新型冠狀病毒實時熒光雙重逆轉(zhuǎn)錄RPA的建立及其在食品檢測中的應(yīng)用

呂繼洲 吳紹強 張舟 鄧俊花 袁向芬 王彩霞 馮春燕 林祥梅

（中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

自2019年12月以來，新型冠狀病毒（SARSCoV-2）所致的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）在湖北省武漢市暴發(fā)蔓延，感染人數(shù)不斷增加。根據(jù)約翰霍普金斯大學(xué)數(shù)據(jù)顯示，截至北京時間2020年11月6日07時03分，全球累計新冠肺炎確診病例4897萬例，死亡病例123萬，傳染力遠超2003年的非典型肺炎（SARS）［1］。

SARS-CoV-2是β屬單股正鏈RNA病毒，具有典型的5'端帽結(jié)構(gòu)和3'端Poly（A）尾，屬于巢狀病毒目、冠狀病毒科。冠狀病毒分為α、β、γ、δ四個屬，因其在電鏡下的形狀似皇冠，故命名為冠狀病毒［2］。SARS-CoV-2基因在同一條編碼鏈上有5個典型的開放讀碼框架（ORF），包括開放讀碼框架1ab多蛋白（ORF1ab，7096 aa），刺突糖蛋白（Spike gene，S gene，1273 aa），包膜蛋白（Envelope gene，E gene，75 aa），膜蛋白（Membrane gene，M gene，222 aa）以及核衣殼蛋白（Nucleocapsid gene，N gene，419 aa）［3］。SARS-CoV-2感染機體后，病毒RNA是最先能被檢測的標志物，人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體（IgM、IgG）滯后于病毒核酸，目前對COVID-19確診基本以SARS-CoV-2病毒核酸檢測陽性為依據(jù)［4］。截止到2020年4月7日，國家藥監(jiān)局審批的新型冠狀病毒檢測試劑盒共25個，其中有16個試劑盒是核酸檢測方法。實時熒光RT-PCR敏感度高、特異性強，成本較低，成為目前主要的檢測方法。與此同時，宏基因高通量測序技術(shù)、數(shù)字PCR、LAMP、RPA以及基因芯片技術(shù)也已經(jīng)應(yīng)用于SARS-CoV-2核酸檢測［4］。SARS-CoV-2病毒可能來源于蝙蝠以及穿山甲等動物［5-6］。因此，在動物組織和動物源性食品中開展SARS-CoV-2病毒的檢測監(jiān)測就成為防控COVID-19疫情的一個重要環(huán)節(jié)，目前尚未有相關(guān)SARS-CoV-2檢測技術(shù)在食品及動物組織中應(yīng)用的報道。

重組酶聚合酶擴增技術(shù)（Recombinase polymerase amplification，RPA）是2006年P(guān)iepenburg等研發(fā)出的一種等溫擴增技術(shù)，它能在37-42℃恒溫條件下快速完成數(shù)十億DNA擴增。RPA反應(yīng)體系中主要包括重組酶（uvsX）、單鏈結(jié)合蛋白（Gp32）和鏈置換DNA聚合酶Bsu，其反應(yīng)原理不同于體外DNA復(fù)制的PCR技術(shù)，重組酶uvsX在常溫下就能打開DNA雙鏈進行變性，因此不需要熱循環(huán)PCR儀［7］。RPA反應(yīng)技術(shù)靈敏度高，反應(yīng)快速，方法簡便易行。本研究目的為建立針對SARS-CoV-2的熒光RPA快速檢測技術(shù)，并初步應(yīng)用于食品、動物組織器官以及臨床樣本中SARS-CoV-2的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗中所需引物、探針以及靶標基因由北京六合華大基因科技有限公司合成并提供；食品（包括生羊肉片、生豬肉、熟牛肉、熟雞肉、香腸以及速凍水餃）購自7fresh生鮮超市；實驗用5-6周的Balb/C雌鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；SARS-CoV-2病毒cDNA核酸由浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；6份SARS-CoV-2病毒疑似臨床樣本（編號：2011、2012、2013、2014、2015及2016）由上海市臨床檢驗質(zhì)量控制中心提供。H1N1甲型流感病毒（influenza A/H1N1 virus）、冠狀病毒豬流性腹瀉病毒（PEDV）、冠狀病毒豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、小反芻獸疫病毒（PRRV）、口蹄疫病毒（FMDV）、輪狀病毒（RV）等其核酸RNA由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動物檢驗與檢疫研究所實驗室保存。SARS-CoV-2病毒S基因全長質(zhì)粒2019-nCoV S由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，質(zhì)粒載體為pUC57。

