基于核酸適配體傳感器檢測食品致病菌的研究進(jìn)展

王琦 顏春蕾 高洪偉 吳薇 楊慶利

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)機電工程學(xué)院，青島 266109）

食源性致病菌，如沙門氏菌、鏈球菌、大腸桿菌和弧菌等，是通過食品為媒介引起食物中毒的致病性細(xì)菌。常見的感染并發(fā)癥，包括急性腸胃炎、腹瀉、頭痛、嘔吐，甚至死亡。全球食源性病原體感染呈上升態(tài)勢［1-2］，世界衛(wèi)生組織表示，每年全世界有數(shù)十億例由食源性致病菌引發(fā)的食物中毒事件。美國每年有4 800萬人因食源性疾病而患病，導(dǎo)致12.8萬人住院，3 000人死亡，損失156億美元［3］。在美國和加拿大，由大腸桿菌O157：H7污染綠葉蔬菜引發(fā)的食源性疾病時常發(fā)生，這對種植者，生產(chǎn)者和公眾安全產(chǎn)生了巨大的威脅［4］。在中國，對食品安全威脅最大的也是由食源性病原體污染造成的。2014年，中國31個監(jiān)測地區(qū)共上報食源性疾病暴發(fā)事件1 480起，累計發(fā)病17 651人，死亡111人［5］。估算結(jié)果表明，食源性致病菌污染給公共衛(wèi)生帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，給地方政府帶來了沉重的財政負(fù)擔(dān)。因此，準(zhǔn)確、早期診斷食源性致病菌有助于控制和預(yù)防感染的傳播；此外，對食源性致病菌進(jìn)行有效的鑒定至關(guān)重要。

近年來，以核酸為基礎(chǔ)的檢測方法被廣泛用于檢測食源性致病菌［6-7］。這些分析可分為兩大類：核酸作為檢測標(biāo)志物和擴(kuò)增模板，核酸作為檢測探針。前一類方法與基于培養(yǎng)的方法相比，PCR是一種快速、靈敏、特異的檢測各種病原體的標(biāo)準(zhǔn)方法［8］。PCR方法存在一個局限性：不能區(qū)分活的病原體和死的病原體，因為活的和死的病原體細(xì)胞都可以釋放DNA。此外，在食品樣品中應(yīng)用PCR技術(shù)還存在一定的困難，因為很多食品樣本中的PCR抑制劑會造成假陽性或陰性結(jié)果。對于后一類，外源性適配體是病原體常用的探針［9-10］。出于診斷目的，適體是抗體的合適替代品［11］。

適配體是（25-90 nt）單鏈核酸分子（DNA或RNA）通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）產(chǎn)生，SELEX是一種體外選擇技術(shù)。作為生物識別元件，適配體能識別各種高特異性的靶標(biāo)，包括離子、藥物、真菌毒素、病原體或整個細(xì)胞［12-13］。適配體對特定靶標(biāo)具有良好的親和力，其解離系數(shù)（Kd值）范圍在pmol/L到mmol/L之間。與抗體相比，適配體對溫度、pH和離子強度等具有更高的穩(wěn)定性，更容易合成和修飾，生命周期更長，成本更低?；谶m配體的優(yōu)勢，適配體在構(gòu)建基于適配體的檢測和傳感器方面受到了廣泛關(guān)注，分別稱為適配體檢測和適配體傳感器［14-15］。到目前為止，已經(jīng)建立了不同的適配體傳感器用于檢測食源性致病菌，包括大腸桿菌［16］、金黃色葡萄球菌［17］、沙門氏菌［18］、副溶血性弧菌［19］、彎曲桿菌［20］、李斯特菌屬［21］、志賀氏桿菌屬［22］。適配體傳感器簡單快速，不需要繁瑣的清洗和濃縮步驟。在這篇綜述中，我們著重介紹了用于食源性致病菌的適配體傳感器的最新進(jìn)展。我們還評估了報道的適配體傳感器的優(yōu)越性和局限性，以確定一個合理的設(shè)計食源性病原體適配體傳感器。

1 食品病原適配體篩選技術(shù)

