基因編輯技術(shù)在作物育種中的應(yīng)用與展望

李樹磊 鄭紅艷 王磊

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

隨著全球人口數(shù)量增加、氣候變化、土壤流失和水資源缺失等問題日益突出，到2050年，全球?qū)Z食的需求預(yù)計將比2005年增加100%-110%［1］。為滿足人們對農(nóng)作物產(chǎn)品日益增長的需求，作物育種技術(shù)創(chuàng)新顯得尤為重要。雜交育種、突變育種和轉(zhuǎn)基因育種是目前現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中作物改良的主要方法，然而雜交育種需要年限較長［2］，突變育種的隨機(jī)性較大［3］，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可通過引入外源基因從而獲得優(yōu)良性狀，但其商業(yè)化與監(jiān)管過程比較繁瑣［4］?；蚓庉嫾夹g(shù)近年來發(fā)展迅速，通過不斷地改進(jìn)，該技術(shù)現(xiàn)已成為一種操作簡單、快速高效、成本低的靶向編輯基因工具，運(yùn)用基因編輯技術(shù)可以對作物自身基因進(jìn)行精確刪除或者插入以培育新品種，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。本文描述了3種基因編輯技術(shù)的原理，并對CRISPR/Cas系統(tǒng)的功能、局限性以及其在作物育種上的應(yīng)用做出詳細(xì)總結(jié)，最后對基因編輯作物的未來進(jìn)行展望，旨在為該技術(shù)在作物育種上的應(yīng)用提供借鑒和新思路。

1 基因編輯技術(shù)的發(fā)展

目前成熟應(yīng)用的基因組編輯技術(shù)主要有3種，按時間順序依次為：人工核酸酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶技術(shù)（Zinc finger nucleases，ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和RNA介導(dǎo)的CRISPR/Cas技術(shù)（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）/CRISPR-associated protein，CRISPR/Cas），以下主要對3種技術(shù)的組成和作用原理做簡要介紹。

1.1 鋅指核酸酶技術(shù)（ZFNs）

鋅指核酸酶（ZFNs）具有單獨(dú)的DNA結(jié)合域和DNA裂解域，即鋅指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）與天然IIS型限制酶Fok I，且已被廣泛應(yīng)用于靶向基因研究［5］。ZFNs誘導(dǎo)的雙鏈斷裂受到細(xì)胞DNA修復(fù)過程的影響，從而導(dǎo)致靶向突變和靶向基因置換的頻率都非常高。

鋅指蛋白是一類通過Cys2-His2鋅指結(jié)構(gòu)域去結(jié)合DNA的轉(zhuǎn)錄因子。其中該結(jié)構(gòu)域每30個氨基酸結(jié)合一個鋅原子，該轉(zhuǎn)錄因子是由一個α螺旋和兩個反向的β平行形成緊密的β-β-α結(jié)構(gòu)，能特異性識別3個連續(xù)的堿基對，ZFNs可以通過設(shè)計鋅指結(jié)構(gòu)域以及多個鋅指蛋白來實現(xiàn)對特異的基因進(jìn)行編輯［6-9］。天然IIs型限制酶Fok I具有物理上可分離的結(jié)合和裂解活性，其中裂解域沒有明顯的序列特異性，且Fok I核酸酶需要形成二聚體才可切割DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂（double strand breaks，DSBs）［10-11］。

該技術(shù)靶向結(jié)合效率高，但由于蛋白設(shè)計復(fù)雜且篩選過程很漫長，且該技術(shù)無法實現(xiàn)對任意靶基因的結(jié)合與高通量編輯基因，所以該方法仍在不斷完善中。

1.2 轉(zhuǎn)錄激活物效應(yīng)核酸酶技術(shù)（TALENs）

轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)核酸酶（TALENs）技術(shù)是繼ZFNs之后的一種高效靶向基因編輯新技術(shù)，類似于ZFNs，TALENs包含一個識別特異DNA序列的TALEs（Transcription-activator-like effectors，TALEs）蛋白和非特異性的Fok I核酸酶，由兩個TALEs蛋白識別和結(jié)合DNA靶位點(diǎn)，同時Fok I核酸酶對靶DNA進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂從而實現(xiàn)對基因組靶位點(diǎn)的編輯［12］。

用于設(shè)計TALEs蛋白的基本結(jié)構(gòu)域是一個高度保守的重復(fù)結(jié)構(gòu)域，TALEs蛋白的DNA結(jié)合域由33-35個氨基酸的重復(fù)單元組成，其中位于12和13位的兩個可變氨基酸殘基稱為重復(fù)可變的雙氨基酸殘基（Repeat variable di-residue，RVD），通過這兩個氨基酸殘基識別并結(jié)合DNA序列［13］。

TALENs的裂解DNA的能力幾乎與ZFNs的相同，且設(shè)計更為簡單，特異性較強(qiáng)。但TALEs蛋白的同源重復(fù)序列較多，組裝的工作量較大。且TALEs蛋白的體積幾乎是ZFPs的3-4倍，對轉(zhuǎn)化手段具有一定的限制，同樣也限制該技術(shù)在高通量編輯上的應(yīng)用［14］。

