等位基因座D21S11稀有等位基因32.3的確認

王曉勛李瑞明 陳 敏

?論 著?

等位基因座D21S11稀有等位基因32.3的確認

王曉勛★李瑞明 陳 敏

目的確證在一例單親親權鑒定中所發(fā)現(xiàn)的在D21S11等位基因座出現(xiàn)稀有的分型標準物外等位基因。方法為了解該稀有的分型標準物外等位基因的確切分型、復合序列結構、及其最小等位基因頻率，設計分子生物學實驗，經(jīng)過PCR，克隆測序顯示該稀有等位基因是D21S11基因座的稀有等位基因32.3。結果對稀有等位基因32.3的結構和頻率進行分析，測序分析顯示擬父和孩子的D21S11基因座的等位基因32.3的核苷酸序列結構相同，復合序列為[TCTA]6[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCT A]2TCCATA[TCTA]11。結論稀有等位基因32.3頻率較低，在親權鑒定中會增加此基因座的擬然比率（父權指數(shù)），從而提高親權鑒定的非排除結論的概率，在個體識別鑒定中具有重要的意義。

等位基因座；等位基因；似然比率；父權指數(shù)(PI)

等位基因座的稀有等位基因是等位基因座中發(fā)生頻率稀少的一類等位基因，各個稀有等位基因發(fā)生的頻率不同，復合核心序列不同，在親權鑒定，同胞鑒定和個體識別中，兩個個體和同一個體同時出現(xiàn)發(fā)生頻率很低的稀有等位基因，可有效的增加親權、同胞、個體的認定幾率。一般認為稀有等位基因是由于重復序列插入、缺失所形成的復合結構，其復合序列結構框為稀有等位基因的命名提供了實驗序列的支持。等位基因座D21S11的稀有等位基因32.3在STRbase數(shù)據(jù)庫Variant Allele Reports一直未見報道，目前我們已經(jīng)將基因座D21S11的稀有等位基因32.3的相關數(shù)據(jù)遞送到STRbase數(shù)據(jù)庫，并被其接受。在STRbase數(shù) 據(jù) 庫Sequence Information（annotated）中許多其它類型的稀有等位基因結構已經(jīng)確認，但未見等位基因座D21S11的稀有等位基因32.3復合結構的報道，本文利用分子生物學實驗得到基因座D21S11的稀有等位基因32.3復合基因序列結構框，填補了該等位基因座稀有等位基因32.3的序列結構及其最小等位基因頻率。

1 材料和方法

1.1 樣本提取，單親雙聯(lián)體家系案例一例

采用chelex-100樹脂提取全血樣本DNA的方法：采集1μL新鮮血液樣本，混勻到1 mL配制1×TE緩沖液中，室溫放置10 min，8000 r/min離心5 min，去掉上清后，加入5% chelex-100（Bio-Rad）350μL，混勻。100℃ 煮沸10 min，放置過夜后，采用酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，沉淀溶解的DNA用于核酸定量和PCR擴增。

1.2 STR等位基因的檢測

采用美國ABI 公司Identifiler試劑盒進行分型。按試劑盒說明書進行操作，依據(jù)STRbase Core Loci數(shù)據(jù)合成引物，序列引物如下：5'-ATATGTGAGTCAATTCCCAAG-3'；5'-TGTATTAGTCAATGTTCTCCAG-3'。擴增D21S11等位基因，分別得到兩人的D21S11等位基因分型。

PCR試劑：Promega PCR Master Mix 25 μL，Taq酶2μL，處理的標本上清10μL，去離子水13μL，混勻。PE9600基因擴增儀進行以下設置：94℃ 3 min，94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，共32個循環(huán)，72℃15 min[1]。

PCR產(chǎn)物電泳：瓊脂糖凝膠電泳。鑒定PAGE（聚丙烯酰胺凝膠）電泳，切膠分離，擬父分離短片段，孩子分離長片段，回收得到DNA，定量后用于TA克隆。

1.3 D21S11克隆

加入pGEM-T載體和回收定量的PCR產(chǎn)物、T4連接酶、連接Buffer，16℃過夜，轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α進行藍白斑篩選，得到陽性克隆菌，PCR鑒定插入情況，得到插入目的片段的克隆。

1.4 D21S11克隆片段測序

克隆菌直接提取DNA，按照ABI BigDye3.1測序試劑盒說明書進行操作，使用M13通用測序引物，序列如下：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'；5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'。Hi-Di甲酰胺處理變單鏈，再用ABI310測序儀進行測序分析。對得到的基因座D21S11的等位基因各核酸序列進行多序列比較，所用軟件為DNAMAN v6.0。

