)[16,33]。僅就CD8+T細(xì)胞而言，TCR激活信號(hào)很可能是PD-1轉(zhuǎn)錄起始的必要前提，而IFN-α的存在和持續(xù)刺激則可顯著提高并延長(zhǎng)PD-1在激活T細(xì)胞表面表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間，二者對(duì)PD-1的轉(zhuǎn)錄起到協(xié)同調(diào)控作用。

AP-1是由c-Fos和c-Jun異二聚體組成的一類序列特異性轉(zhuǎn)錄激活因子，通過調(diào)控相關(guān)目的基因的表達(dá)參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡等過程[44]。AP-1應(yīng)答基因在c-Fos/Jun介導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄激活與TCR刺激后T細(xì)胞的激活和功能密切相關(guān)[45]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞通過持續(xù)上調(diào)表達(dá)的AP-1亞單位蛋白c-Fos與JunB形成復(fù)合物，并結(jié)合至位于Pdcd1基因CR-B區(qū)域內(nèi)AP-1結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控PD-1的上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而抑制T細(xì)胞抗腫瘤的功能[32]。此外，在抗原肽介導(dǎo)的急性抗原刺激及敗血癥誘導(dǎo)的體外模型中分別發(fā)現(xiàn)，阻斷或抑制Notch信號(hào)通路可顯著降低PD-1的表達(dá)[37,46]。進(jìn)一步研究證實(shí)，Notch信號(hào)通路激活后，可通過形成RBPJk與Notch胞內(nèi)區(qū)域(Notch1 intracellular domain,NICD)復(fù)合物與位于Pdcd1基因CR-C區(qū)域5，端(-1 960～-1 950 bp,mouse)的相關(guān)元件結(jié)合，直接增強(qiáng)PD-1的表達(dá)[37]。

轉(zhuǎn)錄因子FoxO1可通過促進(jìn)一系列特定基因的轉(zhuǎn)錄，來維持機(jī)體內(nèi)T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)及功能[47]。在鼠慢性淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)感染的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，抗原持續(xù)性存在導(dǎo)致TCR依賴的PI3K/AKT/mTOR通路信號(hào)變?nèi)趸騿适?，使FoxO1在核內(nèi)積累并與Pdcd1基因CR-C區(qū)域相應(yīng)元件結(jié)合而加強(qiáng)PD-1的上調(diào)表達(dá)[34]。值得注意的是，阻斷PD-1/PD-L1相互作用會(huì)重新恢復(fù)mTOR的活性，進(jìn)而通過對(duì)FoxO1磷酸化作用的增強(qiáng)抑制其轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)活性。結(jié)合已有研究結(jié)果可以推測(cè)，在慢性病毒感染過程中FoxO1對(duì)PD-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用很可能是通過“PD-1-FoxO1-PD-1”這樣一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，即隨著抗原的持續(xù)性存在和刺激，PD-1在TCR信號(hào)激活下的初始轉(zhuǎn)錄上調(diào)逐漸加強(qiáng)，并在上述其他單個(gè)或多個(gè)信號(hào)通路的共同調(diào)控下持續(xù)高水平表達(dá)進(jìn)而激活抑制信號(hào)通路，導(dǎo)致TCR反應(yīng)以及下游PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路受損，逐步增強(qiáng)FoxO1活性并提高PD-1的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)一步加劇T細(xì)胞功能的耗竭，最終導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的T細(xì)胞免疫抑制。

3 Pdcd1基因表達(dá)的抑制因子

轉(zhuǎn)錄因子T-bet(T-box transcription factor expressed in T-cells)與T細(xì)胞的功能及分化密切相關(guān)，是第一個(gè)被鑒定出來具有Pdcd1基因轉(zhuǎn)錄抑制活性的調(diào)控因子。在慢性LCMV感染動(dòng)物中，免疫功能耗竭CD8+T細(xì)胞的PD-1與T-bet二者表達(dá)水平之間表現(xiàn)出了明顯的負(fù)相關(guān)性，且T-bet基因敲除小鼠在感染慢性LCMV后，耗竭CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)進(jìn)一步增加[31]。進(jìn)一步研究證實(shí)，在TCR信號(hào)刺激后，T-bet可直接通過與Pdcd1 TSS上游500 bp 的相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)PD-1轉(zhuǎn)錄的負(fù)向調(diào)控作用。值得注意的是，T-bet基因敲除小鼠在病毒感染后CD8+T細(xì)胞的PD-1表達(dá)僅較急性感染組或慢性感染組略有增高。這表明，T-bet僅能在一定程度上抑制PD-1的表達(dá)，仍需其他因素協(xié)同作用來抑制基因表達(dá)。