1.3 規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)相關(guān)蛋白技術(shù)（CRISPR/Cas）

CRISPR/Cas系統(tǒng)是在細(xì)菌和古細(xì)菌中存在的一種適應(yīng)性免疫反應(yīng)，其主要作用為抵御噬菌體病毒和外源質(zhì)粒DNA的入侵。

目前有3種CRISPR系統(tǒng)被驗證，分別是TypeⅠ型基因（特征基因Cas3）、TypeⅡ型（特征基因Cas9）和TypeⅢ型（特征基因Cas10），每一種系統(tǒng)都使用一組獨(dú)特的Cas蛋白和crRNA進(jìn)行CRISPR干擾。其中I型和III型系統(tǒng)利用大型復(fù)合Cas蛋白質(zhì)與復(fù)雜的crRNA結(jié)合去編輯目標(biāo)序列［15］，而II型CRISPR系統(tǒng)只需依賴1個Cas9核酸酶及2個RNA，即crRNA（CRISPR-derived RNA，crRNA）和tracrRNA（trans-activating RNA，tracrRNA），就可以造成基因的雙鏈斷裂［16］。

基于以上CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)良特性，該系統(tǒng)現(xiàn)已逐步改良為一個由RNA引導(dǎo)靶向編輯DNA的平臺，廣泛用于基因編輯、轉(zhuǎn)錄干擾和表觀遺傳調(diào)節(jié)等方面。在實際應(yīng)用中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)通常包含一個Cas9蛋白和一段根據(jù)靶位點(diǎn)設(shè)計的大約100 nt的sgRNA（simple guide RNA，sgRNA）序列，Cas9核酸酶在gRNA的引導(dǎo)下對DNA特定位點(diǎn)進(jìn)行切割產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂。而DNA的雙鏈斷裂可以通過非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）或同源重組（Homology recombination，HR）兩種方式進(jìn)行修復(fù)，從而實現(xiàn)目的性編輯。

盡管運(yùn)用ZFNs和TALENs技術(shù)已經(jīng)在多種動物及植物中成功實現(xiàn)了基因的定點(diǎn)編輯，但這兩種技術(shù)定向打靶依賴于特異性結(jié)合蛋白的合成，操作起來繁瑣費(fèi)時且打靶效率低，致使其應(yīng)用進(jìn)展緩慢，而CRISPR/Cas技術(shù)具備操作簡單、周期短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展，因此本文主要對CRISPR/Cas技術(shù)的作用方式及其在作物育種中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，為農(nóng)作物品種改良提供有益的參考。

2 CRISPR/Cas的應(yīng)用

CRISPR/Cas系統(tǒng)主要是通過sgRNA與Cas蛋白起作用，而通過修飾以上兩部分，CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用將被不斷拓寬。

2.1 靶向基因敲除（Knock-out）及敲入（Knock-in）

Cas9在gRNA的引導(dǎo)下，識別靶序列的PAM（protospacer adjacent motif，PAM）位點(diǎn)并切割靶位點(diǎn)，DNA斷裂引起的修復(fù)主要以NHEJ的方式修復(fù)。但NHEJ是一種易出錯的修復(fù)方式，會在雙鏈斷裂的位置引入小的核酸插入或缺失（Insertion and deletion，indel），導(dǎo)致靶基因蛋白翻譯產(chǎn)生移碼突變，從而破壞基因功能。如果細(xì)胞中有與靶位點(diǎn)序列同源的DNA供體（DNA donor）片段時，位于供體DNA上的基因片段會通過同源重組方式整合到雙鏈斷裂的位置，從而實現(xiàn)目的片段敲入/替換［17］。

2.2 單堿基編輯

現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)兩類DNA堿基編輯器，胞嘧啶堿基編輯器（Cytidine base editing，CBE）將C·G堿基對轉(zhuǎn)換為T·A堿基對，腺嘌呤堿基編輯器（Adenine base editing，ABE）將A·T堿基對轉(zhuǎn)換為G·C堿基對?？偟膩碚f，CBE和ABE可以實現(xiàn)所有4種可能的過渡突變（C到T，G到A，A到G，T到C）［18］。

胞嘧啶堿基編輯（CBE）：一種APOBEC1（Apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 1）胞苷脫氨酶可以通過脫氨基將胞嘧啶的外環(huán)胺生成尿嘧啶［19］，將胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），進(jìn)而通過DNA復(fù)制或者修復(fù)的方式轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶（T）?；诖嗽恚撓到y(tǒng)不斷優(yōu)化。到目前為止，CBE3系統(tǒng)通過APOBEC1胞苷脫氨酶、尿嘧啶糖基化酶抑制劑（Uracil glycosylase inhibitor，UGI）及nCas9-D10A（Cas9 nickase，nCas9）突變體的融合表達(dá)，已成功在小麥、水稻、玉米等物種上實現(xiàn)安全高效的C到T的堿基替換編輯，且堿基替換與刪除出現(xiàn)的概率很低［20］。

