不同品種油茶根際叢枝菌根真菌群落結(jié)構(gòu)特征

林宇嵐，李正昀，吳 斐，裴 蘊(yùn)，張 揚(yáng)，張林平，楊 瀅，譚明曦

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 鄱陽湖流域森林生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與修復(fù)國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

油茶（Camellia oleifera Abel.）又稱茶子樹，屬于山茶科、山茶屬植物，是我國南方丘陵地區(qū)重要的木本油料樹種[1]。油茶籽所榨茶油中含有大量不飽和脂肪酸，具有降低血脂、降低膽固醇、保護(hù)心血管系統(tǒng)等功效[2]。此外，油茶也是防風(fēng)固沙和保持水土的重要樹種[3]。截止2017 年底，我國油茶種植面積已擴(kuò)大到443 萬多hm2[4]。然而，在油茶林經(jīng)營過程中，大量不合理施肥已造成生態(tài)環(huán)境質(zhì)量下降，引起的土壤重金屬含量過高、土壤環(huán)境酸化板結(jié)等問題日益突出[5]。因此，提高化肥利用效率，降低施用量，恢復(fù)退化土壤已成為我國油茶產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展突出問題。

叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizas，AM）真菌，作為一種廣泛存在于陸地生態(tài)系統(tǒng)的共生菌，能夠改善植物對(duì)磷、氮等養(yǎng)分的吸收，提高植物對(duì)生物和非生物逆境的抗性[6]。隨著人們對(duì)作物生產(chǎn)中高產(chǎn)、資源高效意識(shí)的不斷提高，AM 真菌在集約化作物生產(chǎn)體系中的作用日益受到關(guān)注[7]。AM 真菌的生理生態(tài)功能與其群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，不同的AM 真菌群落通常具有不同的功能[8-9]。植物種類是影響AM 真菌群落結(jié)構(gòu)特征的重要因素[10]。大量研究發(fā)現(xiàn)，在物種水平上，同一生境下共存的不同植物，其共生的AM 真菌種類明顯不同[11]。少量有關(guān)同一植物不同品種AM 真菌群落組成的研究表明，AM 真菌的群落組成受到寄主植物基因型的影響[11]。郭邵霞和劉潤進(jìn)[8]研究發(fā)現(xiàn)，牡丹基因型能改變AM 真菌的侵染率和種屬組成。Mao 等人[12]發(fā)現(xiàn)，不同品種小麥AM 真菌侵染率相同但群落組成不同。近年來，人們不斷地篩選和培育出具有優(yōu)良性狀的作物新品種，并應(yīng)用于生產(chǎn)，因此，開展同一植物不同栽培品種AM 真菌群落組成的研究具有一定的理論研究和實(shí)際應(yīng)用意義。

目前，關(guān)于油茶根際AM 真菌種類已有相關(guān)報(bào)道[5]，然而，對(duì)不同品種油茶根際AM 真菌的多樣性是否存在差異未見報(bào)道。為此，本研究以不同品種油茶根際土壤為研究對(duì)象， 采用Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)研究油茶不同品種AM 真菌多樣性，并分析AM 真菌群落特征與土壤理化性質(zhì)間的關(guān)系，為油茶專用菌肥研發(fā)和集約化可持續(xù)經(jīng)營提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣地和根際土壤采集

油茶根際土壤取自江西省宜春市袁州區(qū)江西星火農(nóng)林公司油茶種植基地（27°43′ N，114°11′E），該基地屬典型亞熱帶季風(fēng)氣候，年降水量1 595.8 mm，年平均氣溫16.4 ℃，土壤類型為紅壤。選取的長林3（CL3）、長林4（CL4）、長林53（ CL53）、 贛無84-8（ GW84-8）、 贛興48（GX48）5 個(gè)品種均為5 年生油茶，每個(gè)品種生態(tài)環(huán)境條件一致，且經(jīng)營管理措施相同，種植密度為2 m×3 m。每個(gè)品種油茶林中隨機(jī)劃定5 個(gè)樣地，每個(gè)樣地隨機(jī)選取長勢相似的油茶5 株。去除土壤表面枯落葉層，在距植物主干50 cm 的東南西北4 個(gè)方位，采集0～20 cm 的油茶根系，在無菌自封袋中輕輕抖動(dòng)根系，收集根系上的土壤，作為根際土，將同一樣地5 株植物根際土壤混合均勻，5 個(gè)樣地作為重復(fù)，共計(jì)25 個(gè)土壤樣品，將土樣編號(hào)裝入自封袋運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室并分為兩份，1 份在－80 ℃條件下冷凍保存，用于DNA 提取及高通量測序；另一份土樣避光風(fēng)干保存，用于測定土壤理化性狀。