1.5 實驗儀器

Nanodrop2000核酸蛋白檢測儀，ABI PE-9600基因擴增儀，ABI 310基因測序儀，eppendorf centrifuge 5415R離心機，ThermStat plus加熱模塊，Bio-rad PowerPac Basic電泳儀。

2 結果

2.1 兩份標本D21S11等位基因座分型結果

單親（擬父和孩子）identi fi ler STR基因座D21S11分型結果如圖1，從上而下分別是500 LIZ ladder，擬父和孩子的D21S11等位基因分型結果。擬父和孩子均出現(xiàn)Off ladder條帶，提示在此基因座中出現(xiàn)稀有等位基因，根據(jù)產(chǎn)物長度219.06 bp和218.97 bp，比較ladder后初步認定此稀有等位基因為基因座D21S11的32.3。OL顯示此等位基因為稀有等位基因，是擬父遺傳給孩子的。

2.2 PCR擴增兩標本D21S11等位基因座電泳結果

利用STRbase提供的序列合成引物，對擬父和孩子D21S11等位基因座進行擴增，結果如圖2。被擴增的目的基因D21S11 OL32.3的長度為231 bp。D21S11 33.2的擴增長度是234 bp。Marker為100～1000 bp（梯度為100 bp）的PCR Marker。由于瓊脂糖凝膠電泳的分辨率問題，孩子和擬父的PCR擴增產(chǎn)物的結果在瓊脂糖凝膠電泳中可以看到條帶，但差別不明顯。

2.3 基因座D21S11的OL等位基因測序結果

PCR產(chǎn)物克隆到T載體后，利用M13通用引物測序的結果如圖3所示，圖A為D21S11等位基因座的測序結果（即OL復合結構序列）；圖B為D21S11基因座等位基因33.2的測序結果（此等位基因為常見分型標準內(nèi)的等位基因，在STRbase中已經(jīng)有復合序列和基因分布頻率的記錄）。結果表明基因座D21S11等位基因33.2的復合序列框正好比該基因座OL復合序列框（32.3）多3 bp的長度，以此來判斷此OL條帶為基因座D21S11的稀有等位基因32.3。

2.4 染色體STR分型結果

單親鑒定（擬父和孩子）Idnti fi ler分型結果和每個基因座遺傳分型的父權指數(shù)（PI）見表1。該稀有等位基因遺傳頻率采用等位基因最小頻率0.0014188[1]計算，當這種稀有等位基因被遺傳給后代，其PI值達到176.3668，大大提高了此父權鑒定中累計父權指數(shù)（CPI）的值。

2.5 基因座D21S11等位基因的復合序列框

擬父和孩子基因座D21S11所有等位基因的復合序列框見表2。結果表明擬父和孩子基因座D21S11的稀有等位基因32.3的復合序列框的結構完全相同，測序結果判讀顯示此基因座等位基因29、33.2分別比稀有等位基因分別少15 bp和多3 bp。等位基因座D21S11的等位基因33.2為常見分型標準內(nèi)的等位基因，在STRbase中已經(jīng)有復合序列和基因分布頻率的記錄。

圖1 D21S11等位基因座分型結果Figure1 The classi fi cation result of D21S11 locus

圖2 D21S11等位基因座電泳結果Figure 2 The electrophoresis result of D21S11 locus

表1 擬父和孩子的等位基因分型結果和每個基因座計算的PI值Table1 The classi fi cation result of the allele gene of parents andchild and calculation the PI value of each gene

圖B圖3 基因座D21S11的OL等位基因測序結果Figure 3 The sequencing results of OL alleles gene of D21S11 locus

表2 基因座D21S11的等位基因復合序列框Table 2 The alleles gene composite sequence box of D21S11 locus