Blimp-1是一種與T-bet功能類似的轉(zhuǎn)錄抑制因子，參與到包含CD8+T細(xì)胞在內(nèi)的多種類型細(xì)胞的分化及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過程當(dāng)中[35]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性LCMV感染時(shí)，抗原特異性CD8+T細(xì)胞中Blimp-1的表達(dá)明顯高于急性病毒感染組，且PD-1的表達(dá)水平與Blimp-1之間表現(xiàn)出了顯著的負(fù)相關(guān)性[36]。進(jìn)一步研究表明，T細(xì)胞激活后，Blimp-1可結(jié)合至Pdcd1的CR-C和CR-B之間并直接影響NFATc1與CR-C區(qū)域內(nèi)調(diào)控PD-1轉(zhuǎn)錄對(duì)應(yīng)元件的結(jié)合，從而抑制PD-1的表達(dá)。令人驚訝的是，在PD-1高表達(dá)的免疫功能耗竭CD8+T細(xì)胞中，Blimp-1仍處于較高的表達(dá)水平。同時(shí)，PD-1的表達(dá)水平在Blimp-1基因敲除小鼠的免疫功能耗竭CD8+T細(xì)胞中僅有小幅度的下降。說明Blimp-1對(duì)PD-1轉(zhuǎn)錄的抑制作用，很可能僅發(fā)生在抗原特異性T細(xì)胞的激活過程，是機(jī)體自身防止PD-1過量表達(dá)的一種內(nèi)在平衡機(jī)制。而隨著抗原持續(xù)性刺激的增強(qiáng)，以及細(xì)胞因子作用下的機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變等因素影響，具有更強(qiáng)PD-1轉(zhuǎn)錄激活活性的因子或信號(hào)通路解除了Blimp-1對(duì)PD-1轉(zhuǎn)錄的抑制作用，進(jìn)一步加劇了T細(xì)胞功能的耗竭。

4 Pdcd1基因在其他細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究

PD-1作為調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫功能的抑制性受體，其表達(dá)調(diào)控分子機(jī)制的研究對(duì)象主要還是集中于抗原特異性T細(xì)胞，而其他表達(dá)PD-1的細(xì)胞如B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的相關(guān)研究則相對(duì)較少。T細(xì)胞中能夠有效起始PD-1轉(zhuǎn)錄的TCR/Calcineurin/NFATc1信號(hào)通路，卻并無法有效誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞PD-1表達(dá)上調(diào)[15,48]。進(jìn)一步研究表明，利用LPS刺激巨噬細(xì)胞時(shí)，TLR2或TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活，NF-κB p65亞基與CR-C區(qū)域內(nèi)的對(duì)應(yīng)元件結(jié)合并上調(diào)PD-1的表達(dá)。使用NF-κB特異性抑制劑或?qū)65亞基結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，則導(dǎo)致PD-1表達(dá)的完全缺失或?qū)?yīng)區(qū)域轉(zhuǎn)錄活性的消除[15]。因此，進(jìn)一步推測(cè)PD-1轉(zhuǎn)錄起始很可能是通過識(shí)別不同的刺激信號(hào)而實(shí)現(xiàn)的，或者是T細(xì)胞表面的抗原特異性受體TCR介導(dǎo)的NFATc1信號(hào)途徑，也或者是巨噬細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體TLR2或TLR4介導(dǎo)的NF-κB途徑來實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞外刺激的響應(yīng)。這個(gè)途徑會(huì)以細(xì)胞種類不同有所區(qū)別，由于B細(xì)胞則兼具兩種細(xì)胞的特點(diǎn)(既能發(fā)揮抗原提呈細(xì)胞作用又能分化為功能性漿細(xì)胞)，則很可能通過BCR介導(dǎo)的NFATc1信號(hào)通路調(diào)控PD-1表達(dá)，又可通過TLR介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路調(diào)控PD-1的表達(dá)。鑒于這個(gè)特點(diǎn)，B細(xì)胞在識(shí)別特定抗原的過程中，可能同時(shí)通過多種或單一的信號(hào)途徑來對(duì)PD-1表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。當(dāng)然，在巨噬細(xì)胞以外的細(xì)胞中NF-κB直接參與PD-1轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用仍尚未被證實(shí)，這有待進(jìn)一步深入研究。