從核酸的DNA或RNA隨機文庫中通過體外選擇獲得適配體。SELEX被用來選擇識別各種目標(biāo)的適配體，包括小分子、蛋白質(zhì)、細(xì)菌和病毒、細(xì)胞系甚至整個細(xì)胞。Cell-SELEX是指以活細(xì)胞（細(xì)菌、病毒和細(xì)胞）為靶點進(jìn)行適配體篩選的體外方法。相比于其他SELEX，Cell-SELEX的優(yōu)勢在于：（1）Cell-SELEX產(chǎn)生適配體探針可能有助于準(zhǔn)確的檢測和疾病診斷，因為它使用細(xì)胞表面的分子作為靶標(biāo)；（2）與其他蛋白或分子SELEX不同的是，Cell-SELEX方法不需要提前知道生物標(biāo)志物，而高純度的重組蛋白或分子是選擇適配體所必需的。通常，一個成功的適配體Cell-SELEX發(fā)現(xiàn)新的未知生物分子，并將其劃分為潛在的生物標(biāo)志物；（3）在Cell-SELEX中，靶分子均為天然構(gòu)象，降低了處理靶分子構(gòu)象的復(fù)雜性。此外，不需要將細(xì)胞固定在固體載體上。

另一方面，在Cell-SELEX中仍然存在某些技術(shù)挑戰(zhàn)。（1）針對細(xì)胞表面低表達(dá)蛋白的適配體不易篩選；（2）所用細(xì)胞應(yīng)能存活，生長正常，減少非特異性結(jié)合；（3）與其他SELEX相比，Cell-SELEX需要進(jìn)行多輪的篩選才能獲得高選擇性和親和的適配體，這需要花費更多的金錢和時間。幸運的是，我們已經(jīng)做了大量工作來應(yīng)對這些挑戰(zhàn)。

通常，文庫中的寡核苷酸包含一個20-60 nt的隨機區(qū)，兩側(cè)各有兩個20 nt的恒定區(qū)，用于引物結(jié)合和PCR擴(kuò)增。與單鏈DNA文庫不同，T7 RNA聚合酶的啟動子序列被引入單鏈DNA文庫的50末端區(qū)域，以生成RNA文庫［23］。篩選技術(shù)分為兩類：SELEX和Non-SELEX。

1.1 SELEX法篩選食源性病原體適配體

SELEX過程是篩選適配體通用的過程，包含5個主要步驟的重復(fù)（結(jié)合、分割、洗脫、擴(kuò)增和調(diào)整）。SELEX的方案如圖1所示。首先，合成一個隨機DNA文庫。核酸文庫的序列由中間的隨機序列和兩端作為引物結(jié)合位點的固定序列組成。隨機區(qū)通常為20-40 nt，其中包含的序列庫容量為1013到1015。第二，在合適的條件下將核酸跟特定的靶標(biāo)病原體一起孵育。第三，將弱結(jié)合和未結(jié)合的核酸從特異性結(jié)合到靶上的核酸中分離出來，用PCR或?qū)崟r熒光定量PCR（Real time-PCR，RT-PCR）的方法從靶上洗脫并作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。分離是篩選適配體最關(guān)鍵的步驟之一，它嚴(yán)重影響所選擇適配體的結(jié)合常數(shù)。整個SELEX過程需要多次重復(fù)，以獲得對目標(biāo)具有最高親和力和特異性的核酸。所需輪數(shù)取決于許多因素，如靶標(biāo)特征和濃度、啟動隨機寡核苷酸庫的設(shè)計、篩選條件或分離方法的效率。最后一輪SELEX在擴(kuò)增步驟結(jié)束后被終止，PCR產(chǎn)物被克隆以獲得單個的適配體克隆，這些克隆隨后被測序［24］。對于RNA適配體的SELEX，RNA的 SELEX步驟還包括一個附加步驟即該結(jié)合RNA應(yīng)作為隨后的PCR擴(kuò)增反向轉(zhuǎn)錄到cDNA［25］。

圖1 利用SELEX篩選食源性致病菌適配體的示意圖

除了篩選過程外，對靶標(biāo)具有較高親和力的序列也逐漸豐富了文庫。經(jīng)過5-15輪SELEX，可以獲得適配體。最后，對文庫進(jìn)行克隆和測序，確定每個適配體的序列。適配體的結(jié)構(gòu)分析可用于評價適配體對靶標(biāo)的親和性。為了篩選病原體適配體，常采用全細(xì)胞SELEX、磁珠SELEX和親和層析SELEX［26-27］。在全細(xì)胞SELEX中，整個細(xì)菌細(xì)胞被用作靶細(xì)胞，以擴(kuò)大篩選范圍并避免靶細(xì)胞富集［28］。在磁珠SELEX中，復(fù)合材料的球體表面有利于最大化靶標(biāo)暴露和易于分離。親和層析SELEX的優(yōu)點是成本低，重復(fù)性好，易于測定結(jié)合位點［29］。

