紅曲菌MpigE基因過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

鄭學(xué)海 柳燕 朱錦懋 楊成龍 陳由強(qiáng) 陳建楠

摘?要：以福建紅曲菌MCL為出發(fā)菌株，以PSKH質(zhì)粒為模板克隆PtrpC啟動子及TrpC終止子。通過重疊延伸PCR技術(shù)融合PtrpC啟動子、MpigE（目的）基因、TrpC終止子，獲得PMT融合片段。為了驗(yàn)證融合片段PMT的正確性，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，在2100 bp左右出現(xiàn)單一且清晰的條帶。通過EcoR V和Spe I酶切PMT片段，插入帶有潮霉素抗性的PSKH質(zhì)粒的EcoR V和Spe I位點(diǎn)，構(gòu)建1個紅曲菌過表達(dá)載體HPMT，大小為7 155 bp。通過構(gòu)建過表達(dá)載體，以期對紅曲菌MCL進(jìn)行改造，獲得高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素的菌株。

關(guān)鍵詞：紅曲菌;MpigE基因;質(zhì)粒;過表達(dá);構(gòu)建

中圖分類號：TS261.3?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號：0253-2301（2020）05-0001-11

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.05.001

Abstract： By taking the MCL of Monascus in Fujian as the original strain， the PtrpC promoter and TrpC terminator were cloned by using the PSKH plasmid as the template. The PMT fusion fragments were obtained by fusing PtrpC promoter， MpigE target gene and TrpC terminator with the overlap-extension PCR technology. In order to verify the correctness of the fusion fragment PMT， the agarose gel electrophoresis analysis was carried out， and a single clear band appeared at about 2，100 bp. The fragment of PMT was digested by EcoR V and Spe I， and the EcoR V and Spe I sites of the PSKH plasmid with hydthromycin resistance were inserted to construct an overexpression vector HPMT of Monascus， with a size of 7 155 bp. By constructing the overexpression vector， the MCL of Monascus was modified， thus to obtain the strain with high yield of pigment and low yield of citrinin.

Key words： Monascus; MpigE gene; Plasmid; Overexpression; Construct

紅曲霉是目前世界上唯一生產(chǎn)食用色素的微生物，廣泛應(yīng)用于制醋、制酒、醬油、飲料、腐乳、香腸、肉制品、蜜餞等食品中[1-4]。但自從1995年法國Blance等[5]在紅曲霉的發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)了桔霉素后，紅曲產(chǎn)品的安全性問題引起人們的廣泛關(guān)注。利用傳統(tǒng)的誘變、控制發(fā)酵條件等無法從根本上去除紅曲發(fā)酵過程中的桔霉素，因此，人們逐漸將目光轉(zhuǎn)向構(gòu)建基因工程菌這一途徑[6]。

目前基因的過表達(dá)技術(shù)在米曲霉、酵母菌等其他真菌中有較多的應(yīng)用，但在紅曲菌中的應(yīng)用還相對較少。2005年秦麗娜[7]成功構(gòu)建了釀酒酵母整合表達(dá)載體pUPGKAT（包括PGK強(qiáng)啟動子、釀酒酵母乙醇脫氫酶基因Ⅰ和CYC1終止子），并將其轉(zhuǎn)入原始菌株YS2△adh2重組菌株，結(jié)果表明構(gòu)建的新菌株乙醇產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了8.84%。2009年王斌等[8]構(gòu)建了米曲霉的重組表達(dá)載體pNMA-RML，并轉(zhuǎn)入米曲霉宿主菌A.oryzaeniaD300，得到整合型的陽性轉(zhuǎn)化子A.oryzaeONL。由于紅曲的次級代謝產(chǎn)物紅曲色素、桔霉素在合成途徑上有相關(guān)性，具有共同的前體，如果對產(chǎn)紅曲色素的相關(guān)基因進(jìn)行過表達(dá)可能可以增強(qiáng)紅曲產(chǎn)色素支路的代謝力度而降低產(chǎn)桔霉素的代謝力度，從而獲得高產(chǎn)色素而低產(chǎn)桔霉素的菌株，達(dá)到利用基因工程進(jìn)行分子育種的目的。目前已有研究表明pigR基因、MpigE基因均與紅曲色素的合成具有相關(guān)性[9-10]。

