基于非靶向代謝組學的沉水樟內(nèi)源生根抑制物分析

鄒顯花，胡亞楠，孫雪蓮，黃勇來，溫素蕓，吳文景，馬祥慶,2

(1. 福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州 350002；2. 人工林可持續(xù)經(jīng)營福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002；3. 福建建甌市林業(yè)局種苗站，南平 建甌 353100；4. 福建建甌市南雅林業(yè)站，南平 建甌 353101)

沉水樟（Cinnamomum micranthum(Hay.)Hay）是我國樟科植物中含油量最高的速生經(jīng)濟樹種，在醫(yī)藥、化工方面具有廣泛用途，且其木材纖維長，是造紙業(yè)的優(yōu)良原料，同時也是水源涵養(yǎng)和園林綠化的優(yōu)良樹種[1-2]。然而，由于沉水樟種子發(fā)育周期長、種子產(chǎn)量低、質(zhì)量差、病蟲害多，果實成熟后空殼率高達75% 以上，且種子多油、壽命短、難貯存、發(fā)芽率低，沉水樟天然更新極其困難[3]。由于沉水樟資源銳減，1982 年被列入國家Ⅲ級重點保護植物。通過有性繁殖獲得沉水樟苗木十分有限，極大地限制了沉水樟人工造林的規(guī)模[3]。因此，沉水樟扦插育苗技術體系的建立對于培育大量優(yōu)質(zhì)沉水樟苗木、擴大沉水樟種群規(guī)模都具有十分重要的意。近年來，大量學者對于影響沉水樟扦插繁殖成活率的穗條來源、基質(zhì)成分、扦插時間、化學藥劑處理等因素展開了大量研究[4-9]。目前，沉水樟扦插成活率介于50% ～ 74% 間，扦插成活率低始終是困擾沉水樟扦插繁殖技術的關鍵制約因子。

有研究報道，難生根樹種插穗內(nèi)存在阻礙生根的物質(zhì)是導致其生根率低的重要因素之一[10]。目前，在許多植物插穗中都已發(fā)現(xiàn)了生根抑制物質(zhì)的存在。李永進等[10]對不同家系馬尾松（Pinus massonianaLamb.）插穗研究發(fā)現(xiàn)，馬尾松插穗生根率低的內(nèi)部因素之一是插穗中存在黃酮類、苯酚類和脫落酸類等活性較高的內(nèi)源抑制物質(zhì)。王芳等[11]以梭梭（Haloxylon ammodendron(C. A. Mey.)Bunge）嫩枝和硬枝為試驗材料，驗證了其體內(nèi)生根抑制物的存在，主要可能存在酸性物質(zhì)、堿性物質(zhì)和酚類物質(zhì)。郭素娟等對難生根樹種插穗浸提液進行分析，發(fā)現(xiàn)其中大多數(shù)都含有類似于有機酸、單寧或有關成分的酸性物質(zhì)[12]。此外，難生根植物不同部位的生根抑制物活性并不相同，梭梭嫩枝下部的生根抑制物活性較中上部弱，木質(zhì)部中的活性較韌皮部弱[11]。 紫杉（ Taxus cuspidata (Pilger)Rehd.）也表現(xiàn)為韌皮部的生根抑制物含量最多，其次是針葉，木質(zhì)部很少[13]。同時，枝齡也是影響生根抑制物含量的重要因素之一，紫杉1 年生插穗中酚類物質(zhì)含量最高，3 年生含量最少[13]。鄧恩桉（Eucalyptus dunnii Maiden）[14]則表現(xiàn)為成樹莖段提取液的生根抑制強度比萌枝及幼苗的莖段提取液更強?？梢姡煌y生根植物的體內(nèi)生根抑制物的種類及分布部位均存在較大差異。