1.2 Non-SELEX法篩選食源性病原體適配體

SELEX的篩選方法需要進(jìn)行多輪的擴(kuò)增和分離，這是一個非常耗時的過程。因此，如何快速獲得理想的適配體成為關(guān)鍵技術(shù)。Non-SELEX是2006年Berezovski等［30］首次報道的毛細(xì)管電泳的一種變體，在隨后的每一輪中都不需要PCR擴(kuò)增和鏈分離。非平衡混合毛細(xì)管電泳一種典型的Non-SELEX方法，是一種高效的分離方法。Non-SELEX首先用于h-RAS適配體的篩選。與SELEX不同，Non-SELEX是一種更有效的篩選方法，不需要PCR步驟。經(jīng)過2-3輪的分離和篩選，可以獲得靶標(biāo)的特異性適配體。Maeng等［31］報道了用非平衡毛細(xì)管電泳法經(jīng)過3輪Non-SELEX篩選出大腸桿菌O55：B5脂多糖的適配體。一般SELEX包括8-15輪篩選耗時1-3個月。然而，Non-SELEX只需要數(shù)小時到數(shù)天的適體篩選，這比SELEX過程更短，更容易。而Non-SELEX的局限性是毛細(xì)管電泳僅適用于大分子物質(zhì)。

適體的Non-SELEX有3個主要特征。（1）Non-SELEX快速而簡單：Non-SELEX篩選耗時僅為1 h，可以使用商用毛細(xì)電泳儀器以自動化方式執(zhí)行；（2）可以準(zhǔn)確地確定一個DNA文庫中的適配體；（3）Non-SELEX最顯著的優(yōu)點是它適用于非擴(kuò)增DNA文庫，如通過DNA合成獲得標(biāo)簽修飾DNA。標(biāo)簽可以與磁珠或其他功能納米粒子結(jié)合，從而獲得新的Non-SELEX策略。這些特性使Non-SELEX成為藥物發(fā)現(xiàn)中潛在的不可或缺的工具。

無論是SELEX還是Non-SELEX，都沒有針對任何靶標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化選擇模式。適配體的選擇過程經(jīng)過多年的改進(jìn)，變得更高效、更省時，達(dá)到更高的特異性和親和度。表1總結(jié)了經(jīng)不同SELEX方式篩選得到的食源性病原體（大腸桿菌，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等）的適配體。這些適配體可直接用于建立適配體傳感器，從而快速、靈敏、特異地檢測食源性病原體。

2 食源性致病菌的適配體傳感器

病原體檢測是食品安全和公眾健康的關(guān)鍵。食源性致病菌的3個主要應(yīng)用領(lǐng)域是食品工業(yè)、環(huán)境質(zhì)量控制和臨床診斷。近幾年在檢測病原體相關(guān)的基礎(chǔ)研究、方法性能研究和新應(yīng)用方法的開發(fā)方面做出了巨大的貢獻(xiàn)［51-52］。

表1 不同篩選方法得到的食源性致病菌的適配體

迄今為止，適配體傳感器很少應(yīng)用于食品安全和公共衛(wèi)生［53］。其核心原因可能是適配體傳感器和樣品提取、純化、富集和分離過程過于復(fù)雜。食源性致病菌檢測是影響公眾健康和食品安全的重要因素。接下來的工作應(yīng)轉(zhuǎn)到基礎(chǔ)研究、方法性能研究和發(fā)展新的應(yīng)用方法上［54］。與傳統(tǒng)的免疫傳感器相比，適配體傳感器在識別生物傳感器方面具有許多優(yōu)勢：適配體體積小，化學(xué)穩(wěn)定性好，性價比高?；谶@些特性，許多基于適配體的生物傳感器被用于檢測食源性病原體［55-56］。適配體傳感器通常根據(jù)轉(zhuǎn)換平臺（比色、光學(xué)、熒光、電化學(xué)、表面增強拉曼、試紙條傳感器）進(jìn)行分類的。表2比較了已報道的用于食源性致病菌檢測的適配體傳感器的優(yōu)缺點、LOD值和檢測范圍。此外，我們對已報道的用于食源性病原菌檢測的適配體生物傳感器進(jìn)行了綜述和分類（圖2）。