腺嘌呤堿基編輯（ABE）：ABE由來自大腸桿菌（Escherichia coli）中的腺苷酸脫氨酶（tRNA adenosine deaminase enzyme，TadA）的突變體TadA*和nCas9-D10A突變體組成，TadA*可將腺嘌呤（A）脫氨變?yōu)榧≤眨↖nosine，I），肌苷（I）在DNA復(fù)制時被識別為鳥嘌呤（G），最終實現(xiàn)A到G的變換。經(jīng)過不斷的進(jìn)化改造，ABE7.10系統(tǒng)是目前報道的效率最高且與應(yīng)用最廣的ABE系統(tǒng)［16，21］。

2.3 DNA-free編輯

不同于常規(guī)植物基因組編輯的轉(zhuǎn)化手段，DNA-free編輯是指通過粒子轟擊或者PEG介導(dǎo)的方式將CRISPR/Cas9的體外轉(zhuǎn)錄物（Delivering in vitro transcripts，IVTs）或核糖核蛋白復(fù)合物（Ribonucleoprotein complexes，RNPs）直接轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞完成對靶基因的編輯。DNA-free的編輯系統(tǒng)不僅消除CRISPR/Cas9隨機(jī)整合到基因組DNA中的幾率，而且改良了常規(guī)轉(zhuǎn)化中存在的問題，如較高的潛在脫靶效應(yīng)、易出現(xiàn)嵌合體、需通過后代分離方可獲得無CRISPR/Cas9的植物突變體。

2.4 RNA編輯

RNA編輯的主要優(yōu)點(diǎn)在于不改變編碼基因本身，更加可控、不會遺傳且效率較高（同時靶向編輯多個基因的轉(zhuǎn)錄本）。2014年，Jennifer Doudna團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)Cas9酶可與PAM序列共同作用，識別并結(jié)合到單鏈RNA（Single-stranded RNA，ssRNA）的特異位點(diǎn)上［22］。隨后，張鋒團(tuán)隊從多種細(xì)菌中找到一種能夠切割大腸桿菌報告基因的Cas13a酶，開發(fā)出由單一RNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas13a系統(tǒng)（也稱為CRISPR/C2c2），該系統(tǒng)可特異性的降低哺乳動物細(xì)胞中的內(nèi)源RNA和報告RNA水平［23］。最近，美國芝加哥大學(xué)的Dickinson研究團(tuán)隊構(gòu)建出一套以CRISPR/Cas為基礎(chǔ)的RNA靶向系統(tǒng)（CRISPR-Casinspired RNA targeting system，CIRTS），可將一系列效應(yīng)因子（包括核酸酶、降解機(jī)制、翻譯激活因子和堿基編輯器）傳遞到目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本上［24］。

通過活性位點(diǎn)突變及與其他功能性蛋白進(jìn)行融合，該技術(shù)已經(jīng)能夠成功對RNA進(jìn)行單堿基編輯。在哺乳動物中使用的RNA單堿基編輯融合蛋白均來源于ADAR家族腺苷脫氨酶，該酶的脫氨基域（Deamination domain，DD），即ADARDD，能催化水解腺苷（A）脫氨，將腺苷（A）轉(zhuǎn)化為肌苷（I）［25-26］。張鋒團(tuán)隊設(shè)計了REPAIR系統(tǒng)（RNA Editing for Programmable A to I Replacement，REPAIR），該系統(tǒng)將以RNA為導(dǎo)向的dCas13b，即dPspCas13b，融合到ADAR2DD（E488Q）突變體，在哺乳動物細(xì)胞中實現(xiàn)了腺苷（A）替換至肌苷（I），而肌苷（I）在堿基互補(bǔ)配對時行使鳥苷（G）的作用，從而造成A到I到G的轉(zhuǎn)變［27］。最近該團(tuán)隊在REPAIR的基礎(chǔ)上，對ADAR2進(jìn)行改進(jìn)，構(gòu)建出新的RNA編輯系統(tǒng)RESCUE（RNA Editing for Specific C-to-U Exchange，RESCUE），使ADAR2腺苷脫氨酶具備將胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U）的能力，實現(xiàn)了C到U的RNA編輯，且該系統(tǒng)仍保留將A轉(zhuǎn)化為I的功能［28］。

2.5 其他應(yīng)用

通過改良編輯系統(tǒng)的不同部分，還可以將CRISPR的應(yīng)用繼續(xù)擴(kuò)展，比如通過Cas9或其變體與不同效應(yīng)因子連接可以實現(xiàn)基因定位［29］、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［30］、表觀修飾［31］與活細(xì)胞成像［32］，還可以進(jìn)行基因組以及藥物篩選［33-34］。

3 CRISPR/Cas在作物育種上的運(yùn)用

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)育種的目標(biāo)主要是培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗蟲抗病的品種，傳統(tǒng)育種周期漫長，而傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用又受各種風(fēng)險因素限制。近年來，我國已在作物分子育種方面積累了一定的成果，現(xiàn)已在不同作物當(dāng)中鑒定并分離克隆大量產(chǎn)量、品質(zhì)、抗除草劑、抗蟲抗病、代謝調(diào)控和抗非生物逆境脅迫相關(guān)的基因，這些基因的有效利用將推動作物育種的快速發(fā)展，而CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)具有高效的定點(diǎn)編輯能力，可實現(xiàn)更為可控且準(zhǔn)確的基因組編輯，所以該技術(shù)在作物育種方面具有廣闊應(yīng)用前景。