鑒于此，本文對不同枝齡沉水樟穗條的不同組織浸提液進行內(nèi)含物的非靶向LC-MS 檢測，明確沉水樟穗條是否存在生根抑制物及其存在部位與枝齡間的差異，并結合扦插試驗驗證不同枝齡穗條的扦插效果，探討內(nèi)源生根抑制物對沉水樟扦插生根的影響，為闡明沉水樟扦插生根的阻礙機制奠定研究基礎，從而為提升沉水樟扦插育苗技術提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料取自建甌市林業(yè)推廣中心后山的6 年生沉水樟母樹林，屬中亞熱帶海洋季風氣候區(qū)，氣候溫暖，雨水充沛，海拔160 m，年平均氣溫18.9℃，年降水量1 662.5 mm 左右，相對濕度81%，無霜期270～290 d。于2017 年5 月，從同一植株分別剪取1 年生、2 年生、3 年生與多年生4 個枝齡的穗條，共重復剪取10 株的穗條。剪取的穗條帶回實驗室后，將各枝齡穗條的韌皮部與木質(zhì)部分開，放入60℃烘箱中殺青，烘至恒質(zhì)量。材料烘干后，用剪刀先剪成適宜大小的小段或小片，然后用高速粉碎機磨碎樣品，包好放入干燥器中備用。

1.2 研究方法

1.2.1 穗條浸提液制備的浸提時間確定 分別稱取5 g 的1 年生穗條的磨碎樣（整根穗條，未區(qū)分不同組織部位）放入提取瓶中，加入100 mL 蒸餾水，間隔2 h 搖勻1 次，分別浸提12、24、36、48、72 h 后過濾到棕色瓶中，加蒸餾水重新定容到100 mL，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。利用白?Brassica pekinensis (Lour.) Rupr.) 種子發(fā)芽試驗來確定浸提液制備過程中應選擇的獲得抑制效果最好的浸提時間，白菜種子購于市場。

向墊有2 層發(fā)芽紙的培養(yǎng)皿（d=15 cm）中加入浸提液（蒸餾水作為對照CK），將50 粒白菜種子置于其上，于25℃培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽試驗，每個浸提時間處理3 個重復。每天統(tǒng)計白菜種子的發(fā)芽率（胚根長度≥0.2 cm，胚芽長度0.5 cm 時即為發(fā)芽），測定發(fā)芽3 d 的根長、苗高（從根尖到莖尖），并以此計算發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)。

發(fā)芽指數(shù)（GI）＝∑（Gt/Dt）

活力指數(shù)（VI）＝S×GI

式中：Dt 為發(fā)芽時間，Gt 為與Dt 相對應的每天發(fā)芽種子數(shù)，S 為根長。

1.2.2 不同枝齡穗條的不同組織浸提液的制備在1.2.1 確定了浸取液制備的最佳浸提時間的基礎上，對不同枝齡（1 年、2 年、3 年與多年生）穗條的木質(zhì)部與韌皮部2 個組織部位進行浸提液的提取。分別稱5 g 的不同枝齡穗條不同組織部位的磨碎樣品，放入提取瓶中，加入100 mL 蒸餾水，間隔2 h 搖勻1 次，浸提48 h（根據(jù)1.2.1 的測定結果確定）后過濾到棕色瓶中，加蒸餾水重新定容到100 mL，放入5℃冰箱中保存?zhèn)溆?，每個樣品重復浸提3 次。

1.2.3 不同枝齡穗條的不同組織浸提液LC-MS分析

1.2.3.1 樣本預處理 樣本凍干后加入1 mL 水和4 mL 甲醇(默克公司，達姆施塔特，德國)，渦旋混勻后取出1 mL 混合液，加入10 μL 2.5 mg·mL－1的2-氯苯丙氨酸（GL 生物公司，上海，中國）作為內(nèi)標。渦旋混勻30 s，而后置于4°C 離心機中，12 000 rpm 離心15 min。吸取200 μL 上清液，轉入進樣小瓶中待LC-MS 檢測分析。

1.2.3.2 LC-MS 分析 儀器分析平臺：LC- MS（Thermo, Ultimate 3000LC, Orbitrap Elite）；色譜柱 ： C18色 譜 柱 （ Hypergod C18 (100×4.6 mm,3 μm)）；色譜分離條件為：柱溫為40°C；流速0.3 mL·min－1；流動相組成A：水（Milli-Q Advantage A10，默克公司，德國）+0.1% 甲酸(CNW，上海，中國)，B：乙腈(默克公司，達姆施塔特，德國)+0.1% 甲酸；進樣量為4 μL，自動進樣器溫度4°C。流動相梯度洗脫程序見表1。質(zhì)譜檢測參數(shù)：加熱器溫度300°C；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.0 KV；毛細管溫度：350°C；S-Lens RF Level：30%。

