廣西人群LncRNA-GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G位點多態(tài)性分布①

劉純宏 王 艷 石 鳳 陸玉蘭 黃華佗 王春芳 韋葉生 藍 艷

(右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，百色533000)

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度大于200個核苷酸且缺乏開放閱讀框的新型非編碼RNA[1]。最初，LncRNA被認為是“基因垃圾”“暗物質”或“假基因”，不具有生物學功能。最新研究表明，LncRNA在轉錄及轉錄后水平調控基因表達，調控細胞增值、分化及凋亡過程。生長停滯特異性轉錄本5(growth arrest specific transcript 5,GAS5)最初被發(fā)現(xiàn)積聚于生長停滯細胞中的LncRNA，位于人類染色體1q25.1，由12個外顯子構成，可編碼10個C/D snoRNA，全長651個核苷酸。最新研究表明，GAS5與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、哮喘、類風濕關節(jié)炎和骨關節(jié)炎等免疫相關疾病的發(fā)生密切相關，提示GAS5可能是某些免疫炎癥疾病的防治靶標或生物標記物[2-5]。目前，關于GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G遺傳多態(tài)性在廣西人群中分布特征的研究尚未見報道。因此，本研究采用SNPscan技術對廣西健康人群LncRNA-GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G位點進行基因分型檢測，并分析其多態(tài)性與其他地區(qū)人群的分布差異，為闡明GAS5基因多態(tài)性在不同種族之間的分布特征及其與疾病的關系提供群體遺傳學參考。

1 資料與方法

1.1資料 隨機選取2017年5月～2018年9月我院健康體檢者289例，其中男性106例，女性183例，年齡19～76歲。血常規(guī)及生化指標均在正常參考范圍內，結合影像學檢查及臨床醫(yī)師診斷，排除自身免疫、神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤、肝臟、腎臟、心臟等疾?。谎芯繉ο缶鶠槭谰佑趶V西地區(qū)且相互間無血緣關系的個體。本研究方案獲得我院倫理委員會批準，所有受試者知情同意。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 用EDTA-K2抗凝管采集各受試者靜脈血3.0 ml，采用離心柱法提取基因組DNA，-70 ℃保存?zhèn)溆?。連接引物的設計與合成從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中查找LncRNA GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G位點的堿基序列，采用primer3在線軟件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)輔助設計實驗引物序列(表1)，委托上海天昊生物科技有限公司合成。

1.2.2連接和多重PCR反應及基因分型檢測 連接反應體系總體積為20.0 μl，其中含樣本DNA 8.0 μl、2× 連接緩沖液 10.0 μl、耐熱DNA連接酶0.2 μl、連接探針混合液0.8 μl、 剩余體積用滅菌雙

表1 GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G引物序列

蒸水補足。連接反應參數(shù)：98℃ 2 min；95℃ 30 s，58℃ 3 h；循環(huán)5次；94℃ 2 min；72℃ forever。將連接產(chǎn)物進行多重熒光PCR擴增，多重PCR反應體系的總體積為20.0 μl，其中包含連接產(chǎn)物1.0 μl，2×PCR緩沖液A 10.0 μl，TaqDNA聚合酶0.4 μl，多重熒光擴增引物0.5 μl，滅菌雙蒸水8.1 μl。多重PCR反應參數(shù)：95℃ 2 min；94℃ 20 s，62℃ 40 s(每個循環(huán)降低0.5℃)，72℃ 1.5 min，循環(huán)9次；94℃ 20 s，57℃ 40 s，72℃ 1.5 min，循環(huán)25次；68℃ 60 min；4℃ forever。將多重PCR產(chǎn)物以10倍ddH2O稀釋，振蕩混勻，取1.0 μl PCR產(chǎn)物與 0.1 μl LIZ500和8.9 μl Hi-Di混勻，95℃變性 5 min，后ABI3500測序儀檢測，采用GeneMapper 4.1軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗樣本的群體代表性。基因型和等位基因頻率采用直接計數(shù)法計算，不同組間基因型和等位基因頻率的比較用行χ2檢驗和四格表χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1廣西人群GAS5基因rs6790A/G和rs19516 25A/G分型檢測結果 結果顯示，rs6790A/G位點存在AA、AG和GG 3種基因型，頻率分別為15.6%、48.1%和36.3%，A、G等位基因頻率分別為39.6%和60.4%。rs1951625A/G位點存在AA、AG和GG 3種基因型，頻率分別為8.3%、38.1%和53.6%，A、G等位基因頻率分別為27.3%和72.7%。2個位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，表明本研究所選取的人群具有群體代表性?；蚍中蜋z測結果見圖1。

