抑制lncRNA TUG1靶向上調(diào)miR-26a介導(dǎo)VEGF/P38MAPK/Hsp27通路對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生物學(xué)行為影響①

李永坤 賈廷印 劉 耿

(南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院普通外科,南陽473000)

結(jié)腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率分別居惡性腫瘤的第二位和第四位，且呈逐年上升趨勢[1]。對于無法實施根治術(shù)切除的結(jié)腸癌患者，以化療為主的綜合治療依然是臨床應(yīng)用最廣泛的治療手段[2]。然而，大量研究結(jié)果顯示，常規(guī)化療容易引發(fā)患者的耐藥性，導(dǎo)致治療失效或腫瘤復(fù)發(fā)[3]。近年來，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，腫瘤相關(guān)基因的靶向治療逐漸成為癌癥治療的新途徑[4]。長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA，lncRNA)是轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt且自身不編碼蛋白質(zhì)的RNA。大量研究證實，lncRNA可在遺傳、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平等多個層面調(diào)控基因表達(dá)，從而參與各類疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。在結(jié)腸癌中，ATB、SNHG20、AK093987等lncRNA已被證實參與結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲及凋亡等生物學(xué)過程。另有研究證實，lncRNA中TUG1在胃癌、乳腺癌、肺腺癌及腎癌細(xì)胞及組織中異常表達(dá)，對腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲均有影響[6]。然而，目前鮮有關(guān)于lncRNA TUG1在結(jié)腸癌細(xì)胞表達(dá)及潛其在功能的報道。本研究采用細(xì)胞實驗及動物實驗探究敲除lncRNA TUG1基因?qū)Y(jié)腸癌SW480細(xì)胞及結(jié)腸癌組織生物學(xué)行為的調(diào)控作用，并通過分析其靶向基因miR-26a的變化研究其對結(jié)腸癌細(xì)胞抑制作用的具體機(jī)制，旨在為臨床治療結(jié)腸癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細(xì)胞與動物 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所。SPF級裸鼠20只，體質(zhì)量16～20 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2017-0022。

1.1.2試劑 胰蛋白酶(美國Gibco公司)，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，TRIzol提取試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京鉑優(yōu)生物技術(shù)有限公司)；miR-26a mimic(模擬物)和inhibitors(抑制物)(德國吉瑪公司)；Western blot檢測一抗(美國Sigma公司)，辣根過氧化物酶編輯山羊抗小鼠IgG(北京康為生物科技公司)；LipofeetamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑(美國賽默飛公司)。

1.1.3儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Forma公司)；實時熒光定量擴(kuò)增儀(美國Thermo公司)，蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將結(jié)腸癌SW480細(xì)胞復(fù)蘇后置于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及鏈霉素的DEME細(xì)胞培養(yǎng)基中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中傳代培養(yǎng)，取對數(shù)期生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2生物學(xué)信息軟件預(yù)測靶基因 應(yīng)用生物信息學(xué)在線軟件TargetScan和MiRanda預(yù)測TUG1靶基因。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，采用shRNA敲除TUG1(sh-TUG1)，轉(zhuǎn)染前24 h接種細(xì)胞，將sh-TUG1與miR-26a inhibitor單獨或聯(lián)合轉(zhuǎn)染至SW620細(xì)胞。采用TUG1構(gòu)建的慢病毒載體(LV-TUG1)與miR-26a 模擬物mimic(miR-26a mimic)單獨或聯(lián)合轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞。LV-TUG1與通路抑制劑SB203580單獨或聯(lián)合轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞。所有轉(zhuǎn)染實驗均嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑操作步驟進(jìn)行。

1.2.4實時定量PCR(RT-PCR)檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染完成后，RT-PCR檢測細(xì)胞中miR-26a水平。以TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參蛋白進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法計算miR-26a的相對表達(dá)量，每組細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.5熒光素酶報告基因驗證靶基因 采用熒光素酶實驗進(jìn)一步驗證靶向關(guān)系，根據(jù)靶基預(yù)測軟件預(yù)測的可能結(jié)合位點體外合成該位點的DNA片段(TUG1wt)以及包含該位點突變體的DNA片段(TUG1mut)，退火后克隆到雙熒光素酶啟動子載體Pgl3。將該質(zhì)粒和miR-26a mimic共轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，試劑盒測定熒光素酶活性，并統(tǒng)計分析結(jié)果。