1.2 土壤理化分析

AM 真菌侵染率測定采用臺(tái)盼藍(lán)（ Trypan blue）染色法[13]和顯微十字交叉法[14]進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)；土壤理化性質(zhì)測定方法具體參照魯如坤主編《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[15]，土壤含水率測定采用烘干法；土壤pH 采用電位法；土壤全氮、全磷采用HClO4-H2SO4消化法；銨態(tài)氮采用靛酚藍(lán)比色法測定；硝態(tài)氮用鍍銅鎘還原-重氮化偶合比色法測定；有效磷測定采用氟化銨-鹽酸浸提法；有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法（外加熱法）測定。

1.3 高通量基因組測序方法

油茶根際土壤總DNA 的提取使用土壤基因組DNA 抽 提 專 用 試 劑 盒 （ 購 自MP biomedicals 公司），利用瓊脂糖電泳檢測DNA 的完整性。采用AMV4.5NF（ 5 ′-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3 ′）/ AMDGR（ 5 ′-CCCAACTATCCCTATTAATC AT-3′）引物對(duì)AM 真菌rDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，利用illumina 高通量測序儀（Illumina MiSeq）測序平臺(tái)進(jìn)行測序，下機(jī)數(shù)據(jù)通過QIIME（v1.8.0）剔除問題序列。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[16]，用鄧肯檢驗(yàn)（Duncan’s test）進(jìn)行分析和差異顯著性檢驗(yàn)。采用R 軟件，用非度量多維尺度分析（nonmetric multidimensional scaling, NMDS） 檢驗(yàn)AM真菌屬水平群落組成結(jié)構(gòu)[17]；用Mothur[18]軟件對(duì)屬水平的各個(gè)分類單元在品種之間的序列量差異進(jìn)行兩兩比較檢驗(yàn)。使用QIIME[19]軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)[ 主要包括辛普森指數(shù)（simpson）、Chao 1指數(shù)、ACE 指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)（shannon）]，并進(jìn)行多元方差分析和置換檢驗(yàn)（Adonis/ Permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA）。利用R 軟件的冗余分析（Redundancy analysis, RDA）描述根際AM 真菌豐富度最高的5 個(gè)屬和土壤因子間的關(guān)系。采用Origin Pro 8.5 軟件進(jìn)行繪圖（http://www.originlab.com/）。

2 結(jié)果與分析

2.1 AM 真菌侵染率

AM 真菌對(duì)5 個(gè)品種油茶的主要侵染類型均為菌絲侵染，不同品種油茶AM 真菌的侵染率存在差異（圖1）。GX48 的總侵染率最高，GW84-8的總侵染率最低。5 個(gè)品種的菌絲侵染率變化規(guī)律與總侵染率基本一致。CL4 和CL53 的泡囊侵染率高于其他品種。CL4 的叢枝侵染率高于其他品種。

2.2 AM 真菌群落組成

對(duì)5 個(gè)不同品種油茶根際土壤進(jìn)行高通量測序，共獲得1 376 048 條高質(zhì)量序列，所有序列共歸為2 538 個(gè)OTUs，其中CL4、GW84-8、GW48、CL3、CL53 中包含的OTU 數(shù)目分別是830、931、1 163、1 103、1 012 個(gè)。5 個(gè)品種共有OTUs 為176 個(gè)，其中不同品種特有OTU 數(shù)目分別是237、196、259、306、201 個(gè)?？傮w來看，不同品種油茶根際土壤共有的微生物數(shù)量較少。

圖1 油茶不同品種根系A(chǔ)M 真菌侵染率Fig. 1 Infection rate of AM fungi in roots of different cultivars of Camellia oleifera

對(duì)OTUs 從門到屬依次進(jìn)行分類，總共獲得AM 真菌群落1 門、 1 綱、 4 目、 10 科、 12 屬（表1），即為球囊菌門Glomeromycota 和球囊菌綱Glomeromycetes， 4 個(gè)目分別為球囊霉目Glomerales（ 占總數(shù)的62.40%）、 類球囊霉目Paraglomerales（ 25.32%） 、 原 囊 霉 目Archaeosporales（ 4.28%） 、 多 樣 孢 囊 霉 目Diversisporales（0.98%）；在科水平，5 個(gè)油茶品種根際中共鑒定出10 個(gè)科， 其中球囊霉科Glomeraceae（占總數(shù)的41.12%）、類球囊霉科Paraglomeraceae（ 25.32%） 、 近 明 球 囊 霉 科Claroideoglomeraceae（21.28%）等相對(duì)豐度較高，而原囊霉科Archaeosporaceae（2.22%）、雙型囊霉 科Ambisporaceae（ 2.05%） 、 無 梗 囊 霉 科Acaulosporaceae（ 0.57%） 、 巨 孢 囊 霉 科Gigasporaceae（ 0.33%） 、 多 樣 孢 囊 霉 科Diversisporaceae（ 0.07%） 、 和 平 囊 霉 科Pacisporaceae（ 0.02%） 、 地 管 囊 霉 科Geosiphonaceae（0.01%）等相對(duì)豐度較低。