3.1 提高產(chǎn)量

作物育種最主要的目的就是提高產(chǎn)量，產(chǎn)量指標(biāo)的構(gòu)成主要包括穗數(shù)、每穗實收粒數(shù)及粒重。水稻中的miR396e和mi396f是水稻株型和粒重的重要調(diào)控基因［35-37］，朱健康團(tuán)隊通過基因敲除獲得miR396e/f的雙突變體，發(fā)現(xiàn)該突變體穗型增大，千粒重增加40%左右［38］。

DEP1（Dense and erect panicle 1）是控制水稻穗粒數(shù)的顯性基因，在我國北方主栽粳稻品種中，當(dāng)DEP1基因在第5個外顯子上存在625個堿基對的缺失，表現(xiàn)為莖頂端分生組織活性提高，株高變矮，枝梗數(shù)和穗粒數(shù)增加，產(chǎn)量提高［39］。Wang等［40］通過設(shè)計4個sgRNAs在秈稻（自交系IR58025B）中實現(xiàn)該基因的大片斷敲除，得到具有密集直立圓錐花序、株高降低且具有增產(chǎn)潛力的水稻材料。

GW2（grain weight 2，GW2）基因編碼E3泛素鏈接酶，在水稻、玉米、小麥籽粒發(fā)育過程中起負(fù)調(diào)控作用，Wang等［41］利用CRISPR/Cas9對小麥籽粒重基因TaGW2進(jìn)行敲除，突變體籽粒大小和千粒重明顯增加；同年，高彩霞與王道文團(tuán)隊通過CRISPR/Cas9技術(shù)分別靶向3個同源基因TaGW2-A1、-B1和-D1的特異性區(qū)域，創(chuàng)制了4個TaGW2的突變體材料：TaGW2-B1和TaGW2-D1的單突變體、TaGW2-B1和-D1的雙突變體以及TaGW2-A1、-B1、-D1的三突變體。比較發(fā)現(xiàn)3個基因均負(fù)調(diào)控小麥籽粒的寬度、長度、千粒重及平均單株產(chǎn)量，且TaGW2-B1的作用效果強(qiáng)于TaGW2-D1［42］。

3.2 改善品質(zhì)

隨著人們生活水平的提高，要求培育的新品種作物不僅具有更高、更穩(wěn)的產(chǎn)量，而且應(yīng)該具有更好、更全面的產(chǎn)品品質(zhì)。

花青素屬于生物類黃酮物質(zhì)，是在自然界廣泛存在與植物中的天然水溶性色素，其最主要的生理性功能是自由基清除能力和抗氧化能力。富含原花青素和花青素的野生稻（Oryza rufipogon L.）籽粒顯紅色，該性狀受到Rc和Rd兩個互補(bǔ)基因的調(diào)節(jié)［43-44］，Rc編碼一個基本的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，而Rd編碼一個二氫黃酮醇4還原酶蛋白。野生稻的RcRd基因型能夠產(chǎn)生紅色籽粒的表型，而大部分栽培水稻因Rc基因外顯子堿基缺失造成移碼突變，籽粒呈白色。福建農(nóng)科院與廈門大學(xué)合作利用CRISPR/Cas9將原本移碼突變轉(zhuǎn)換為突變堿基為三的倍數(shù)的整碼突變（in-frame mutation），致使該基因恢復(fù)功能，并得到了有較高的原花青素和花青素含量的紅稻［45］。

亞油酸是一種對心腦血管健康有害的多不飽和脂肪酸，而FAD2蛋白的作用便是將籽粒中的油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸，通過突變該基因便可減少亞油酸的含量［46］。Okuzaki［47］等通過CRISPR/Cas9以FAD2（fatty acid desaturase 2，F(xiàn)AD2）位點(diǎn)BnaA.FAD2.a為靶點(diǎn)對多倍體油菜進(jìn)行定點(diǎn)誘變，從回交子代中選擇FAD2 - aa等位基因的突變植株，在自交子代中篩選到純合植株。與野生型油菜相比，該純合突變體材料籽粒當(dāng)中油酸含量增加，亞油酸含量減少。

抗性淀粉（Resistant Starch，RS）是健康人體小腸內(nèi)難以消化吸收的淀粉及淀粉降解物的總稱，攝入高抗性淀粉食品可有效預(yù)防和控制糖尿病，并對肥胖癥和腸道疾病起到積極預(yù)防作用［48］。淀粉分支酶（Starch branching enzyme，SBE）是水稻淀粉合成過程中的關(guān)鍵調(diào)控酶之一，夏蘭琴團(tuán)隊運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)對SBEII進(jìn)行敲除后發(fā)現(xiàn)，直鏈淀粉和抗性淀粉含量分別提高到25%和9.8%［49］。