1.2 方法

1.2.1 RNA核酸的提取 相關(guān)樣品材料的RNA核酸提取均采用“Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit”試劑盒（Qiagen，Hilden，Germany），并按使用說明書操作。

1.2.2 SARS-CoV-2假病毒顆粒制備 以GenBank公布Wuhan-Hu-1分離株（登錄號為NC_045512.2）基因序列為基準，選擇N基因部分序列進行拼接重組，基因序列總長914 bp，加酶切位點后，送華大基因進行人工合成，連入噬菌體表達載體p-MS2。經(jīng)過一系列表達與純化，獲得SARS-CoV-2的假病毒顆粒（VLPs），使用SM（0.1 mol/L NaCl，8 mmol/L MgSO4·7H2O，50 mmol/L Tris-Cl pH7.5，2%明膠溶液）溶液重懸VLPs，作為陽性質(zhì)控品，模擬病毒。

1.2.3 RPA引物探針的設(shè)計 按照RPA引物探針設(shè)計原則［8］，分析SARS-CoV-2的N基因以及S基因保守序列，設(shè)計兩套RPA引物、探針（表1）。

表1 RPA試劑引物探針設(shè)計與序列

1.2.4 熒光RT-RPA反應(yīng) RNA恒溫快速擴增試劑盒（熒光型）購自濰坊安普未來生物科技有限公司，貨號WLRE8205KIT，含有逆轉(zhuǎn)錄酶、重組酶、聚合酶等，以RNA核酸為模板可在20 min內(nèi)完成檢測全過程。單重?zé)晒釸PA反應(yīng)體系（50 μL）：Buffer A 29.4 μL，上下游引物各2 μL（10 μmol/L），探針0.6 μL（10 μmol/L），核酸模板 2 μL，RNase-free Water 9.3 μL，ROX染料0.2 μL，Buffer B 2.5 μL。雙重?zé)晒釸PA反應(yīng)體系（50 μL）：Buffer A 29.4 μL，上下游引物1各1 μL（10 μmol/L），探 針1 0.4 μL（10 μmol/L），上下游引物2各1 μL（10 μmol/L），探針2 0.4 μL（10 μmol/L），核酸模板2 μL，RNase-free Water 9.1 μL，ROX染料0.2 μL，Buffer B 2.5 μL。反應(yīng)條件設(shè)置為：42℃，20 min，每30 s收集一次熒光信號。儀器自動采集熒光信號，可實時觀察熒光擴增信號，使用ABI的7500熒光PCR儀。為了保證反應(yīng)同時進行，2.5 μL Buffer B應(yīng)該最后加在八連管的蓋子上，小心翻轉(zhuǎn)蓋上，然后上下顛倒八連管混勻，離心。整個操作過程要在冰上進行。RPA 反應(yīng)在 42℃恒溫下反應(yīng)4 min 后，取出反應(yīng)管進行渦旋震蕩并離心，再在42℃恒溫下反應(yīng)16 min。

1.2.5 N基因熒光RPA分析敏感度試驗取50 μL的VLPs，RNA核酸由Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取，最終用50 μL Elution Buffer 洗脫RNA，放置于-80℃保存或直接用于RPA檢測。提取VLPs核酸RNA，應(yīng)用微滴式逆轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR對VLPs所含RNA進行精確定量（N基因拷貝數(shù)，結(jié)果未展示），其濃度為5.32×105copies/μL。然后經(jīng)稀釋，調(diào)整，使N基因拷貝數(shù)濃度為5×104-5 copies/μL，RPA反應(yīng)體系加入2 μL核酸，反應(yīng)體系中核酸終濃度為105-10 copies/μL。