表1 流動相洗脫程序Table 1 The gradient of mobile phase

1.2.3.3 儀器穩(wěn)定驗證 樣本提取后，每個樣本取5 μL 進行合并，得到 QC（quality control，質(zhì)量控制）樣本，檢測時每隔一定數(shù)量的樣本進一針QC 樣品，通過QC 樣品色譜圖的重疊情況來檢驗儀器的穩(wěn)定性。對QC 樣品的總離子流色譜圖（TIC）進行重疊（圖1），可見，儀器的保留時間重現(xiàn)性較好，儀器穩(wěn)定，儀器分析和數(shù)據(jù)的結果有較高的可靠性。隨機選取不同枝齡的沉水樟穗條不同組織浸提液樣本的總離子流色譜圖（TIC）見圖2，可見不同枝齡的沉水樟穗條不同組織的內(nèi)含物種類總體相同，但含量存在一定的差異。

1.2.3.4 數(shù)據(jù)分析 使用SIEVE 軟件（Thermo 公司）對LC-MS 檢測數(shù)據(jù)進行提取和預處理，并在Excel 2010 中對數(shù)據(jù)進行歸一化及后期編輯，最后整理成二維數(shù)據(jù)矩陣形式，包含保留時間（Retention time，RT）、分子量（CompMW）、觀察量（樣本名稱）、可提取物質(zhì)個數(shù)（ID）和峰強度等信息。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導入SIMCA-P 13.0（Umetrics AB，Umea，Sweden）軟件，采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)及正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA) 等數(shù)據(jù)處理方法對不同枝齡的沉水樟穗條不同組織樣本進行分析，進一步確定差異性化合物。

1.2.3.5 差異性內(nèi)含物的挖掘及鑒定 采用OPLS-DA模型的VIP（Variable Importance in the Projection）值（閾值＞1），并結合t-test 的p值（p＜0.05）來尋找差異性表達代謝物。差異性代謝物的定性方法為：搜索在線數(shù)據(jù)庫（Metlin 數(shù)據(jù)庫、HMDB 數(shù)據(jù)庫、Thermo 數(shù)據(jù)庫），通過檢測到的分子量及二級碎片、保留時間、質(zhì)量偏差（ppm＜10）進行物質(zhì)定性。

圖1 QC 樣本總離子流色譜圖Fig. 1 Total Ion Chromatogram of QC

圖2 不同枝齡的沉水樟穗條不同組織樣本離子流色譜圖Fig. 2 Total Ion Chromatogram from the different tissues of Cinnamomum micranthum cuttage with different ages

1.2.4 不同枝齡穗條的扦插效果調(diào)查 同1.1 剪取的不同枝齡穗條，剪取時留半片葉、穗條上端至少有1～2 個腋芽。穗條基部下切口采取雙削的方式，穗條粗度以0.2～0.5 cm，長度以5～8 cm 為宜。一個枝齡穗條100 根，將穗條置入100 ×10－6（100 mg·L－1）的生根粉ABT-1#中浸泡16 h[4]。扦插基質(zhì)為黃心土，扦插后60 d 進行生根率的調(diào)查，計算平均生根率、平均根數(shù)與平均根長。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS（ 11.5） 進行數(shù)據(jù)的方差分析，Orign8.5 軟件進行圖表的繪制。