5 Pdcd1基因的表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄后及翻譯后調(diào)控

真核生物基因的表達(dá)調(diào)控，除了通過相關(guān)信號(hào)通路激活所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因進(jìn)行直接調(diào)控之外，還可以通過甲基化、microRNA調(diào)控、泛素化和乙?；榷喾N作用在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄后翻譯、翻譯后修飾等多個(gè)層面進(jìn)行調(diào)控。人與鼠Pdcd1基因的CR-B和CR-C內(nèi)除了定位有數(shù)量眾多的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合位點(diǎn)之外，也富集了大量與DNA甲基化介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)的CpG島[41,49]。研究表明，在未表達(dá)PD-1的幼稚T細(xì)胞中，CR-B和CR-C兩個(gè)區(qū)域處于完全甲基化狀態(tài)。急性LCMV感染后幼稚T細(xì)胞向效應(yīng)CD8+T細(xì)胞的分化過程中，CR-B和CR-C兩個(gè)區(qū)域隨著TCR信號(hào)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的增強(qiáng)，其甲基化水平逐漸降低，PD-1表達(dá)水平持續(xù)上調(diào)，二者間存在顯著的負(fù)關(guān)聯(lián)性。而在慢性LCMV感染的情況下，由于TCR信號(hào)的持續(xù)刺激導(dǎo)致CR-B和CR-C兩個(gè)區(qū)域持續(xù)脫甲基化，進(jìn)而達(dá)到無法逆轉(zhuǎn)的狀況。特別是在功能耗竭的CD8+T細(xì)胞中，由于Pdcd1基因調(diào)控區(qū)域處于完全脫甲基化，即便機(jī)體內(nèi)病毒滴度處于較低水平PD-1仍呈現(xiàn)持續(xù)的異常高水平表達(dá)[41]。因此推測(cè)，在病毒感染初期TCR信號(hào)的刺激可導(dǎo)致PD-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域甲基化發(fā)生改變，進(jìn)而影響編碼基因的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，Pdcd1進(jìn)入轉(zhuǎn)錄激活初始狀態(tài)。正常情況下，轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的甲基化程度會(huì)隨著病毒的清除而逐漸恢復(fù)至正常水平。然而，慢性病毒感染所導(dǎo)致的持續(xù)性TCR刺激信號(hào)則使該調(diào)控區(qū)域發(fā)生部分甚至完全的不可逆脫甲基化，進(jìn)而導(dǎo)致Pdcd1的轉(zhuǎn)錄不再受TCR信號(hào)限制，進(jìn)入一種完全“失控”的激活狀態(tài)。

在表觀遺傳方面，Pdcd1除了通過甲基化作用調(diào)控自身轉(zhuǎn)錄之外，還受到特異AT序列結(jié)合蛋白1(special AT-rich sequence binding protein,SATB-1)介導(dǎo)的乙?；饔盟{(diào)控。研究表明，Satb-1缺失的T細(xì)胞中，PD-1表達(dá)水平較對(duì)照組上調(diào)40倍左右。進(jìn)一步研究證實(shí)，TCR信號(hào)刺激T細(xì)胞激活后，SATB-1可通過募集組蛋白去乙?；笍?fù)合物(nucleosome remodeling deacetylase,NuRD)并分別與CR-B和CR-C結(jié)合，通過對(duì)Pdcd1轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子區(qū)域的去乙?；饔脕硪种芇dcd1的轉(zhuǎn)錄[50]。在腫瘤環(huán)境中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)能夠降低或解除SATB-1對(duì)Pdcd1轉(zhuǎn)錄的抑制：一方面是通過TGF-β/Smad通路降低SATB-1的表達(dá)；另一方面Smad可以競(jìng)爭(zhēng)性地與SATB-1/NuRD復(fù)合物結(jié)合，減少Pdcd1轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子區(qū)域的去乙酰化作用。當(dāng)然，此種調(diào)控機(jī)制是否廣泛適應(yīng)多種情況或細(xì)胞類型，還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