1.2.6 S基因熒光RPA分析敏感度試驗 以生工生物工程（上海）股份有限公司提供的2019-nCoV S質(zhì)粒為模板，按照其濃度拷貝數(shù)換算公式1.492×1011copies/μg，經(jīng)系列倍比稀釋，使得2019-nCoV S質(zhì)?？截悢?shù)濃度為5×104-5 copies/μL。RPA反應(yīng)體系加入2 μL模板，最終濃度為105-10 copies/μL。

1.2.7 熒光RPA分析特異性試驗 以influenza A/H1N1、PEDV、TGEV、PRRV、FMDV、RV等病毒的核酸RNA為模板，進行熒光RT-RPA反應(yīng)。SARS-CoV-2的cDNA作為陽性對照，而Rnase-free water作為陰性對照。

1.2.8 熒光RPA應(yīng)用于食品中檢測SARS-CoV-2 6種常見食品，各取50 mg；陽性組，每份樣品與10 μL新冠病毒VLPs混合；對照空白組，每份樣品與10 μL SM溶液混合。RNA核酸由Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取，最終應(yīng)用50 μL Elution Buffer 洗脫RNA，放置于-80℃保存或直接用于RPA檢測。SARS-CoV-2的cDNA作為陽性對照，而Rnase-free water作為陰性對照。

1.2.9 熒光RPA應(yīng)用于動物組織中檢測SARSCoV-2 5-6周的Balb/C雌鼠，實驗組尾靜脈注射100 μL SARS-CoV-2的VLPs，靜置15 min；對照組選用同一批5-6周的Balb/C雌鼠，尾靜脈注射100 μL SM溶液，靜置15 min。取心、肝、脾、肺、腎及肌肉組織（大腿）各50 mg，RNA核酸由Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取，最終應(yīng)用50 μL Elution Buffer 洗脫RNA，放置于-80℃保存或直接用于RPA檢測。SARS-CoV-2的cDNA作為陽性對照，而Rnase-free water作為陰性對照。

1.2.10 熒光RPA應(yīng)用于臨床樣本中檢測SARSCoV-2 上海市臨床檢驗質(zhì)量控制中心提供的樣本為滅活的臨床樣本，600 μL/支。提取RNA時，取100 μL樣品，用Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取，最終應(yīng)用50 μL Elution Buffer 洗脫RNA，放置于-80℃保存或直接用于RPA檢測。SARSCoV-2的cDNA作為陽性對照，而Rnase-free water作為陰性對照。

本研究涉及所有熒光RPA檢測，包括靈敏度、特異性分析以及樣品檢測，每組試驗均獨立重復(fù)3次，結(jié)果一致的，展示其中一次結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 RPA引物探針靈敏度

首先，以倍比稀釋的SARS-CoV-2病毒VLPs以及2019-nCoV S質(zhì)粒作為模板，應(yīng)用單重?zé)晒釸PA檢驗比較NF/NR/NP以及SF/SR/SP 兩組引物探針組合的敏感性，結(jié)果顯示SF/SR/SP組合的分析敏感性優(yōu)于NF/NR/NP。SARS-CoV-2雙重?zé)晒釸PA方法選擇NF/NR/NP及SF/SR/SP組合。

雙重?zé)晒釸PA反應(yīng)體系下，以S基因為靶標基因的SF/SR/SP引物探針組合分析敏感度可達10 copies/reaction（圖1），與WHO推薦的實時熒光PCR檢測方法基本一致；以N基因為靶標基因的NF/NR/NP引物探針組合分析敏感度（檢測限值）可達102copies/reaction（圖2）。

圖1 雙重?zé)晒釸T-RPA針對S基因的分析靈敏度檢測

2.2 RPA引物探針特異性

以influenza A/H1N1、PEDV、TGEV、PRRV、FMDV、RV等病毒的核酸RNA以及SARS-CoV-2的cDNA為模板，進行雙重?zé)晒釸T-RPA檢測，結(jié)果只有SARS-CoV-2的cDNA模板出現(xiàn)擴增條帶（圖3），說明該方法具有良好的特異性。