2 結果與分析

2.1 浸提液制備的浸提時間確定

利用沉水樟穗條的浸提液對白菜種子進行不同時間長度的處理，同時以清水處理為對照，統(tǒng)計白菜種子的發(fā)芽情況。結果（表2）表明：清水處理的白菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及白菜苗的根長均顯著優(yōu)于沉水樟穗條浸提液處理（P＜0.05），對照苗高也高于穗條浸提液處理。由此驗證了沉水樟穗條中生根抑制物質(zhì)的存在。不同浸提時間比較可見，穗條浸提液處理12、24、36 h的白菜種子發(fā)芽指標間均差異不顯著（P＞0.05）；而浸提液處理48 h 的白菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)顯著降低，發(fā)芽后的根長及苗高等生長指標也低于對照與其它處理。隨著處理時間的延長，浸提液處理72 h的白菜種子的發(fā)芽指標又呈回升趨勢?？梢?，沉水樟穗條浸提液處理白菜種子48 h 的發(fā)芽抑制作用最明顯，說明浸提48 h 時穗條內(nèi)的生根抑制物提取的最為充分。因此，沉水樟不同枝齡穗條不同組織的浸提液制備時可采用浸提時間48 h。

2.2 沉水樟不同枝齡穗條不同組織的差異內(nèi)含物比較

2.2.1 總體PCA 分析 為了判別兩組樣本之間是否具有差異，采用PCA 建模方法對樣本進行分析，利用R2X（模型的解釋率）與Q2（模型的預測率）判定模型的質(zhì)量，結果顯示：模型的累積R2X=0.836，Q2=0.657，說明該模型穩(wěn)定可靠。PCA得分圖（圖3）所示：QC 樣本沒有明顯分離，表明本試驗重復性好，試驗中獲得的內(nèi)含物差異能反映樣本間自身的生物學差異。此外，PCA 結果能明顯區(qū)分韌皮部與木質(zhì)部的內(nèi)含物，韌皮部與木質(zhì)部的內(nèi)含物分布在不同區(qū)域，木質(zhì)部的內(nèi)含物位于第1 主成分的軸線往正軸方向，位于第2 主成分的正軸位置，韌皮部內(nèi)含物主要位于第1 主成分的軸線往負軸方向，位于第2 主成分的負軸位置，可見不同組織的內(nèi)含物有明顯差別。

2.2.2 沉水樟同一枝齡穗條不同組織的差異內(nèi)含物比較 通過非靶向的LC-MS 分析沉水樟不同枝齡不同組織的浸提液共檢測得到2 307 個物質(zhì)信號，對這些信號進行篩選，經(jīng)過標準樣品、數(shù)據(jù)庫和參考文獻比對得出，1、2、3 年生與多年生穗條的木質(zhì)部與韌皮部的差異內(nèi)含物個數(shù)分別為94、80、74、76 個。對不同差異內(nèi)含物進行歸類，沉水樟同一枝齡穗條不同組織的差異內(nèi)含物的比較見圖4。除了芹菜苷、姜辣素、槲皮素等其他內(nèi)含物外，在不同枝齡不同組織浸提液中檢測出的差異內(nèi)含物主要有：有機酸類、酚類、維生素、磷脂類、植物激素及糖類等物質(zhì)。

表2 不同浸提時間下沉水樟穗條浸提液對白菜種子發(fā)芽情況的影響比較 Table 2 Effect of extracts at different leaching time from cuttings of Cinnamomum micranthum on seed germination of Brassica pekinensis

圖3 總PCA 得分圖Fig. 3 The PCA scores

不同差異內(nèi)含物比較可見，1～3 年生枝齡穗條木質(zhì)部及韌皮部所含的酚類物質(zhì)及有機酸類物質(zhì)的相對峰面積均顯著高于其他物質(zhì)（P＜0.05），其中，酚類物質(zhì)的相對峰面積最大。多年生穗條韌皮部的酚類及有機酸類物質(zhì)的相對峰面積也顯著高于其他物質(zhì)（P＜0.05），木質(zhì)部則表現(xiàn)為有機酸類的相對峰面積最大，酚類的相對峰面積大于維生素、磷脂類、植物激素及糖類等物質(zhì)，但差異不顯著性。不同枝齡穗條木質(zhì)部及韌皮部所含的維生素、磷脂類、植物激素及糖類等物質(zhì)的相對峰面積之間的無顯著差異（P＞0.05）。