表2 用于食源性致病菌檢測的傳感器的性能比較

圖2 病原體檢測常用傳感器示意圖

2.1 比色適配體傳感器

比色傳感器是將目標(biāo)信號轉(zhuǎn)化為顏色變化的過程，由于其可以直觀讀出結(jié)果、方便、操作簡單等優(yōu)點而受到廣泛關(guān)注［64］。比色法的關(guān)鍵技術(shù)是顯色底物和催化酶的選擇。辣根過氧化物酶和G-四聯(lián)體都具有DNA催化酶的特點，可以催化底物產(chǎn)生比色信號。以G-四聯(lián)體和辣根過氧化物酶為信號放大器的適配體，因為簡單、穩(wěn)定性好、價格低廉等優(yōu)點，已被應(yīng)用于多種靶標(biāo)的檢測［65］。Sun等［57］基于G-四聯(lián)體構(gòu)建了一種用于副溶血性弧菌檢測的比色傳感器。首先將適配體及其互補序列固定在磁珠上。當(dāng)出現(xiàn)副溶血弧菌時，適配體優(yōu)先與副溶血弧菌結(jié)合，互補鏈游離出來，與氯高鐵血紅素結(jié)合形成G-四聯(lián)體，加入的靶標(biāo)越多，上清液就有越多的G-四聯(lián)體。添加的TMB和過氧化氫可以被G -四聯(lián)體催化產(chǎn)生藍(lán)色，達(dá)到檢測目的。

但是過氧化物酶存在保存困難、易受外界條件影響、催化活性不穩(wěn)定的缺點，而過氧化物酶的替代物將克服這一局限性。2013年，Woo［66］發(fā)現(xiàn)Fe3O4納米粒子具有辣根過氧化物酶活性，由于其具有大的表面積和可控的催化活性而得到了廣泛的應(yīng)用。目前，已經(jīng)合成了多種金屬氧化物納米粒子作為過氧化物酶模擬物，如CeO2納米粒子、Co3O4納米粒子和ZnFe2O4納米粒子［67-69］。Wu等［58］開發(fā)了一種新型的用ZnFe2O4還原氧化石墨烯（ZnFe2O4/rGO）納米顆粒作催化劑的比色適配體傳感器用于檢測鼠傷寒沙門氏菌（圖3）。將生物素修飾的適配體1固定在微板上作為捕獲探針，ZnFe2O4/rGO結(jié)合適配體2作為信號探針。在溶液中有鼠傷寒沙門氏菌時，就會形成適配體1-靶標(biāo)-適配體2-ZnFe2O4/rGO的“夾心”復(fù)合物，而ZnFe2O4/rGO可以催化H2O2氧化3，3'，5，5' -四甲基聯(lián)苯胺（TMB），生成藍(lán)色產(chǎn)物，可以在652 nm處用微閱讀器進(jìn)行檢測。緩沖液中鼠傷寒沙門菌的檢出限為11 CFU/mL，檢測范圍為11-1.10×105CFU/mL。

圖3 基于ZnFe2O4還原氧化石墨烯材料的比色傳感器用于鼠傷寒沙門氏菌檢測的原理圖（改編于［58］）

此外，另一種無標(biāo)簽傳感器是金納米粒子［70-72］。它不需要復(fù)雜的準(zhǔn)備程序或精密的儀器，并提供肉眼可見的讀數(shù)；在某些情況下，膠體金會由紅色變?yōu)樽仙?。核酸適配體容易吸附在金納米粒子表面，保護(hù)金納米粒子免受離子誘導(dǎo)的聚集。相反，適配體與金納米粒子表面解離，在目標(biāo)病原體存在時與目標(biāo)物結(jié)合，導(dǎo)致顏色從紅色變?yōu)樽仙?/p>

2.2 可見光適配體傳感器

利用機械、電子、核磁共振和光學(xué)檢測方法，已經(jīng)制造出各種用于病原體檢測的生物傳感器［73-75］。等離子體生物傳感器是一種可見光生物傳感器，具有較高的靈敏度和重復(fù)利用的能力［76］。Yang等［59］構(gòu)建了一種非共價自組裝檢測傷寒沙門菌的方法，利用DNA酶標(biāo)適配體檢測探針自組裝單壁碳納米管。在該方法中，選擇一個DNAzyme序列（P1）和適配體Apt22（P2），并將其設(shè)計為檢測探針P0與單壁碳納米管自組裝，形成穩(wěn)定的復(fù)合體。加入靶細(xì)菌和血紅素后，它們將與探針特異性結(jié)合，導(dǎo)致P0脫離碳納米管，并形成血紅素/G-四聯(lián)體。該自組裝的DNA酶充當(dāng)化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生的催化劑。通過H2O2氧化魯米諾而導(dǎo)致檢測信號的放大。該方法的檢出限為103CFU/mL（圖4）。Urmann等［60］提出了一種簡單、無標(biāo)簽且快速的光學(xué)生物傳感器，能夠特異性檢測蛋白A，金黃色葡萄球菌的特異性生物標(biāo)記物。將蛋白A的適配體固定在納米結(jié)構(gòu)的多孔硅薄膜上，作為光學(xué)傳感器元件。金黃色葡萄球菌的適體傳感器的線性檢測范圍為8-23 μmol/L，LOD為3.17 μmol/L。此外，使用了夾心法改進(jìn)的光學(xué)信號放大方法。使用這種方法，LOD提高了3倍。