2.2rs6790A/G和rs1951625A/G位點多態(tài)性在廣西人群不同性別間的分布 廣西人群GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G位點分別以AG和GG基因型為多見，其頻率分別為48.1%和53.6%；G等位基因頻率最高，分別為60.4%和72.7%。2位點的基因型和等位基因頻率在男性和女性間的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示2個位點基因型和等位基因頻率在廣西人群中的分布與性別無關，見表2。

2.3廣西人群rs6790A/G和rs1951625A/G多態(tài)性與其他地區(qū)人群比較 將廣西人群rs6790A/G和rs1951625A/G位點的基因型和等位基因頻率分別與國際千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫公布的CHS、JPT、CEU、AFR和AMR人群進行比較，結果顯示，廣西人群rs6790A/G位點的基因型和等位基因頻率與JPT、CEU、ARF和AMR人群比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與CHS人群比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；廣西人群rs1951625A/G位點的基因型和等位基因頻率與AFR人群比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與CHS、JPT、CEU和AMR人群比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，結果見表3、4。

表2 rs6790A/G和rs1951625A/G位點基因型和等位基因頻率在廣西人群不同性別間比較[例(%)]

表3 廣西人群GAS5基因rs6790A/G遺傳多態(tài)性與不同人群的比較[例(%)]

表4 廣西人群GAS5基因rs1951625A/G遺傳多態(tài)性與不同人群的比較[例(%)]

3 討論

LncRNA-GAS5最初被發(fā)現(xiàn)與細胞生長阻滯密切相關，全長651個核苷酸，其編碼基因GAS5屬于5′-top家族成員，其外顯子不具有編碼能力，而內含子可編碼10box C/D的miRNAs并發(fā)揮生物學作用[6]。GAS5第400～598個核苷酸含有6對短發(fā)夾結構，且第5對發(fā)夾結構含有2條糖皮質激素受體反應元件 (glucocorticoid receptor response element，GRE) 序列，稱為GAS5 GRE-mimic[7]。由于GAS5具有相對復雜的二級結構，可能是其具有復雜生物學功能的結構基礎。近年GAS5基因與疾病的關系引起研究者關注，成為基因研究的新興領域。Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn)GAS5基因啟動子區(qū)的rs55829688位點突變與結直腸癌發(fā)生相關，并通過影響轉錄因子YY1與GAS5的結合親和力降低GAS5表達。Tang等[8]研究發(fā)現(xiàn)GAS5基因rs145204276位點del等位基因可能通過與轉錄因子特異性蛋白1結合，誘導啟動子活性，從而抑制乳腺癌發(fā)生，導致GAS5水平升高。伊朗學者Rakhshan等[9]研究發(fā)現(xiàn)GAS5基因rs2067079位點隱性遺傳模型(TT vs.CC + CT)及rs2067079和rs6790位點單倍型組合T-G可能增加膀胱癌發(fā)病風險。