基因超表達(dá)技術(shù)作為一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)技術(shù)，是將目的基因的全長序列與高活性的組成型強(qiáng)啟動子或組織特異性強(qiáng)啟動子融合，從而構(gòu)建功能型表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)化獲得該基因產(chǎn)物大量積累的菌株[11-14]。在構(gòu)建超表達(dá)載體時，為了增強(qiáng)外源基因表達(dá)及增加表達(dá)載體在宿主內(nèi)的穩(wěn)定性需要慎重選擇啟動子及質(zhì)粒。本研究所選用的啟動子為PtrpC啟動子，通過重疊延伸PCR技術(shù)融合PtrpC啟動子、MpigE（目的）基因、TrpC終止子，并將融合的片段插入帶有潮霉素抗性的PSKH質(zhì)粒，構(gòu)建一個紅曲菌過表達(dá)載體。后期將再通過PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化構(gòu)建出基因工程菌，獲取高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素的菌株，從根本上解決紅曲產(chǎn)品的桔霉素含量超標(biāo)問題。

1?材料與方法

1.1?主要試劑材料

1.1.1?菌種與質(zhì)粒?紅曲霉MCL由實(shí)驗(yàn)室合作公司饋贈、DH5α大腸桿菌菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存、PSKH質(zhì)粒（帶有PtrpC啟動子、TrpC終止子及Hygromycin B抗性基因）由華中農(nóng)大饋贈、pMD 19T 載體購自Takara（大連）有限公司。

1.1.2?試驗(yàn)試劑?Ex Taq酶、T4 DNA連接酶、EcoR V限制性內(nèi)切酶、Spe I限制性內(nèi)切酶、DNA Marker購自Takara（大連）有限公司;RNaseA、潮霉素購自Sigma公司;Fungal DNA Kit 購自O(shè)mega公司;膠回收試劑盒購自Promega公司;氨芐青霉素購自生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品;PCR擴(kuò)增引物均由Primer Premier 5軟件設(shè)計完成后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3?主要培養(yǎng)基?麥芽汁（MES）液體培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取麥芽膏粉13.1 g溶于100 mL蒸餾水，pH自然，121℃滅菌15 min。麥芽汁（MES）固體培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取麥芽膏粉13.1 g，瓊脂2 g，溶于100 mL蒸餾水，pH自然，121℃滅菌15 min。MPPY培養(yǎng)基：4%葡萄糖，0.3%NaNO3，0.2%酵母浸粉，0.05%KCl，pH 6.8，121℃滅菌15 min。LB液體培養(yǎng)基：肉湯培養(yǎng)基2.5 g溶于100 mL蒸餾水，pH自然，1×105 Pa、121℃、滅菌20 min。LB固體培養(yǎng)基：瓊脂培養(yǎng)基3.4 g溶于100 mL蒸餾水，pH自然，1×105 Pa、121℃、滅菌20 min。

1.1.4?主要儀器設(shè)備?微波爐（GRANT）;潔凈工作臺（蘇州市安泰空氣技術(shù)有限公司）;數(shù)顯三用恒溫水浴箱（上海比朗儀器有限公司）;全自動新型鼓風(fēng)干燥箱

ZFD5090（上海智城分析儀器有限公司）;紫外可見分光光度計（上海美譜達(dá)）;PCR儀（美國 Applied Biosystems）;梯度PCR儀（美國 Applied Biosystems）;連接儀（DRY BATH）;凝膠成像系統(tǒng)（上海培清有限公司）。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?紅曲菌孢子懸液的制備?（1）將實(shí)驗(yàn)室斜面保存的紅曲菌MCL轉(zhuǎn)接至MES固體培養(yǎng)基中，30℃劃線培養(yǎng)3～4 d，待長出白色的單菌落。（2）挑取單菌落接種于MES液體培養(yǎng)基中，30℃、160 r·min-1，振蕩培養(yǎng)2 d。（3）吸取200 μL菌液涂布MES固體培養(yǎng)基，28℃靜置培養(yǎng)7～10 d。（4）待長出大量孢子后，用滅過菌的超純水輕輕洗脫孢子，并用500目雙層尼龍布過濾菌絲體。（5）用血球記數(shù)板測定孢子懸液濃度。