2.3 油茶不同品種AM 真菌屬水平分類學(xué)組成及豐度

不同品種油茶根際AM 真菌群落組成不同，其中從CL4、CL53 根際土壤中均檢測到12 個(gè)屬，而GW84-8、CL3、GX48 中分別檢測到11、10、9 個(gè)屬（圖2）。球囊霉屬Glomus、類球囊霉屬Paraglomus、巨孢囊霉屬Gigaspora 和近明球囊霉屬Claroideoglomus 的相對(duì)豐度在5 個(gè)油茶品種間具有顯著差異（圖2）。與其他品種相比，GW84-8 中球囊霉屬Glomus 相對(duì)豐度（71.49%）最高，而類球囊霉屬Paraglomus（6.70%）和巨孢囊霉屬Gigaspora（0.02%）相對(duì)豐度最低；CL53 中近明球囊霉屬Claroideoglomus相對(duì)豐度（34.12%）最高，而巨孢囊霉屬Gigaspora相對(duì)豐度（0.18%）最低。

表1 油茶根際土壤AM 真菌群落系統(tǒng)分類 Table 1 Taxonomy of AM fungal communities in rhizosphere soil of Camellia oleifera

圖2 油茶不同品種根際土壤AM 真菌屬水平分類單位組成及豐度Fig. 2 Taxonomic composition and distribution abundance of the AM fungal genera in rhizosphere soil of different cultivars of Camellia oleifera

2.4 AM 真菌群落多樣性分析

不同品種油茶AM 真菌α 多樣性分析結(jié)果如表2 所示，5 個(gè)品種油茶根際土壤AM 真菌的辛普森指數(shù)、Chao 1 指數(shù)、ACE 指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均無顯著差異，說明品種對(duì)油茶根際AM 真菌多樣性影響不大。

2.5 AM 真菌群落結(jié)構(gòu)的相似性分析

不同品種油茶根際土壤AM 真菌β 多樣性分析結(jié)果如圖3 所示，第一軸從左至右的梯度基本代表品種從CL53 到CL3 排列，代表梯度比較短，第二軸從上至下的梯度代表品種從CL53 到CL4 排列，代表梯度較短。從品種分布來看，GW84-8 和GX48 分布較集中，而CL3、CL4 和CL53 分布較發(fā)散，表明CL3、CL4 和CL53 群落結(jié)構(gòu)差異較大，而GW84-8 和GX48 差異較小。Adonis 分析結(jié)果表明，油茶5 個(gè)品種的AM 真菌屬水平上的群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異（P＜0.05）。

表2 油茶不同品種根際土壤AM 真菌α 多樣性指數(shù) Table 2 Alpha diversity index of AM fungi in the rhizosphere soil of different cultivars of Camellia oleifera

圖3 油茶不同品種根際土壤AM 真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)NMDS 分析Fig. 3 NMDS analysis of community structure of AM fungi in rhizosphere soil of different cultivars of Camellia oleifera

2.6 AM 真菌群落組成與土壤因子的RDA 分析

RDA 分析表明，土壤因子對(duì)AM 真菌群落變異的解釋量超過30.13%，第一排序軸解釋群落變化的16.91%， 而第二排序軸解釋群落變化的13.22%（圖4）。硝態(tài)氮對(duì)AM 真菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響（P＜0.05）。其中，類球囊霉屬Paraglomus、巨孢囊霉屬Gigaspora、原囊霉屬Archaeospora、多樣孢囊霉屬Diversispora、 無梗囊霉屬Acaulospora、隔球囊霉屬Septoglomus和地管囊霉屬Geosiphon豐度與硝態(tài)氮正相關(guān)，而雙型囊霉屬Ambispora豐度與硝態(tài)氮負(fù)相關(guān)。

3 討論

圖4 油茶不同品種根際土壤AM 真菌屬水平群落及土壤理化因子的RDA 分析Fig. 4 RDA analysis of genus-level communities and soil properties of AM fungi in rhizosphere soil of different cultivars of Camellia oleifera