不同組織比較可見，不同枝齡穗條韌皮部的酚類物質(zhì)相對峰面積均表現(xiàn)為顯著高于木質(zhì)部（P＜0.05），有機酸類、維生素、磷脂類、植物激素及糖類等物質(zhì)在韌皮部及木質(zhì)部的相對峰面積無顯著差異（P＞0.05）。

圖4 沉水樟穗條不同組織的差異內(nèi)含物比較Fig. 4 Comparison of different containing substances in different tissues of Cinnamomum micranthum cuttage

2.2.3 沉水樟不同枝齡穗條的同一組織的差異內(nèi)含物比較 以1 年生穗條的內(nèi)含物作為對照，2、3 年生、多年生穗條木質(zhì)部與1 年生穗條木質(zhì)部的差異內(nèi)含物個數(shù)分別為53、47、61 個，2、3 年生、多年生穗條韌皮部與1 年生穗條韌皮部的差異內(nèi)含物個數(shù)分別為60、60、68 個。對差異內(nèi)含物進行歸類，并以1 年生穗條內(nèi)含物作為對照，不同枝齡穗條的差異內(nèi)含物的相對豐度比較見圖5?？梢?，除了其他物質(zhì)外，不同枝齡木質(zhì)部的差異內(nèi)含物主要檢測到有機酸類、酚類、維生素、植物激素、磷脂類、糖類等物質(zhì)，韌皮部的差異內(nèi)含物則主要有有機酸類、酚類、維生素、植物激素、糖類等物質(zhì)（圖5）。

圖5 不同枝齡沉水樟穗條的差異內(nèi)含物比較Fig. 5 Comparison of different containing substances in the cuttage with different ages of Cinnamomum micranthum

不同枝齡穗條木質(zhì)部的差異內(nèi)含物比較可見，不同枝齡穗條木質(zhì)部的有機酸類及酚類物質(zhì)的相對豐度均表現(xiàn)為2 年生、3 年生及多年生的小于1 年生的穗條，其中，有機酸類在不同枝齡間的差異不顯著（P＞0.05），酚類物質(zhì)則隨著枝齡的增加呈減少趨勢，多年生穗條木質(zhì)部的酚類含量顯著低于其他年齡的穗條。

韌皮部的有機酸類物質(zhì)含量也表現(xiàn)為其他枝齡的相對豐度顯著低于1 年生穗條（P＜0.05），酚類物質(zhì)則表現(xiàn)為2 年生穗條的相對豐度顯著高于其他枝齡穗條（P＜0.05）。此外，沉水樟不同枝齡穗條中的營養(yǎng)物質(zhì)糖類的變化規(guī)律較明顯，木質(zhì)部與韌皮部的糖含量均表現(xiàn)為隨著枝齡增加呈逐漸增加趨勢。

2.3 沉水樟不同枝齡穗條的扦插效果比較

沉水樟不同枝齡穗條的扦插效果比較（表3）可見：1 年生穗條的扦插效果最優(yōu)，其平均生根率與平均根長均顯著高于其他枝齡的穗條（P＜0.05），平均生根數(shù)除與2 年生的差異不顯著外，顯著高于3 年生與多年生枝條（P＜0.05）。不同枝齡穗條的平均生根率、平均生根數(shù)及平均根長總體上均表現(xiàn)為隨著枝齡的增加而逐漸減少，其中，多年生的穗條并未生根，扦插成活率為零?？梢姡c生根抑制物含量的變化規(guī)律不同，不同枝齡穗條的扦插效果表現(xiàn)為隨著枝齡的增加而減弱。

表3 沉水樟不同枝齡穗條的扦插效果比較Table 3 Comparison of the rooting effect of Cinnamomum micranthum cuttage with different ages