1.2.2?紅曲菌基因組DNA的提取?紅曲菌總DNA的提取采用Fungal DNA Kit進(jìn)行提取，具體步驟如下：（1）按照2.3.2 培養(yǎng)紅曲菌菌絲，用500目尼龍布過濾收集菌絲體。（2）滅菌的無菌水洗滌3次，濾紙擠壓干水分，將菌絲放入預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮迅速研磨成粉末狀。（3）將粉末分裝至2 mL離心管中（約1/3），立即加入600 μL Buffer FG1，震蕩搖勻。65℃水浴10 min（水域期間震蕩2～3次）。（4）加入140 μL Buffer FG2，震蕩搖勻，12000 r·min-1、4℃、離心10 min。（5）小心吸取上清液至新的離心管中，加入0.7體積的異丙醇，震蕩搖勻（這個步驟將去除大部分的多糖分子，通過提高DNA黏合物的容量來增加吸附柱的能力），12000 r·min-1、4℃、離心2 min。棄上清液，倒置離心管于濾紙上，1 min。（6）加入65℃遇熱的300 μL無菌去離子水，震蕩搖勻，65℃水浴短時間，促進(jìn)DNA 溶解，加入4 μL RNase，加入150 μL Buffer FG3，加300 μL無水乙醇，震蕩搖勻。（7）將所有試樣移至有柱子的離心管中（試劑盒自帶），12000 r·min-1、4℃、離心1 min。（8）將吸附柱移至新的離心管中，加入稀釋過的DNA Wash Buffer 700 μL，12000 r·min-1、4℃、離心1 min，棄收集管中的液體。（9）重復(fù)步驟11。（10）以最高轉(zhuǎn)速進(jìn)行空離2 min。（11）將柱子移至1.5 mL的離心管中，加入65℃預(yù)熱的無菌去離子水50 μL，室溫放置2～3 min，12000 r·min-1、4℃、離心2 min。

1.2.3?重疊延伸PCR引物設(shè)計?通過查找GenBank中公布的紅曲菌MpigE基因序列、PtrpC啟動子序列、TrpC終止子序列，利用重疊延伸PCR原理設(shè)計3對疊套引物用于PtrpC、MpigE、TrpC這3個片段的擴(kuò)增與融合。引物序列、酶切位點(diǎn)、產(chǎn)物長度見表1、圖1。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.4?MpigE基因片段、PtrpC啟動子片段、TrpC終止子片段的擴(kuò)增?重疊延伸PCR需要進(jìn)行兩輪PCR，第一輪通過普通PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增，依次獲得需要融合的目的片段。以紅曲菌基因組DNA為模板，用引物M1、M2擴(kuò)增MpigE基因片段;以PSKH質(zhì)粒為模板，用引物P1、P2擴(kuò)增PtrpC啟動子片段，引物T1、T2擴(kuò)增TrpC終止子片段。

1.2.5?PtrpC啟動子片段與MpigE基因片段的融合和PM片段與TrpC片段的融合?以PtrpC啟動子片段與MpigE基因片段為模板，P1為上游引物，M2為下游引物，采用重疊延伸PCR的方法進(jìn)行兩片段的融合PM片段;再將PM片段與TrpC片段的融合片段稱之為PMT片段。PMT片段再與pMD19T載體連接構(gòu)成重組質(zhì)粒PMT19，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，送往上海生工進(jìn)行測序分析。

1.2.6?紅曲菌過表達(dá)載體的構(gòu)建?紅曲菌過表達(dá)載體構(gòu)建見圖2。

1.2.6.1?PMT19質(zhì)粒的雙酶切?將PMT19質(zhì)粒用EcoR V和Spe I兩種限制性內(nèi)切酶按照表2酶切體系進(jìn)行雙酶切。

反應(yīng)溫度：37℃;反應(yīng)時間：4～5 h。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，驗(yàn)證成功后擴(kuò)大酶切體系為50 μL，并用切膠回收試劑盒目的片段。