1.2.6Brdu法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)期生長的各組細(xì)胞，以2×104個/孔的濃度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后加入200 μmol/L BrdU繼續(xù)培養(yǎng)6 h。PBS清洗3遍后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，4℃過夜，PBS清洗3遍。采用0.3%的TritonX-100作用8 min使膜通透性增加，0.5 U/μl DNA酶1于30℃下作用30 min，滴加3%BSA于室溫下孵育1 h，滴加BrdU(1∶200)一抗4℃孵育過夜，采用熒光抗體Cy3(1∶21 000)標(biāo)記的二抗于室溫下孵育1 h，采用0.2 μmol/L hoechst33342于37℃處理細(xì)胞10 min。甘油封片后采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光情況，并計算全部細(xì)胞中BrdU的滲入率。

1.2.7Western blot檢測細(xì)胞中蛋白表達(dá) SDS-PAGE電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的一抗，二抗，孵育2 h，TBS洗凈，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達(dá)量。

1.2.8免疫熒光檢測蛋白表達(dá) 取對數(shù)期生長SW480細(xì)胞，以2×104個/孔接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后洗凈培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定，10 min后PBS清洗3次，0.2%Triton X-100透膜5 min后PBS清洗3次，再用5%的與二抗相同來源的血清做封閉液，將細(xì)胞爬片放置在封閉液中1 h。吸凈封閉液，滴加Vimentin一抗，4℃過夜，PBS清洗3次后避光滴加二抗，孵育1 h，PBS清洗3次。配制新鮮的Hoechst33342溶液，對細(xì)胞核進(jìn)行染色，5 min后PBS洗滌3次，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞狀況并拍照。

1.2.9Tanswell小室檢測細(xì)胞侵襲 將100 μl稀釋后的基質(zhì)膠均勻覆蓋于Transwell小室底部。取對數(shù)期生長SW480細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×105個/ml，取100 μl細(xì)胞懸液加于上室，下室加入等體積含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后取出小室，按照說明書固定、染色，膜下室面表面的細(xì)胞為侵襲的細(xì)胞，隨機(jī)選取5個不同視野拍照、計數(shù)，取平均值作為細(xì)胞侵襲數(shù)。

1.2.10動物實驗 裸鼠置于實驗室環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對照組及sh-TUG1組，10只/組。sh-TUG1組裸鼠皮下注射100 μl轉(zhuǎn)染shRNA敲除TUG1的SW480細(xì)胞，對照組裸鼠皮下注射等體積未經(jīng)處理的SW480細(xì)胞，細(xì)胞密度均為3×106個/ml，于實驗室環(huán)境正常喂養(yǎng)，每5 d測量1次各裸鼠腫瘤體積，喂養(yǎng)30 d后斷頸處死，取出腫瘤，測量體積并拍照。

1.2.11RT-PCR檢測腫瘤組織中TUG1表達(dá) TRIzol法提取總RNA，以GAPDH為內(nèi)參，RT-PCR檢測TUG1表達(dá)。采用2-ΔΔCt法計算TUG1的相對表達(dá)量，每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.12免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤中Ki67、VEGF及Vimentin蛋白表達(dá) 取腫瘤組織，行常規(guī)組織固定、連續(xù)切片，采用SP法利用免疫組化檢測試劑盒檢測Ki67、VEGF及Vimentin陽性表達(dá)。光學(xué)顯微鏡觀察各蛋白表達(dá)情況，每個切片隨機(jī)選擇5個視野并拍照保存，采用CMIAS真彩色醫(yī)學(xué)圖像免疫組化自動分析系統(tǒng)進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)，統(tǒng)計其陽性細(xì)胞數(shù)占比，并以其平均值作為計數(shù)結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件分析處理實驗數(shù)據(jù)，對于連續(xù)型資料采用正態(tài)性檢驗，滿足正態(tài)性且兩組間方差齊，采用t檢驗進(jìn)行組間比較；若以上條件不滿足則考慮非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1TUG1與has-miR-26a-5p的靶向關(guān)系 靶基因軟件預(yù)測結(jié)果顯示，has-miR-26a-5p為TUG1的靶基因，其中下劃線部分為軟件預(yù)測到的TUG1與has-miR-26a-5p mRNA 3′UTR的堿基互補(bǔ)序列，見表1。與對照組相比，細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA敲除TUG1基因后，TUG1相對表達(dá)水平明顯降低(P<0.05，圖1A)。相較于對照組，sh-TUG1組及miR-26a mimic組miR-26a表達(dá)明顯上升，LV-TUG1組及miR-26a inhibitor組miR-26a表達(dá)量明顯降低；sh-TUG1+ inhibitor組miR-26a表達(dá)量相較于miR-26a inhibitor組明顯升高，LV-TUG1+miR-26a mimic組miR-26a表達(dá)量相較于miR-26a mimic組明顯降低(P<0.05，圖1C、D)。與TUG1-wt組相比，共轉(zhuǎn)染TUG1-wt及miR-328 mimic細(xì)胞的熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)，表明has-miR-26a-5p是TUG1的靶向基因(圖1E)。