3 討論

3.1 沉水樟穗條中生根抑制物種類的挖掘與鑒定

植物不定根的發(fā)生是一個極其復雜的生理生化過程，它的誘導、發(fā)生和形成與解剖學結構、內(nèi)源生長素或其他促根物質(zhì)、內(nèi)源抑制物等多種生理反應相關[15]，其中，內(nèi)源抑制物的存在成為限制難生根樹種插穗不定根形成的關鍵因素之一。郭素娟綜合早期關于林木扦插生根的生理學研究發(fā)現(xiàn)，難生根樹種插穗浸提液中主要含有類似于有機酸、單寧等成分的生根抑制物[12]。近年來，隨著無性系林業(yè)的發(fā)展，眾多學者針對難生根樹種的扦插生根機理開展相應研究。季孔庶等[16]對馬尾松研究發(fā)現(xiàn)，馬尾松內(nèi)源抑制物主要屬于黃酮類與苯酚類。除黃酮類與苯酚類外，李永進等[10]在不同家系馬尾松中均檢測出脫落酸類的存在。劉艷[17]對梭梭種子不同部位的萌發(fā)抑制物生物測定表明，梭梭種子浸提液中含有17 種可能的發(fā)芽抑制物，其中主要為有酚類。王芳等[11]也證實梭梭中存在酸性物質(zhì)、堿性物質(zhì)和酚類物質(zhì)等活性較高的生根抑制物。此外，在紫杉[13]、油茶（Camellia oleifera Abel.）[18-19]、桉樹（Eucalyptus robusta Smith）等[14,20-22]樹種中均表現(xiàn)為酚類為主要抑制物。綜合可見，酸類物質(zhì)與酚類物質(zhì)是抑制植物生根的主要物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，沉水樟穗條的韌皮部與木質(zhì)部的差異內(nèi)含物中的酚類及有機酸類含量顯著高于其他物質(zhì)，其中，酚類物質(zhì)的相對峰面積較大?？梢?，沉水樟穗條中可能存在大量的酚類與酸類生根抑制物。

為進一步探究沉水樟穗條中的生根抑制物種類，本研究結合己報道的生根抑制化合物，選擇2 年生穗條韌皮部（酚類物質(zhì)的相對豐度最高）的內(nèi)含物進行挖掘分析?？梢姡诔了了霔l中主要存在水楊酸、香豆素、對羥基肉桂酸、間苯三酚、苯甲醛、香草酸、綠原酸、脫落酸、丁香酸、沒食子酸等生根抑制物，且檢測到的各物質(zhì)峰面積逐漸減?。ū?）。有研究認為，多數(shù)抑制物質(zhì)在不同濃度下所起抑制作用不同，通常同一種抑制物在高濃度時表現(xiàn)為發(fā)芽抑制作用，而在低濃度時表現(xiàn)為發(fā)芽促進作用，如有研究證實，低濃度的水楊酸溶液具有誘導不定根形成和促進根系生長的作用，且在一定范圍內(nèi)隨濃度的增加， 效應加強[23-25]；但高濃度的水楊酸溶液不但會抑制生根，而且對幼苗有傷害作用[26-28]。在沉水樟穗條中檢測到的水楊酸峰面積相對較高，其在沉水樟扦插過程中所起的效應還有待進一步的驗證。所以，在對沉水樟穗條內(nèi)源生根抑制物初步探討的基礎上，下一階段研究應針對主要生根抑制物進行驗證試驗，進一步明確沉水樟穗條中的內(nèi)源生根抑制物質(zhì)種類。

表4 沉水樟穗條中可能存在的生根抑制物種類 Table 4 The variety of rooting inhibitors in Cinnamomum micranthum cuttage