1.2.6.2?PSKH質(zhì)粒的EcoR V、Spe I雙酶切?因?yàn)樵赑SKH質(zhì)粒上EcoR V和Spe I兩種限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)相距較近，因此采用分步酶切的方法。

（1）用限制性內(nèi)切酶EcoR V按照表3酶切體系進(jìn)行酶切。

反應(yīng)溫度：37℃;反應(yīng)時間：4～5 h。

（2）用限制性內(nèi)切酶Spe I按照表4的酶切體系進(jìn)行酶切。

反應(yīng)溫度：37℃;反應(yīng)時間：4～5 h：酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，驗(yàn)證成功后擴(kuò)大酶切體系為50 μL，并用膠回收試劑盒方法回收雙酶切后的質(zhì)粒。

（3）重組過表達(dá)載體HPMT。經(jīng)過雙酶切的PMT片段與用相同內(nèi)切酶酶切的PSKH質(zhì)粒連接成為過表達(dá)載體HPMT，其連接體系如表5。

（4）紅曲菌過表達(dá)載體HPMT的鑒定。①重組質(zhì)粒電泳大小鑒定。質(zhì)粒提取用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，檢測條帶的位置，并以質(zhì)粒PSKH作對照，比較兩個質(zhì)粒大小差異，判斷PMT片段是否插入。②重組質(zhì)粒酶切鑒定。按表2的雙酶切體系進(jìn)行驗(yàn)證。

2?結(jié)果與分析

2.1?紅曲菌MCL培養(yǎng)效果及其總DNA提取

從紅曲菌MCL的培養(yǎng)效果（圖3）可以看出紅曲菌MCL在MES培養(yǎng)基上長勢良好，菌落蔓延幅度較大，菌落結(jié)構(gòu)有不規(guī)則的輻射紋。從其長勢可斷定，已經(jīng)產(chǎn)生孢子。按照Fungal DNA Kit所示步驟提取紅曲菌基因組DNA，并進(jìn)行凝膠電泳檢測見圖4。

2.2?MpigE基因片段、PtrpC啟動子片段、TrpC終止子片段擴(kuò)增鑒定結(jié)果

以紅曲菌MCL基因組DNA為模板，以M1和M2為上下游引物，分別在50.0℃、50.8℃、51.9℃、53.3℃、54.8℃、56.5℃、58.1℃、59.7℃、61.0℃、61.9℃不同退火溫度下擴(kuò)增MpigE基因片段，結(jié)果見圖5。

從圖5可以看出在10個不同的退火溫度下均在1000 bp偏上處擴(kuò)增出一條清晰、單一的目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與目的片段基本完全一致。將擴(kuò)增到的MpigE基因片段送往上海生工測序，測序結(jié)果見圖6，輸入NCBI進(jìn)行blast分析，其測序結(jié)果與Genebank中公布的序列100%同源。

提取PSKH質(zhì)粒，其電泳圖譜見圖7。以提取的PSKH質(zhì)粒為模板， P1和P2為上下游引物擴(kuò)增PtrpC啟動子片段，T1和T2為上下游引物擴(kuò)增TrpC終止子片段。退火溫度設(shè)置為：55℃、58℃、60℃，其結(jié)果見圖8。

從圖7可以看出，PSKH質(zhì)粒的提取成功，約在5000 bp處看到清晰的條帶，與PSKH質(zhì)粒的5081 bp一致。從圖8可以看出，在3個不同的退火溫度下均分別在約400 bp和700 bp處擴(kuò)增出目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與PtrpC啟動子片段、TrpC終止子片段大小基本一致，但退火溫度為55℃及60℃時其條帶更為清晰。將擴(kuò)增到的PtrpC啟動子片段、TrpC終止子片段送往上海生工測序，測序結(jié)果見圖9、10，輸入NCBI進(jìn)行blast分析，其測序結(jié)果與Genebank中公布的序列100%同源。