表1 TUG1與has-miR-26a-5p mRNA 3′ UTR的堿基互補(bǔ)序列

2.2敲除TUG1抑制細(xì)胞增殖及侵襲 相較于對照組，sh-TUG1組細(xì)胞增殖及侵襲數(shù)均明顯降低，而miR-26a inhibitor組細(xì)胞增殖及侵襲數(shù)均明顯升高(P<0.05)。sh-TUG1+inhibitor組細(xì)胞增殖數(shù)及侵襲數(shù)均明顯低于miR-26a inhibitor組(P<0.05)。見圖2。

2.3敲除TUG1對各蛋白表達(dá)的影響 相較于對照組，sh-TUG1組E-cadherin蛋白表達(dá)明顯升高，Vimentin及N-cadherin蛋白明顯降低(P<0.05)，miR-26a inhibitor組E-cadherin蛋白表達(dá)明顯降低，Vimentin及N-cadherin蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與miR-26a inhibitor組相比，sh-TUG1+inhibitor組E-cadherin蛋白表達(dá)明顯升高，Vimentin及N-cadherin蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖3。

圖1 TUG1與has-miR-26a-5p的靶向關(guān)系Fig.1 Targeting relationship between TUG1 and has-miR-26a-5pNote: Compared with control group,*.P<0.05;compared with miR-26a inhibitor group or miR-26a mimic group,#.P<0.05.

圖2 敲除TUG1抑制細(xì)胞增殖及遷移

2.4TUG1對VEGF/P38MAPK/Hsp27通路各蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖及侵襲的影響 相較于對照組，LV-TUG1組VEGF、P-P38/P38、P-Hsp27/Hsp27相對表達(dá)量升高，而SB203580組VEGF、P-P38/P38、P-Hsp27/Hsp27相對表達(dá)量降低(P<0.05)；SB203580+LV-TUG1組VEGF、P-P38/P38、P-Hsp27/ Hsp27相對表達(dá)量均高于SB203580組(P<0.05)。相較于對照組，LV-TUG1組細(xì)胞增殖及侵襲數(shù)均升高，而SB203580組細(xì)胞增殖及侵襲數(shù)均降低(P<0.05)；SB203580+LV-TUG1組細(xì)胞增殖及侵襲數(shù)均高于SB203580組(P<0.05)。相比較于對照組，LV-TUG1組Vimentin表達(dá)量升高，SB203580組Vimentin表達(dá)量降低(P<0.05)；SB203580+LV-TUG1組Vimentin表達(dá)量高于SB203580組(P<0.05)。見圖4。

圖3 敲除TUG1對各蛋白表達(dá)的影響

圖4 TUG1對VEGF/P38MAPK/Hsp27通路各蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響(×400)

圖5 敲除TUG1對體內(nèi)腫瘤形成的影響Fig.5 Effect of knocking out TUG1 on tumor formation in vivoNote: A.Tumor tissue images and tumor volume changes in nude mice;B.RT-PCR was used to detect relative expression of TUG1 in tumor tissues of nude mice;C.Immunohistochemical detection of tumor tissues in nude mice and relative expression levels of Ki67,VEGF and Vimentin (×400).Compared with control group,*.P<0.05.

2.5敲除TUG1對體內(nèi)腫瘤形成的影響 sh-TUG1組裸鼠腫瘤體積明顯小于對照組(P<0.05)。sh-TUG1組腫瘤組織TUG1相對表達(dá)量低于對照組，而miR-26a相對表達(dá)量低于對照組(P<0.05)。sh-TUG1組腫瘤組織Ki67、VEGF及Vimentin陽性細(xì)胞占比均明顯低于對照組(P<0.05)。見圖5。