圖2 雙重?zé)晒釸T-RPA針對N基因的分析靈敏度檢測

圖3 雙重?zé)晒釸T-RPA分析特異性檢測

2.3 熒光RPA應(yīng)用于食品中SARS-CoV-2的VLPs檢測

將6種生或熟制食品與新冠病毒VLPs混合，與此同時，6種食品與SM溶液混合作為對照，提取RNA核酸，用做熒光RPA中的模板。結(jié)果（圖4）顯示：6種食品，包括生豬肉、生羊肉、熟牛肉、香腸、熟雞肉及速凍餃子，不影響應(yīng)用RPA熒光檢測技術(shù)從中檢測SARS-CoV-2的VLPs，添加了VLPs顆粒的樣品呈現(xiàn)陽性，無VLPs添加樣品食品均為陰性。

2.4 熒光RPA應(yīng)用于動物組織中SARS-CoV-2的VLPs檢測

取尾靜脈注射100 μL SARS-CoV-2的VLPs的Balb/C小鼠的相關(guān)組織，注射SM溶液的Balb/C小鼠作為空白對照，提取RNA核酸，用做熒光RPA中的核酸模板。結(jié)果（圖5）顯示：心、肝、蜱、肺、腎、肌肉等動物組織樣品不影響應(yīng)用RPA熒光檢測技術(shù)從中檢測SARS-CoV-2的VLPs，添加了VLPs顆粒的樣品呈現(xiàn)陽性，無VLPs添加樣品動物組織均為陰性。

圖4 雙重?zé)晒釸T-RPA食品中檢測新冠病毒VLPs

圖5 雙重?zé)晒釸T-RPA食品中檢測小鼠組織中VLPs

2.5 熒光RPA應(yīng)用于臨床樣本檢測

提取6支臨床樣本的RNA核酸，作為熒光RPA中的模板。結(jié)果顯示：臨床樣本2012/2014/2015/2016為陽性，2011/2013樣本為陰性（圖6-7）。經(jīng)上海市臨床檢驗質(zhì)量控制中心審核，臨床樣本檢測結(jié)果符合率100%，獲得上海市臨床檢驗中心組織頒發(fā)的證書。

3 討論

熒光RT-RPA作為實時熒光RT-PCR的替代技術(shù)，其可在37-42℃下恒溫擴增目標核酸，免去了傳統(tǒng)PCR技術(shù)所需要的升降溫過程。以實時熒光PCR為例，其整個檢測過程約為80 min，包括20 min反轉(zhuǎn)錄以及60 min的PCR擴增及檢測過程，而熒光RT-RPA檢測過程總計為20 min，節(jié)約檢測時間1 h。此外，接近于室溫的恒溫擴增條件，也簡化了儀器設(shè)備中的升溫、降溫模塊，使得熒光RPA檢測儀器的小型化、手持化成為現(xiàn)實［9］。

圖6 雙重?zé)晒釸T-RPA檢測臨床樣本（S基因）

圖7 雙重?zé)晒釸T-RPA檢測臨床樣本（N基因）

樣品前處理及RNA核酸提取是病毒核酸檢測的首要步驟。目前病毒核酸提取主要方法有離心柱法和磁珠法［10］。離心柱法采用特殊的硅基質(zhì)吸附材料吸附核酸，核酸純度高，操作標準化，但是也存在耗時長、提取步驟反復(fù)離心等缺點。磁珠法應(yīng)用復(fù)合磁性微球，其表面連接可特異性可逆吸附核酸的功能基團，利用磁場實現(xiàn)核酸的富集與分離純化，具有靈敏度高、自動化、高通量等優(yōu)勢，但整個提取過程耗時長，且成本較高。近期，一些病毒RNA核酸快速提取試劑上市，其基本原理減少核酸提取步驟，僅保留核酸裂解步驟［11］。通過去污劑以及95℃加熱等破壞病毒外殼釋放病毒核酸，同時加入RNA核酸穩(wěn)定劑防止核酸降解，全程僅需5 min，配合熒光RT-RPA檢測方法，可將整個SARS-CoV-2檢測時間縮短到30 min內(nèi)，適用于COVID-19的食品、動物產(chǎn)品以及快速現(xiàn)場檢疫篩查及監(jiān)管執(zhí)法等特殊場景，具有明顯的優(yōu)勢。然而，RNA核酸快速提取技術(shù)還不完善，其缺點為敏感度不高、核酸提取效率低、僅適用于咽喉拭子等簡易樣本等缺點，新一代的高靈敏度快速核酸提取技術(shù)尚待進一步研發(fā)。