3.2 沉水樟穗條中生根抑制物的分布及其效應分析

研究表明，植物不同部位的生根抑制物活性不同。本研究對沉水樟穗條的不同組織比較發(fā)現(xiàn)，不同枝齡穗條韌皮部的酚類物質(zhì)相對峰面積均表現(xiàn)為顯著高于木質(zhì)部，而有機酸類、維生素、磷脂類、植物激素及糖類等物質(zhì)在韌皮部及木質(zhì)部的相對峰面積無顯著差異?？梢?，沉水樟穗條的生根抑制物可能主要分布在韌皮部，這與前人在梭梭[11]、紫杉等[13] 的研究結果一致。此外，不同枝齡的穗條比較發(fā)現(xiàn)，除韌皮部的酚類物質(zhì)表現(xiàn)為2 年生穗條最高外，韌皮部的有機酸及木質(zhì)部的有機酸與酚類均表現(xiàn)為1 年生穗條顯著高于其他枝齡，不同枝齡穗條的有機酸與酚類含量隨枝齡增加呈逐漸減少的趨勢。程廣有[13]對紫杉的生根抑制物鑒定也發(fā)現(xiàn)，其不同枝齡的插穗酚類物質(zhì)表現(xiàn)為1 年生插穗中含量最高，3 年生含量最少。王芳等[11]的研究結果也顯示3 年生硬枝的生根抑制物質(zhì)較1 年生和2 年生硬枝的少。這可能是穗條離體的刺激、激素的調(diào)節(jié)等作用，促使插穗內(nèi)的有機物質(zhì)向有益于生根方向轉化，同時插穗內(nèi)原有的生根抑制物質(zhì)也相應被轉化[13]。筆者推測，沉水樟枝條在由當年萌生枝條至2 年生枝條的成熟過程中，枝條中的生根抑制物含量隨著枝條的成熟逐漸升高，2 年生的枝條生根抑制物含量達到最大，待枝條成熟后，生根抑制物逐漸轉移或轉化，含量減少并趨于穩(wěn)定。

本研究通過沉水樟穗條的扦插效果調(diào)查發(fā)現(xiàn)，沉水樟不同枝齡穗條中，1 年生穗條的扦插效果最優(yōu)，隨著枝齡的增加穗條的扦插成活率逐漸降低，多年生穗條的成活率為零。這與鄧恩桉[14]、核桃楸（ Juglans mandshurica Maxim.）[42]、 落 葉 松（Larix gmelinii (Rupr.) Kuzen.）[43]穗條扦插生根試驗結果一致。而與上述酚類與酸類生根抑制物在不同枝齡穗條中的變化規(guī)律并無明顯的負相關關系。筆者推測雖然沉水樟穗條的枝齡越高其體內(nèi)酚類與酸類等生根抑制物越少，然而枝齡越高，其木質(zhì)化程度越高，生理活動弱，且定芽少，在穗條上形成的不定芽萌發(fā)能力差，插口不易形成愈傷組織，造成扦插成活率越低[5]?？梢?，插穗的生根是穗條發(fā)育程度、解剖構造與穗條內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)、酶活性、激素含量以及生根抑制物質(zhì)含量等眾多因素的綜合調(diào)控結果，隨著枝齡的增加，沉水樟插穗內(nèi)的生根抑制物含量不再是影響其生根效應的主導因子，而沉水樟的扦插生根機理有待進一步的綜合多方面因子深入研究。

4 結論

本研究基于非靶向LC-MS 分析方法，對不同枝齡沉水樟穗條的不同組織浸提液進行內(nèi)含物檢測發(fā)現(xiàn)：

（1）不同枝齡穗條木質(zhì)部及韌皮部所含的差異內(nèi)含物中，總體上表現(xiàn)為酚類及有機酸類物質(zhì)的相對峰面積顯著高于其他物質(zhì)，其中，除多年生穗條的木質(zhì)部外，酚類物質(zhì)的相對峰面積均最大。

（2）不同枝齡穗條的韌皮部的酚類物質(zhì)相對峰面積均表現(xiàn)為顯著高于木質(zhì)部，不同枝齡比較發(fā)現(xiàn)，除韌皮部的酚類物質(zhì)表現(xiàn)為2 年生穗條最高外，韌皮部的有機酸及木質(zhì)部的有機酸與酚類均表現(xiàn)為1 年生穗條顯著高于其他枝齡，且不同枝齡穗條的有機酸含量隨枝齡增加呈逐漸減少的趨勢，酚類也表現(xiàn)為多年生＜3 年生＜1 年生。

（3）沉水樟不同枝齡穗條中，1 年生穗條的扦插效果最優(yōu)，且隨枝齡的增加扦插成活率逐漸降低。可見，在影響插穗生根的眾多因子中，內(nèi)源生根抑制物的作用隨著枝齡的增加呈降低的趨勢。由此，下一階段的研究也將綜合各影響因子對沉水樟的扦插生根機理展開更全面的探討。