3 討論

lncRNA是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞增殖分化等多個生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[7]。TUG1是大小為7.1 kb的lncRNA，已被證實在多種腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，對腫瘤細(xì)胞的各項生物學(xué)功能均有調(diào)節(jié)作用。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，TUG1能通過激活p27/cyclin D1途徑發(fā)揮促癌基因作用，促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制TUG1表達(dá)不僅能顯著降低SW480細(xì)胞增殖及侵襲能力，亦能抑制體內(nèi)腫瘤生長，提示TUG1在結(jié)腸癌中為促癌基因，抑制其表達(dá)能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲，與上述研究一致。大量研究證實，miRNA參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的各項生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲等[9]。本研究通過靶向基因預(yù)測軟件及熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-26a是TUG1的靶向基因，抑制TUG1能有效上調(diào)miR-26a表達(dá)。SW480細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-26a inhibitor后，細(xì)胞增殖及侵襲數(shù)均顯著升高；而共同轉(zhuǎn)染miR-26a inhibitor及sh-TUG1時，細(xì)胞中miR-26a表達(dá)明顯升高，細(xì)胞增殖及侵襲數(shù)均顯著降低，提示抑制TUG1可反向上調(diào)miR-26a表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞增殖及侵襲，這可能是TUG1在結(jié)腸癌中作用機(jī)制之一。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指在特定的生理、病理情況下細(xì)胞由上皮表型向間葉表型轉(zhuǎn)變的過程，在上皮源性腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，是誘發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[10]。研究指出，EMT過程的主要特征為上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)降低甚至喪失，間充質(zhì)標(biāo)志Vimentin和N-cadherin蛋白等表達(dá)上調(diào)[11]。Ki67是一種與細(xì)胞增殖狀態(tài)相關(guān)的核蛋白，能有效反應(yīng)腫瘤細(xì)胞增殖活動，是最具代表性的增殖細(xì)胞標(biāo)記之一[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)TUG1表達(dá)促使miR-26a表達(dá)升高后，其對應(yīng)的E-cadherin表達(dá)明顯升高，Vimentin、N-cadherin和Ki67蛋白表達(dá)降低，進(jìn)一步說明下調(diào)TUG1表達(dá)不僅能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖，還能通過抑制EMT過程防止腫瘤轉(zhuǎn)移。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，其在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、腫瘤生長及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[13]。VEGF與flk-1/KDR受體結(jié)合后引發(fā)一系列磷酸化反應(yīng)，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖及遷移，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步生長[14]。分離原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)級聯(lián)是細(xì)胞內(nèi)主要的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，細(xì)胞通過這一系統(tǒng)將外界刺激信號傳導(dǎo)至細(xì)胞核，介導(dǎo)細(xì)胞的各項生物學(xué)效應(yīng)[15]。P38MAPK是新發(fā)現(xiàn)的一類MAPK信號通路，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[16]。本研究表明，SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV-TUG1后可明顯提高VEGF表達(dá)，而在預(yù)先使用P38MAPK信號傳導(dǎo)通路特異性阻斷劑SB203580后，可明顯抑制VEGF及P-P38/P38表達(dá)，降低細(xì)胞的增殖及侵襲，提示轉(zhuǎn)染LV-TUG1提升VEGF表達(dá)后促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及侵襲主要是通過P38MAPK信號通路而產(chǎn)生作用的。P38MAPK可激活下游的熱休克蛋白27(heat shock protein 27，Hsp27)，Hsp27是P38MAPK的磷酸化底物，其磷酸化可有效抑制腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。Konda等[17]通過在黑色素瘤中轉(zhuǎn)染Hsp27基因發(fā)現(xiàn)細(xì)胞不但發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，且Tanswell實驗觀察到細(xì)胞體外侵襲能力下降。本研究發(fā)現(xiàn)，采用SB203580抑制劑抑制VEGF/P38MAPK通路后，細(xì)胞內(nèi)P-Hsp27/Hsp27表達(dá)量也隨之降低，提示Hsp27是VEGF/P38MAPK的下游通路，能抑制結(jié)腸癌的增殖及侵襲。裸鼠體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，sh-TUG1組腫瘤體積明顯低于對照組，其相應(yīng)的腫瘤組織miR-26a表達(dá)量高于對照組，而Ki67、VEGF及Vimentin陽性細(xì)胞占比也低于對照組，說明抑制TUG1表達(dá)能顯著上調(diào)miR-26a，激活VEGF/P38MAPK/Hsp27通路可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲，從而抑制腫瘤生長。

綜上所述，miR-26a是TUG1的靶向基因，抑制TUG1表達(dá)能反向提升miR-26a表達(dá)，抑制VEGF/P38MAPK/Hsp27通路可實現(xiàn)對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及侵襲的抑制作用，進(jìn)而抑制腫瘤組織生長。提示TUG1/miR-26a有望成為治療結(jié)腸癌的新靶點，為指導(dǎo)臨床用藥及新的靶向藥物開發(fā)提供實驗依據(jù)。