3.3 除草劑的耐受性與抗性

通過外源基因?qū)胧谦@得抗除草劑作物的傳統(tǒng)方法，但因為是屬于轉(zhuǎn)基因作物，其在重要糧食作物中的推廣應(yīng)用受到限制，因此通過基因編輯提高重要農(nóng)作物的除草劑抗性成為目前基因組編輯研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。

草甘膦是目前世界上使用量最大的除草劑，目前生產(chǎn)上推廣的抗草甘膦作物，幾乎全部為通過導(dǎo)入農(nóng)桿菌屬的CP4菌株的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因，即EPSPS（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）基因獲得的，商業(yè)化受到極大的阻礙。高彩霞和李家洋團(tuán)隊合作利用CRISPR/Cas9技術(shù)，通過非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)方式在水稻中實現(xiàn)了EPSPS基因的定點(diǎn)替換，在T0代獲得對草甘膦具有抗性的水稻材料［50］。

小麥遺傳背景復(fù)雜，利用傳統(tǒng)的育種方式培育抗除草劑品種具有一定的難度。高彩霞、姜臨建和李家洋團(tuán)隊合作利用單堿基編輯技術(shù)對小麥乙酰乳酸合成酶基因（Acetolactate synthase，ALS）和乙酰輔酶A羧基化酶基因（Acetyl CoA carboxylase，ACC）進(jìn)行編輯，獲得耐受磺酰脲類、咪唑啉酮類和芳氧基苯氧基丙酸酯類除草劑的小麥材料［51］。同樣，揚(yáng)州大學(xué)和上海師范大學(xué)團(tuán)隊合作利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的胞嘧啶堿基編輯技術(shù)，成功在油菜乙酰乳酸合成酶基因BnALS中引入P197S和P197F的突變，創(chuàng)制出苯磺隆除草劑抗性的油菜［52］。近日，高彩霞和李家洋團(tuán)隊再次合作設(shè)計了可以飽和突變并促進(jìn)植物基因定向進(jìn)化的基因編輯器STEME（Saturated targeted endogenous mutagenesis editors，STEME），并利用20個sgRNA在水稻原生質(zhì)體中對乙酰輔酶A羧基化酶基因ACC的CT結(jié)構(gòu)域的168個堿基序列產(chǎn)生了接近飽和的誘變，并篩選得到與除草劑分子結(jié)合能力減弱的氨基酸突變體材料，從而成功獲得了水稻對除草劑的抗性［53］。

水稻OsSF3B1（Splicing factor 3b subunit 1，S3B-1）是一個真核細(xì)胞物種保守基因，植物中自然產(chǎn)生的剪接抑制劑在RNA剪接中起到非常重要的作用［54-55］。在農(nóng)作物中，RNA剪接抑制劑是一種有效的除草劑［56］。Butt等［57］運(yùn)用CRISPR技術(shù)對水稻OsSF3B1基因的保守結(jié)構(gòu)域HR15-17進(jìn)行突變，經(jīng)過除草劑的篩選，最終獲得了21株抗除草劑的水稻植株。

3.4 抗蟲性

植物當(dāng)中5-羥色胺和水楊酸的生物合成來自共同的源頭物質(zhì)［48］。浙江大學(xué)等單位以水稻為材料，發(fā)現(xiàn)兩者的生物合成存在相互負(fù)調(diào)控現(xiàn)象，同時也發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控植株體內(nèi)5-羥色胺生物合成，水稻會對害蟲表現(xiàn)抗性。細(xì)胞色素P450基因CYP71A（cytochrome P-450LXXIA1，CYP71A）編碼5-羥色胺，該團(tuán)隊利用基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9技術(shù)突變CYP71A，快速篩選培育出了抗褐飛虱、抗螟蟲的非轉(zhuǎn)基因水稻材料［58］。

3.5 非生物脅迫抗性

高溫、寒冷、干旱和重金屬毒害等非生物脅迫對作物的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，是導(dǎo)致農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的重要因素，應(yīng)用基因工程方法提高作物對非生物脅迫的耐受能力，是作物分子育種面臨的重要挑戰(zhàn)之一。

鎘（Cadmium，Cd）是對人體有害的一種重金屬，會引發(fā)骨質(zhì)疏松、腎功能衰竭、癌癥及心血管疾病等［59］。鎘超標(biāo)的大米是膳食鎘攝入的主要來 源［60-61］。OsNramp5（Natural resistance-associated macrophage protein，Nramp5）基因調(diào)控水稻體內(nèi)金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，該基因使植株具有吸附環(huán)境中Cd的能力并將其在籽粒中大量富集［62-63］。袁隆平團(tuán)隊通過利用基因編輯技術(shù)敲除該基因，發(fā)現(xiàn)突變體芽和根中的Cd濃度明顯降低，且對植物產(chǎn)量影響不顯著，最終在高鎘土壤中篩選鑒定出耐Cd水稻基因編輯材料［64］。