2.3?PtrpC啟動子片段與MpigE基因片段融合的鑒定結(jié)果

以PtrpC啟動子片段與MpigE基因片段為模板，P1為上游引物，M2為下游引物，采用重疊延伸PCR的方法進(jìn)行兩片段的融合，退火溫度設(shè)置為：50℃、55℃、58℃、60℃，其結(jié)果見圖11。從圖11可以看出，在以50℃、58℃的退火溫度下均在約1500 bp處擴(kuò)增出清晰、單一的目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期完全吻合。

2.4?PM片段與TrpC片段融合的鑒定結(jié)果

以PM片段與TrpC片段為模板， P1和T2為上下游引物，分別在50.0℃、51.9℃、53.3℃、54.8℃、56.5℃、58.1℃、59.7℃、61.0℃、61.9℃這9個不同的退火溫度下擴(kuò)增PMT片段，結(jié)果見圖12。從圖12可以看出9個不同的退火溫度下均在約2100 bp處擴(kuò)增出清晰、單一的目的條帶條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期完全吻合，以50℃為退火溫度時其目的條帶最亮。

2.5?融合片段PMT的鑒定結(jié)果

將融合得到的PMT片段連入pMD19T 載體中構(gòu)成重組載體PMT19，其電泳結(jié)果如圖13所示。用EcoR V和Spe I兩種限制性內(nèi)切酶對載體PMT19進(jìn)行雙酶切，其電泳結(jié)果如圖14所示。從圖13和圖14可以看出在5000 bp偏下處有清晰的條帶，這與PMT19的大小一致。pMD19T 載體的大小為2692 bp，EMP片段的長度為2102 bp，從圖15可見2500 bp上下各有1條清晰的條帶，因此可以初步表明PMT片段克隆成功。

2.6?過表達(dá)載體PSKH構(gòu)建結(jié)果

2.6.1?過表達(dá)質(zhì)粒HPMT菌液PCR鑒定結(jié)果?用EcoR V和Spe I兩種限制性內(nèi)切酶對載體PMT19進(jìn)行雙酶切獲得具有黏性末端的PMT片段，用相同的限制性內(nèi)切酶酶切PSKH質(zhì)粒，用T4連接酶連接構(gòu)成重組質(zhì)粒HPMT，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，以M1、M2為上下游引物進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證。其電泳結(jié)果如圖16所示。初步驗(yàn)證PMT片段與PSKH質(zhì)粒連接成功。

2.6.2?過表達(dá)質(zhì)粒HPMT電泳鑒定結(jié)果?為了進(jìn)一步驗(yàn)證重組載體HPMT的正確性，用EcoR V和Spe I兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。雙酶切后應(yīng)出現(xiàn)1條2102 bp大小的片段和1條5018 bp大小的片段。雙酶結(jié)果如圖17所示，從圖17可以看出目的條帶的大小都與預(yù)期相符，由此可知過表達(dá)載體構(gòu)建成功。

3?結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以福建紅曲菌MCL為出發(fā)菌株，成功提取該紅曲菌基因組DNA，以此為模板克隆過表達(dá)的目的片段。以PSKH質(zhì)粒為模板克隆PtrpC啟動子及TrpC終止子。通過重疊延伸PCR技術(shù)融合PtrpC啟動子、目的基因、TrpC終止子，該方法避免了采用限制性內(nèi)切酶消化和連接酶連接等繁復(fù)的過程，直接通過多次PCR反應(yīng)便可得到目的片段。為了驗(yàn)證融合片段PMT的正確性，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，在2100 bp左右出現(xiàn)單一且清晰的條帶，初步驗(yàn)證融合成功。進(jìn)一步將PMT片段與pMD19T載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dh5α，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果表明所克隆的融合片段PMT完全正確。通過EcoR V和Spe I酶切PMT片段，插入帶有潮霉素抗性的PSKH質(zhì)粒的EcoR V和Spe I位點(diǎn)，構(gòu)建1個紅曲菌過表達(dá)載體HPMT，大小為7155 bp，并通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定及質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證表明過表達(dá)載體構(gòu)建成功。后期將再通過PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化構(gòu)建出基因工程菌，獲取高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素的菌株，從根本上解決紅曲產(chǎn)品的桔霉素含量超標(biāo)問題。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）