PD-1的表達(dá)除了受到表觀遺傳等因素調(diào)控之外，還可通過microRNA以及泛素化作用在轉(zhuǎn)錄后及翻譯后水平進(jìn)行調(diào)控。目前，通過文獻(xiàn)檢索僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)幾種microRNA可與PD-1 mRNA的3′UTR結(jié)合直接參與其表達(dá)調(diào)控。體外研究中發(fā)現(xiàn)，miR-138轉(zhuǎn)染人CD4+T細(xì)胞后可顯著抑制PD-1的表達(dá)[51]。此外，在HBV易感患者的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)miR-4717水平顯著降低，其可通過與PD-1特定多態(tài)性位點(diǎn)結(jié)合降低PD-1的表達(dá)，與慢性HBV感染的易感性相關(guān)[52]。在小鼠腫瘤動(dòng)物模型中研究發(fā)現(xiàn)，miR-28在CD4+/PD-1+T細(xì)胞的表達(dá)量明顯下調(diào)，將其轉(zhuǎn)染B16F10細(xì)胞后可顯著降低PD-1的表達(dá)，并且miR-28的特異性抑制劑可通過上調(diào)PD-1的表達(dá)加劇T細(xì)胞功能的耗竭，進(jìn)一步證實(shí)了其對(duì)PD-1表達(dá)的直接調(diào)控作用[53]。隨著對(duì)PD-1研究及應(yīng)用的逐步深入，其表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制研究也逐漸從轉(zhuǎn)錄水平的核酸表達(dá)調(diào)控向翻譯后水平的蛋白表達(dá)調(diào)控轉(zhuǎn)移。FBXO38是近期研究發(fā)現(xiàn)的一種以PD-1為主要靶標(biāo)的E3連接酶，通過與PD-1的泛素化位點(diǎn)Lys48和Lys233結(jié)合，介導(dǎo)激活T細(xì)胞表面PD-1分子內(nèi)吞后的多泛素化和蛋白酶體降解，進(jìn)而在蛋白水平調(diào)控PD-1的表達(dá)。在腫瘤動(dòng)物模型的體外研究中發(fā)現(xiàn)，IL-2能夠重新上調(diào)功能耗竭CD8+T細(xì)胞的FBXO38轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并在不影響TCR信號(hào)通路的情況下間接使PD-1的蛋白表達(dá)水平下調(diào)[54]。此種機(jī)制是直接對(duì)PD-1蛋白水平進(jìn)行調(diào)控，這些研究結(jié)果很可能為阻斷PD-1通路提供新的思路或補(bǔ)充方案。

6 討論

截至目前，共發(fā)現(xiàn)12個(gè)直接參與PD-1表達(dá)調(diào)控的因子，其中10個(gè)為轉(zhuǎn)錄因子，包括8個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子(NFATc1、STAT3、STAT4、ISGF3、AP-1、Notch、FoxO1和NF-κB)和2個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子(T-bet和Blimp-1)。另外2個(gè)因子(FBXO38和SATB-1)則分別通過泛素化和去乙?；饔脤?duì)PD-1的表達(dá)起到抑制作用。除此之外，Pdcd1還可以通過特定區(qū)域(CR-B和CR-C)的甲基化從表觀遺傳方面調(diào)控自身基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這些表達(dá)調(diào)控因子及表觀遺傳等因素協(xié)同組成了復(fù)雜的PD-1表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以實(shí)現(xiàn)在不同抗原(急、慢性病毒)感染、炎癥環(huán)境、細(xì)胞種類及分化階段等條件下對(duì)PD-1表達(dá)的多樣化調(diào)控。

依據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果推測(cè)，初始免疫階段T細(xì)胞在抗原依賴的TCR信號(hào)通路的刺激下，可通過可逆的去甲基化作用使Pdcd1主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域(CR-B和CR-C)內(nèi)的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子活性暫時(shí)增強(qiáng)，并在多種轉(zhuǎn)錄激活因子的協(xié)同作用下激活PD-1的初始轉(zhuǎn)錄。在急性病原感染情況下，TCR信號(hào)隨著抗原的清除逐漸減弱，Pdcd1轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子甲基化程度逐步恢復(fù)，轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)減弱且抑制效應(yīng)逐漸加強(qiáng)，PD-1恢復(fù)至正常表達(dá)水平。在慢性病毒感染的條件下，持續(xù)性TCR信號(hào)刺激使Pdcd1的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子發(fā)生部分甚至完全的不可逆脫甲基化，且不再受TCR信號(hào)的限制，PD-1進(jìn)入一種完全“失控”的轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)，繼而導(dǎo)致T細(xì)胞免疫功能耗竭并產(chǎn)生免疫抑制。因此，抗原介導(dǎo)的TCR信號(hào)很可能在PD-1初始轉(zhuǎn)錄激活及其持續(xù)過量表達(dá)過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。當(dāng)然，持續(xù)性TCR信號(hào)刺激及可能的細(xì)胞因子作用是如何驅(qū)動(dòng)Pdcd1主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域表觀遺傳狀態(tài)發(fā)生改變的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究和證實(shí)。盡管如此，這些途徑仍為免疫檢查點(diǎn)療法新靶點(diǎn)的介入或治療方案的設(shè)計(jì)提供了新的信息和思路。