玉米ARGOS8（Aluminum-induced Protein Superfamily Pseudogene，ARGOS8）基因是植物乙烯反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子，過表達(dá)ARGOS8的轉(zhuǎn)基因植物在干旱脅迫條件下對乙烯的敏感性減弱，產(chǎn)量提高［65］。Shi等［66］通過CRISRP系統(tǒng)對玉米進(jìn)行基因編輯，在該基因上游非編碼區(qū)插入玉米GOS2啟動子以代替ARGOS8的天然啟動子，產(chǎn)生了乙烯反應(yīng)負(fù)調(diào)節(jié)因子ARGOS8的新變種，與野生型玉米相比，該材料對干旱的抗性增強(qiáng)。

MicroRNA是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，大小約為19-22 nt，其主要在發(fā)育過程中調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)［67］。2018年，朱健康團(tuán)隊利用其改良的基因編輯技術(shù)（Short Tandem Target Mimic，STTM）敲除水稻microRNA166，其中發(fā)現(xiàn)突變植株的葉片植株氣孔疏導(dǎo)能力降低，蒸騰速率降低，抗旱性增加，從而獲得 miRNA166低表達(dá)抗旱水稻新品系［68］。

3.6 抗病性

病害是影響我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素，而現(xiàn)在主要的防治方法僅僅是提前消毒種子或在癥狀出現(xiàn)后噴施農(nóng)藥，但效果仍然不理想。但想要從根源上解決病害這一問題，抗病作物品種選育至關(guān)重要。

水稻白葉枯病是亞洲和非洲的一種重要病害，病原體為水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo），該菌利用一組III型轉(zhuǎn)錄激活子效 應(yīng) 物（TALes）誘導(dǎo)宿主SWEET（Sugars Will Eventually be Exported Transporters，SWEET） 基 因表達(dá)，致使宿主易感該?。?9-70］。Zhou等［71］通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除OsSWEET13基因，提高水稻對該病的抗性，且證實了稻瘟病菌主要是通過提高宿主細(xì)胞對蔗糖的合成來侵染宿主。最近，楊兵課題組通過CRISPR系統(tǒng)突變SWEET11、SWEET13和SWEET14三個基因的啟動子，并在突變體中不斷篩選鑒定得到對白葉枯病具有強(qiáng)大廣譜抗性的水稻株系［72］。

稻瘟病是世界上危害水稻最嚴(yán)重的病害之一，稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）屬于半知菌亞門真菌，可引起大幅度減產(chǎn)。植物乙烯應(yīng)答因子（Plant ethylene responsive factors，ERF）是植物APETELA2/乙烯應(yīng)答因子（AP2/ERF）轉(zhuǎn)錄因子超家族的一個亞家族，它參與了多種脅迫耐受的調(diào)節(jié)，并參與了多種對非生物脅迫和生物脅迫的響應(yīng)［73-75］。趙開軍團(tuán)隊以稻瘟病感病品種空育131為材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除OsERF922（Ethyleneresponsive transcription factor 2，ERF922），獲得的T2純合突變系在苗期和分蘗期對稻瘟病菌的抗性相比野生型都有顯著提高［76］。

水稻矮化?。≧ice tungro disease，RTD）是亞洲熱帶地區(qū)水稻生產(chǎn)的嚴(yán)重制約因素，RTD是由水稻球形病毒（Rice tungro spherical virus，RTSV）與水稻桿狀病毒相互作用引起的，具有RTSV抗性的植株大部分也表現(xiàn)出RTD抗性［77］。自然RTSV抗性是由翻譯起始因子基因（The translation initiation factor 4 gamma，eIF4G）控制的隱性性狀，eIF4G蛋白中Y1059V1060V1061氨基酸殘基發(fā)生單核苷酸多態(tài)性（Single-nucleotide polymorphisms，SNPs）或缺失而獲得抗性［78］。利用該特性，Macovei等［78］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)RTSV敏感品種IR64中的eIF4G突變，該團(tuán)隊在溫室條件下篩選并鑒定到不含Cas9序列且具有RTSV抗性的相對高產(chǎn)植株。

小麥白粉病是一種世界性病害，小麥白粉病菌（Blumeria graminis）屬子囊菌亞門真菌。該病主要侵染作物的葉片與葉鞘，通過分生孢子或子囊孢子借氣流傳播到感病小麥葉片上。MLO（Mildewresistance locus，MLO）是大麥、小麥等作物中白粉病菌成功侵染所必需的基因［79］。該基因突變后，大麥表現(xiàn)出對白粉病菌的持久、廣譜抗性［80］。WANG等人通過TALEN與CRISPR/Cas9技術(shù)在六倍體小麥中編碼抗霉位點(diǎn)的蛋白的3個等位基因TaMLO-A1、TaMLO-B1、TaMLO-D1中引入靶向突變，得到對白粉病具有廣譜抗性的小麥［81］。

總之，CRISPR/Cas系統(tǒng)是作物分子育種的最新且最有效的途徑。表1總結(jié)了近年來CRISPR/Cas在作物育種上的應(yīng)用，其包含了目標(biāo)性狀靶基因、編輯類型和作物種類。

表1 CRISPR/Cas系統(tǒng)在作物育種上的應(yīng)用

4 CRISPR/Cas局限性

如今CRISPR/Cas系統(tǒng)已經(jīng)在真核生物當(dāng)中得到廣泛運(yùn)用，尤其是動物當(dāng)中，其研究進(jìn)展十分迅速。植物基因編輯進(jìn)展相對落后的原因，除了動植物本身之間的差異以外，CRISPR/Cas系統(tǒng)自身的缺陷也對編輯效率產(chǎn)生影響。