3 討論

此單親鑒定中的擬父和孩子皆在等位基因座D21S11中出現(xiàn)稀有等位基因（OL）。依據(jù)STRbase設計的引物，經(jīng)過PCR、克隆、測序顯示此稀有等位基因OL是D21S11等位基因座的一種稀有等位基因32.3?？寺y序分析顯示擬父和孩子的D21S11基因座OL32.3的復合核苷酸序列結構相同，長度為231 bp。擬父的D21S11基因座等位基因33.2復合核苷酸序列長度為234 bp。因此可以確定擬父分型結果為OL32.3和33.2，孩子分型結構為29和32.3，其D21S11基因座的等位基因皆通過測序得到等位基因的符合序列框（表2）。OL32.3從擬父傳給了孩子。圖3A圖D21S11（OL）對比B圖D21S11 33.2等位基因少3 bp，與圖1顯示相符合，此D21S11基因座OL等位基因的位點應該被命名為D21S11 32.3。其核心測序結果顯示其復合結 構 為 [TCTA]6[TCTG]5[TCTA]3TA [TCTA]3TCA [TCTA]2TCCATA[TCTA]11。

依據(jù)觀察到的發(fā)生頻率計算此32.3等位基因的最小等位基因頻率為0.0014188[1]。在親權鑒定中，特別是兩個個體同時檢測出相同基因座具有相同的稀有等位基因時，由于稀有等位基因發(fā)生的頻率低會增加親權鑒定中此基因座的擬然比率，從而增加總的擬然比率（父權指數(shù)），提高親權鑒定的非排除結論的概率，特別是擬父和孩子都檢測出攜帶有相同的稀有等位基因。在個體同一認定鑒定中共同具有此稀有等位基因可以增加偶合率，為判斷來源來自同一個體也起著相當重要的作用[3]。

一般認為稀有等位基因是由于等位基因突變中核酸的缺失、插入或核苷酸的改變所產(chǎn)生的，屬于微變異[1]。并且這種突變后的遺傳符合孟德爾遺傳規(guī)律，可以遺傳給后代[2,3]。圖1顯示此擬父和孩子的D21S11等位基因座等位基因（OL）32.3的長度為219.06 bp（擬父）（ID）和218.97 bp（孩子）（ID），此雙親鑒定中擬父和孩子的等位基因型32.3的核酸復合序列結構是[TCTA]6[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3T CA[TCTA]2TCCATA[TCTA]11，兩核心序列完全相同，未發(fā)現(xiàn)序列改變。以此判斷此孩子的基因座D21S11稀有等位基因32.3是擬父遺傳的可能性是隨機男人遺傳這種稀有等位基因32.3可能性的176.3668倍，大大提高親權鑒定中累計復權指數(shù)。在表1中得到體現(xiàn)。目前，我們已經(jīng)把此復合序列框的序列提交給STRbase數(shù)據(jù)庫，以完善前期提交的等位基因分型信息。

[1] Butler J M. Forensic DNA typing: biology, technology, and genetics of STR markers[M]. Burlington: Elsevier Academic Press, 2005, 477.

[2] 翟永結, 朱永強, 吳志鵬, 等. 三條帶模式與稀有等位基因共存樣品DNA檢驗1例[J]. 中國法醫(yī)學雜志, 2011, 26(6): 481-482.

[3] Margolis-Nunno H, Brenner L, Cascardi J, et al. A new allele of the short tandem repeat(STR) Locus, CSF1PO[J]. J Forensic Sci, 2001, 46(6): 1480-1483.

[4] 楊慶恩. 親子鑒定DNA分型親權指數(shù)的簡化計算法[J]. 中國法醫(yī)學雜志, 1998, 13(2): 90-93.

Certi fi cation of rare alleles 32.3 of D21S11 locus

WANG Xiaoxun★, LI Ruiming, CHEN Min
(Hubei University of Medicine Af fi liated Taihe Hospital Biomedical Research Institute, Hubei, Shiyan 442000, China)

Objective To certify the rare alleles (off-ladder allele, OL) found on the D21S11 locus in a case of paternity identi fi cation. Methods In order to understand the exact classi fi cation of this rare allele, the composite sequence structure, and its minimum allele frequency, molecular biology experiments, including PCR, cloned and sequencing methods, were designed to prove D21S11 locus exist rare alleles 32.3. Results The structure and frequency of rare alleles 32.3 was analysised. Sequencing analysis showed that the rare allele 32.3 of D21S11 locus of parent and child had the same nucleotide sequence structure. The composite sequence were [TCTA]6[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]11. Conclusion The frequency of rare alleles 32.3 was lower, which will increase the likelihood ratio (paternity index, PI) in the paternity identi fi cation, and improve the non-exclusive probability in the paternity test. And also had important signi fi cance in the identi fi cation of individual.

Loci ; Allele; Likelihood ratio; Paternity index(PI)

湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院生物醫(yī)學研究所，湖北，十堰 442000

★通訊作者：王曉勛，E-mail:524910@qq.com