遺傳多態(tài)性可因自然選擇、環(huán)境因素、飲食習慣和不同種族呈現(xiàn)不同程度的差異，現(xiàn)有研究表明，不同遺傳背景的人群對相同疾病易感性不同。如埃及學者Shaker等[10]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-CASC8基因rs6983267位點多態(tài)性可能提高大腸癌遺傳易感性(GG vs.GT/TT：OR=2.13，95%CI=1.146～3.937，P=0.017)；而西班牙學者Carla等[11]研究發(fā)現(xiàn)rs6983267位點多態(tài)性可能降低大腸癌發(fā)病風險(GG vs.GT/TT：OR=0.69，95%CI=0.50～0.95，P<0.001)。出現(xiàn)此差異性結果的原因可能是研究對象遺傳背景不同。因此，研究不同地區(qū)和族群間正常人群的基因多態(tài)性分布特征，可闡明不同地區(qū)人群的遺傳背景資料，也為進一步研究不同人群基因多態(tài)性與某些疾病的遺傳易感性提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

本研究采用SNPscan測序技術檢測廣西人群LncRNA-GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G位點多態(tài)性，結果顯示，廣西人群GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G位點基因型和等位基因頻率分布在不同性別間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G位點在廣西人群中的遺傳多態(tài)性分布與性別無關。進一步將廣西人群rs6790A/G和rs1951625A/G位點多態(tài)性與千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫公布的CHS、JPT、CEU、AFR和AMR人群的SNP分型數(shù)據(jù)進行比較，發(fā)現(xiàn)廣西人群rs6790A/G位點的基因型和等位基因頻率與JPT、CEU、ARF和AMR人群比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與CHS人群比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；廣西人群rs1951625A/G位點的基因型和等位基因頻率與AFR人群比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與CHS、JPT、CEU和AMR人群比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。國內外多項研究已證實基因多態(tài)性與地緣關系、生活習性及種族等多種因素密切相關，與本研究結果相符[12-14]。廣西人群與CHS和JPT人群同屬于亞洲人群，地緣關系相對較近，因此，這3種人群的遺傳多態(tài)性分布差異相對較小，與“親緣關系越近，其基因型的分布越相似，反之則差異越顯著”的遺傳學定律相符。與此同時，本研究發(fā)現(xiàn)JPT人群與廣西地區(qū)人群雖然都是亞洲人群，但由于廣西是多民族聚集的偏遠山區(qū)，地理環(huán)境及氣候獨特，生活方式及飲食習慣與其他地區(qū)也存在較大差異，因此，2種人群的遺傳多態(tài)性也呈現(xiàn)差異性。而廣西人群與CEU、AFR和AMR人群屬于不同種族人群，3者親緣關系較遠，地理及生態(tài)隔離阻礙了種族間遺傳物質的交流，隨著時間積累，各隔離群體發(fā)生的遺傳變異朝著不同的方向發(fā)展，可能是造成3種人群存在較明顯的遺傳多態(tài)性差異的原因之一。rs1951625A/G位點多態(tài)性與AFR人群差異有統(tǒng)計學意義，而與CHS、JPT、CEU和AMR人群差異均無統(tǒng)計學意義的原因之一可能與“人類起源學說”有關，研究認為人類在非洲具有1個共同祖先，而隨著氣候、地理等因素人類逐漸走出非洲，到達世界各地[15]?，F(xiàn)代人類經(jīng)過漫長的遷移，與不同地區(qū)原有的近緣同類混血通婚，并獨立進化，形成不同族群，隨著時間的積累，不同群體與非洲人群間的差異越來越明顯。因此，本研究認為出現(xiàn)此差異結果的原因可能與人類歷史上大規(guī)模的遷徙、自然的選擇及基因的隨機漂變有關。提示廣西人群存在GAS5基因多態(tài)性，且與其他地區(qū)人群比較存在不同程度的差異。

本研究初步探討了廣西人群GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G位點多態(tài)性分布特征，并與國際千人基因組計劃公布的不同地區(qū)人群的SNP分型數(shù)據(jù)進行了比較，不僅為GAS5基因多態(tài)性的群體遺傳學普查提供了數(shù)據(jù)資料，同時也為其與相關疾病易感性的研究奠定了遺傳學基礎。但廣西是多民族聚集區(qū)，本研究未能具體到民族，有待進一步研究。