4.1 PAM序列的限制

目前被廣泛研究并應(yīng)用于植物編輯當(dāng)中的CRISPR核酸酶包括來自化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的SpCas9和來自毛螺科菌（Lachnospiraceae bacterium）的LbCpf1，SpCas9需要識別編輯靶位點(diǎn)的“NGG”PAM序列行使功能，LbCpf1則需要嚴(yán)格識別“TTTV”PAM位點(diǎn)發(fā)揮作用，在實際應(yīng)用時，這對于特定靶位點(diǎn)的選擇存在一定限制。因此，如何有效拓展CRISPR核酸酶PAM位點(diǎn)范圍，成為CRISPR系統(tǒng)在植物基因組編輯中廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。

日本橫濱市立大學(xué)Seiichi Toki團(tuán)隊通過定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)，SpCas9的突變體SpCas9-NGv1（R1335A/ L1111R/D1135V/G1218R/E1219F/A1322R /T1337R）可以在水稻和擬南芥基因組中以NG為PAM進(jìn)行有效突變［91］。

xCas9是最近發(fā)現(xiàn)的一種識別哺乳動物細(xì)胞中大多數(shù)PAM類型的Cas9變體，包括NG、GAA和GAT，xCas9已被證實可在水稻中進(jìn)行基因敲除以及堿基替換［56］。中國電子科技大學(xué)張勇團(tuán)隊和美國馬里蘭大學(xué)戚益平團(tuán)隊通過構(gòu)建來自弗朗西斯菌屬（Francisella novicida）的FnCpf1、LbCpf1核酸酶的RR及RVR突變體表達(dá)系統(tǒng)，成功實現(xiàn)了以“CCCC”、“TYCV”、“TATG”為PAM位點(diǎn)的水稻基因組編輯，擴(kuò)大了Cpf1核酸酶在植物基因組編輯中的應(yīng)用范圍［92］。以上研究不僅有效地拓展了CRISPR的應(yīng)用，而且顯著提高了植物基因組的編輯范圍，但仍需進(jìn)一步對其進(jìn)行優(yōu)化，在擴(kuò)大編輯范圍的同時提高編輯效率。

4.2 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的限制

植物基因編輯效率的提高在一定程度上依賴于高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，目前常用的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法及PEG轉(zhuǎn)化法（Polyethylene glycol，PEG），其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是最成熟的轉(zhuǎn)化途徑，但由于宿主范圍的限制，只適用于部分植物物種和組織；基因槍轟擊法和PEG轉(zhuǎn)化法靶向受體材料類型廣泛，無宿主的限制，但基因槍轟擊法由于基因槍轟擊的隨機(jī)性，外源基因進(jìn)入宿主基因組的整合位點(diǎn)相對不固定，拷貝數(shù)往往較多，不利于外源基因在宿主植物的穩(wěn)定表達(dá)；PEG轉(zhuǎn)化涉及到植株再生問題，目前僅有煙草等少數(shù)物種可以實現(xiàn)［93］。納米材料目前已經(jīng)廣泛用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，在哺乳動物細(xì)胞中，有研究表明納米顆?？梢赃\(yùn)送Cas9蛋白與sgRNA進(jìn)入細(xì)胞，并在30%的細(xì)胞中對目的基因進(jìn)行編輯［94］。CRISPR編輯技術(shù)結(jié)合納米顆粒在植物上的應(yīng)用將克服宿主范圍的限制，且適用于廣泛的植物物種和不同的組織。該技術(shù)的成功應(yīng)用將快速推進(jìn)作物的遺傳改良進(jìn)展。

4.3 DNA特異性識別的限制（脫靶）

除了擴(kuò)大基因組的編輯范圍，DNA的特異性識別也是需要攻破的又一難關(guān)。研究人員利用多種方法揭示了基于CRISPR的基因組編輯的DNA靶向特性，但卻沒有一種方法和算法能證明野生型Cas9蛋白與其同源的sgRNA存在靶外反應(yīng)。但仍存在很多案例，非靶位點(diǎn)的基因修改接近甚至超越靶位點(diǎn)修改的頻率［95］。

通過不斷地摸索，研究人員開發(fā)出以下幾種策略降低脫靶效率：其一為通過簡單地截短sgRNA，使其與目標(biāo)DNA的互補(bǔ)性少于20個核苷酸，結(jié)果是SpCas9的非目標(biāo)修飾可以減少幾個數(shù)量級［96-97］；其二是在有足夠的機(jī)會改變靶位點(diǎn)后降低其在細(xì)胞中的活性或壽命。例如，直接向細(xì)胞傳遞Cas9與sgRNA核糖核酸蛋白復(fù)合物（RNPs），該方法可保證Cas9蛋白的瞬時活性，且在一段時間后該蛋白會在細(xì)胞中降解［98］。此外，將Cas9核酸酶的兩個殘基的其中一個失活，改造其為nCas9，并分別設(shè)計兩個sgRNA，當(dāng)兩個nCas9同時與DNA鏈上的靶位點(diǎn)結(jié)合時，DNA發(fā)生雙鏈斷裂，在一定程度上大大減少脫靶幾率［99］。