地球陸地上絕大多數(shù)植物都能與AM 真菌形成菌根，AM 真菌的生長發(fā)育和完成生活史離不開寄主植物[20]。本研究結(jié)果表明5 個(gè)不同品種油茶均能與AM 真菌形成共生體，AM 真菌總侵染率介于20.61%～43.07% 之間，平均侵染率為34.10%，屬于中度侵染。各油茶品種間的AM 總侵染率、菌絲侵染率、泡囊侵染率及叢枝侵染率均有顯著差異， 表明在本試驗(yàn)系統(tǒng)中， 油茶品種是影響AM 真菌侵染率的重要因素，這與前人的一些研究結(jié)論一致，如Steinkellner 等人[21]對(duì)10 個(gè)品種番茄的AM 侵染率進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)番茄品種顯著影響AM 真菌的侵染率；郭紹霞等[8]研究表明牡丹品種會(huì)影響到AM 真菌侵染率和種屬構(gòu)成。同一植物不同品種的生理生化特性不同，根系生理代謝和分泌物組成含量的差異可能影響AM 真菌對(duì)植物根系的識(shí)別和侵染強(qiáng)度[12]。

運(yùn)用高通量測序技術(shù)對(duì)5 個(gè)不同品種油茶根際土壤AM 真菌進(jìn)行檢測，結(jié)果表明油茶根際土壤共有AM 真菌12 個(gè)屬，相對(duì)豐度前3 的屬分別為球囊霉屬Glomus（ 41.053%）、 類球囊霉屬Paraglomus（ 25.323%） 、 近 明 球 囊 霉 屬Claroideoglomus（21.276%），其中Glomus 屬是油茶林AM 真菌中分布范圍最廣的屬，這與鄧小軍等[5]、蘇琍英等[22]研究結(jié)論一致；而劉輝等[23]在茶樹中共分離鑒定出8 屬36 種AM 真菌，其中Acaulospora、Glomus、Funneliformis 為 豐 度 較 高的前三個(gè)屬，上述結(jié)果表明AM 真菌對(duì)寄主植物有一定的偏好性。本研究中，5 個(gè)品種油茶根際分別鑒定出9～12 個(gè)屬AM 真菌，且AM 真菌的辛普森指數(shù)、Chao 1 指數(shù)、ACE 指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均無顯著差異，表明品種對(duì)油茶根際土壤AM 真菌豐富度和多樣性的影響不明顯； 由于Glomus、Paraglomus、Gigaspora 和Claroideoglomus 等屬在不同品種中的相對(duì)豐度存在差異，因此造成了不同品種油茶的AM 真菌群落結(jié)構(gòu)的變化，與郭邵霞等[8]、Mao 等人[12]研究結(jié)果一致。植物種類是影響AM 真菌群落結(jié)構(gòu)的重要的因子[24]，不同植物和同一植物不同品種遺傳物質(zhì)并不相同，可能由于根系形態(tài)結(jié)構(gòu)、分泌物等差異，能促進(jìn)或抑制某些AM 真菌的生長發(fā)育，進(jìn)而影響到植物AM 真菌群落結(jié)構(gòu)特征。

在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，土壤類型、土壤肥力、土壤pH 值等土壤因子都會(huì)對(duì)AM 真菌群落組成和分布有重要影響[25-28]。Matev?等人[29]認(rèn)為有效磷是影響葡萄園AM 真菌群落變化的主要原因之一；Guo 等人[30]認(rèn)為土壤pH 是影響AM 真菌多樣性的最主要土壤因子，可能是由于其能夠直接影響AM真菌生理狀態(tài)，改變其生態(tài)位，并通過調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分的生物有效性等間接影響AM 真菌群落；而鄧小軍等[5]在研究中發(fā)現(xiàn)油茶AM 真菌豐度與全氮、有機(jī)質(zhì)顯著正相關(guān)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)硝態(tài)氮是影響油茶根際AM 真菌群落組成與分布的最主要因素，這可能是因?yàn)橄鯌B(tài)氮在土壤中移動(dòng)性較強(qiáng)，能夠通過質(zhì)流被植物吸收，并改變土壤養(yǎng)分平衡和時(shí)空特性，從而間接地影響AM 真菌群落[31]。AM 真菌的群落組成是其生理生態(tài)功能的基礎(chǔ)[9]，這些AM 真菌群落結(jié)構(gòu)的差異是否影響其功能還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

AM 真菌是陸地生態(tài)系統(tǒng)中重要的微生物之一，本研究研究了5 個(gè)不同品種油茶根際AM 真菌群落的多樣性及其群落結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果表明，油茶根際土壤中AM 真菌資源較為豐富，5 個(gè)不同品種油茶根際土壤AM 真菌多樣性無顯著差異，而油茶品種對(duì)AM 真菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，且硝態(tài)氮是影響油茶根際AM 真菌群落組成和分布的主要土壤因子。