目前，國家批準的新冠病毒的核酸檢測試劑基本是通過靶向特定區(qū)域，對病毒的ORF1ab、N基因、E基因、S基因等位點開展檢測，以雙靶標為主，單靶標和三靶標均比較少見［12］。本研究建立的雙重?zé)晒釸T-RPA檢測方法，以N基因和S基因作為雙靶標。N基因編碼的N蛋白是SARS-CoV-2的核衣殼蛋白，位于病毒內(nèi)部，在β屬冠狀病毒之間相對比較保守，此外N蛋白還是干擾素（Interferon，IFN）的拮抗劑和病毒編碼的RNA干擾抑制因子，常用作冠狀病毒檢測的靶點［13］。S基因編碼的S蛋白位于病毒外殼，通過識別宿主細胞受體介導(dǎo)病毒和細胞膜融合在病毒感染中發(fā)揮重要作用。S蛋白是宿主中和抗體的重要作用位點以及疫苗（尤其是多肽和mRNA疫苗）、治療性抗體、小分子和診斷開發(fā)的關(guān)鍵靶點［14］。目前，正在研發(fā)的核酸疫苗（mRNA疫苗和DNA疫苗）基本是以S基因為基礎(chǔ)，導(dǎo)入宿主細胞后產(chǎn)生S蛋白抗原，刺激機體產(chǎn)生體液及細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。美國制藥公司Moderna研發(fā)的mRNA疫苗就是攜帶S基因，第一批疫苗（mRNA-1273）已經(jīng)開展了臨床試驗（NCT04283461）［14］。本研究建立的雙重?zé)晒釸PA檢測方法，可用于感染或免疫初期區(qū)分鑒定以S基因為基礎(chǔ)的核酸疫苗免疫還是SARS-CoV-2病毒野毒株感染。長期看，區(qū)分免疫還是感染應(yīng)以檢測以S蛋白或N蛋白為靶標的特異性抗體的免疫學(xué)方法為主。

近期，國內(nèi)外報道SARS-CoV-2病毒可感染犬、貓等寵物，另有研究證實SARS-CoV-2可在雪貂和貓的呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)高效復(fù)制，存在空氣傳播COVID-19的可能［15］。目前，作為人畜共患病病原，SARS-CoV-2病毒感染動物并通過食品鏈傳入餐桌的可能性不能完全排除。因此，在食品、動物組織中開展SARS-CoV-2病毒的檢測監(jiān)測工作可以進一步阻斷COVID-19通過動物源性食品傳播的可能。然而，食品、動物組織樣品基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的油脂、蛋白甚至植物纖維，對核酸提取、檢測方法的影響未可知。本研究采用假病毒顆粒替代SARS-CoV-2，可提供從病毒核酸提取到檢測的全流程質(zhì)控，證實了本研究建立的雙重?zé)晒釸T-RPA檢測方法可用于食品、動物組織以及臨床樣本中SARS-CoV-2檢測，應(yīng)用場景豐富，檢測效果良好。

4 結(jié)論

本研究建立的SARS-CoV-2病毒熒光RPA檢測方法，操作簡便，檢測速度快（20 min），靈敏度高、特異性好、雙靶標，經(jīng)試驗此方法適用于在食品、動物組織器官以及臨床樣本中檢測SARS-CoV-2病毒。