5 基因編輯作物的展望

傳統(tǒng)育種中利用的遺傳變異主要來自于自然過程、物理或化學(xué)的誘變，而這些變異概率低且突變位點(diǎn)不可預(yù)測，基因編輯技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)均能克服以上缺點(diǎn)，這對作物基因功能研究與遺傳育種具有重要的意義，但這兩種技術(shù)之間也有巨大的差異。轉(zhuǎn)基因技術(shù)一直在許多國家被稱為基因改造技術(shù)（Genetic modification），是將外源基因?qū)胩囟ㄗ魑锘蚪M當(dāng)中并使其表達(dá)相應(yīng)的產(chǎn)物的新型育種技術(shù)，這些基因可以來自同一物種內(nèi)部，也可以跨越物種邊界來生產(chǎn)新的作物。其核心在于具有表達(dá)優(yōu)良性狀能力的外源基因的導(dǎo)入，通過后代篩選保留該優(yōu)良性狀。與轉(zhuǎn)基因作物育種不同的是，基因編輯作物育種僅用于編輯作物內(nèi)源基因，且可以通過后代的雜交分離將導(dǎo)入的外源基因剝離，所以經(jīng)過基因編輯育種獲得的品種完全不含外源基因。

未來基因編輯育種技術(shù)在作物改良育種方面的發(fā)展大概有以下幾種思路：第一，許多作物的全基因組測序已經(jīng)完成，而大多數(shù)已測序的基因功能仍未知。通過基因敲除創(chuàng)建全基因組水平的大規(guī)模突變體文庫是該工具未來應(yīng)用的必然趨勢，此舉對于功能基因組研究與作物改良具有重要意義；第二，作物的優(yōu)良性狀往往依賴復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控，而除了敲除外該工具還可以通過調(diào)控基因的上下游序列或轉(zhuǎn)錄因子致使某些基因表達(dá)或被抑制。甚至該工具可直接調(diào)控RNA，在不影響遺傳的情況下直接在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控，這可以直接用來評估調(diào)控區(qū)域與表型的關(guān)系進(jìn)而促進(jìn)作物育種；第三點(diǎn)是優(yōu)秀的品系往往需要集各種優(yōu)良性狀于一身，這需要多個控制優(yōu)良性狀的基因組同時表達(dá)，因此能夠同時操控并調(diào)控多個基因的基因編輯技術(shù)具有重要的應(yīng)用價值［100］。

利用基因編輯技術(shù)進(jìn)行作物改良育種的優(yōu)勢已經(jīng)顯而易見，但在能否市場化的問題上還存在較大爭議。到目前為止，歐盟已經(jīng)批準(zhǔn)了大約118種轉(zhuǎn)基因生物，但大多數(shù)轉(zhuǎn)基因生物是用來喂養(yǎng)動物的，只有極少數(shù)是供人類直接食用，歐洲幾乎沒有轉(zhuǎn)基因食品的市場，基因編輯作物被一并認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)物并按照該技術(shù)對其進(jìn)行監(jiān)管［101］。與歐盟的態(tài)度不同，2016年賓夕法尼亞大學(xué)利用基因編輯培育的抗褐變蘑菇，在美國并未受到監(jiān)管［102］。此舉標(biāo)志著美政府對該技術(shù)的緩和態(tài)度，而在2018年，美國農(nóng)業(yè)部正式發(fā)布聲明，表示不會對一些新育種技術(shù)的作物進(jìn)行監(jiān)管，而其中就包括基因編輯技術(shù)。

由于各國對于基因編輯及其產(chǎn)物定義并不統(tǒng)一，因此各國的管理方法與管理現(xiàn)狀也不盡相同。而對于全世界來說，這種新穎的生物技術(shù)所帶來的意義十分深遠(yuǎn)，其不光在農(nóng)業(yè)與醫(yī)學(xué)方面帶來全新的局面，還會對社會的經(jīng)濟(jì)貿(mào)易方面造成影響。只是現(xiàn)在這種不穩(wěn)定的局面還無法讓其飛速拓展開來，但隨著基礎(chǔ)研究的加深與其他學(xué)科的發(fā)展，該技術(shù)定將獲得大眾接受并廣泛應(yīng)用。中國作為農(nóng)業(yè)大國，其糧食作物產(chǎn)量近年來屢創(chuàng)新高，但這些產(chǎn)量的背后是除草劑與化肥的不合理使用造成的環(huán)境破壞問題與無法應(yīng)對日漸惡劣的環(huán)境而逐漸枯竭的優(yōu)良品種?；蚓庉嫾夹g(shù)對于中國農(nóng)業(yè)的發(fā)展以及提高產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新能力具有重大意義。相信在不久的將來，我國將具備該技術(shù)的成熟體系，并將其產(chǎn)業(yè)化以服務(wù)農(nóng)業(yè)，在新的農(nóng)業(yè)革命當(dāng)中領(lǐng)先于世界。