圖4 基于等離子體的適配體傳感器用于傷寒沙門菌檢測的原理圖（改編于［59］）

2.3 熒光適配體傳感器

當(dāng)價電子從基態(tài)被激發(fā)到激發(fā)的單線態(tài)時，就會產(chǎn)生熒光。激發(fā)是由吸收足夠能量的光產(chǎn)生的［61］。熒光光譜法是一種對低濃度物進(jìn)行靈敏檢測的可靠方法。熒光染料分子和熒光納米材料是兩種主要的熒光信號源［77-78］。

對于前一種方法，適配體傳感器通常是在分子水平上的感應(yīng)或響應(yīng)步驟上集成的熒光分子，采用均相溶液進(jìn)行感應(yīng)。也就是用FITC、Cy3、Cy5等熒光基團(tuán)對特異性適配體進(jìn)行化學(xué)修飾，記錄其熒光強度。Zhu等［61］利用氧化石墨烯對單鏈DNA吸附能力以及熒光猝滅能力，構(gòu)建了一個信息隱寫適配體熒光平臺，用于魚病原菌的活體成像中對嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌的共同檢測。在該傳感器中，這些元件可以通過所附的熒光適配體或游離的適配體進(jìn)行編碼或解碼，其中氧化石墨烯作為鎖，目標(biāo)病原體作為公鑰，適配體結(jié)合病原體作為加密密鑰。對分子水平上多功能備件或機器的發(fā)展具有指導(dǎo)意義。

熒光多功能納米顆粒已經(jīng)被合成并成功地用于蛋白質(zhì)、病毒、細(xì)胞和病原體的分析。Wang等［79］使用了標(biāo)記有多色摻雜鑭系元素的時間分辨熒光納米粒子用于檢測鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌（圖5）。在該方法中，將適配體作為信號探針修飾在合成的摻雜鑭系元素的無機納米粒子上。Gd3+和Ce3+用作敏化劑，以增強Eu3+和Tb3+的發(fā)射熒光強度。此外，固定有適配體的Fe3O4磁納米粒子被用作捕獲探針。該方法比常規(guī)的生物檢測法具有更高的靈敏度。具有高通量，高靈敏度，快速的優(yōu)點，最低檢測限分別為15和20 CFU/mL。

圖5 用于食源性致病菌檢測的不同熒光傳感器（改編于［79］）

2.4 電化學(xué)適配體傳感器

電化學(xué)生物傳感器在各種類型的生物傳感器中具有其獨特的優(yōu)勢，即便宜且易于操作［80］。Abbaspour等［62］報道了一種基于電化學(xué)雙適配體的陽極溶出伏安法用于夾心檢測金黃色葡萄球菌（圖6）。通過生物素-鏈霉親和素親和反應(yīng)將生物素化的抗金黃色葡萄球菌適配體固定在鏈霉親和素包被的磁珠上，加入靶標(biāo)之后，適配體捕獲金黃色葡萄球菌。隨后加入修飾有第二抗金黃色葡萄球菌適配體的金納米粒子（AgNPs），適配體特異性識別靶標(biāo)形成三明治夾心結(jié)構(gòu)，從而引入信號標(biāo)簽AgNPs。最后加入硝酸以還原金離子以金原子的形式溶出在電極表面，金黃色葡萄球菌濃度越大產(chǎn)生的差分脈沖溶出伏安信號越強。該傳感器的最低檢測線低至1 CFU/mL。

圖6 用于食源性致病菌大腸桿菌檢測的電子式傳感器（改編于［62］）

無標(biāo)簽電化學(xué)檢測是電化學(xué)生物傳感器發(fā)展的一個絕佳的選擇。特殊的納米顆粒已經(jīng)廣泛應(yīng)用于構(gòu)建無標(biāo)簽傳感器用于檢測各種靶標(biāo)。Wang等開發(fā)了一種新型電化學(xué)阻抗適配體傳感器，用于快速、靈敏地檢測O157：H7型大腸桿菌［56］。鏈霉親和素包被的磁珠和生物素化的O157：H7型大腸桿菌抗體先后被固定在充滿高梯度磁場的毛細(xì)管上，隨后加入的靶標(biāo)被特異性捕獲并固定在上面。將核酸適配體和脲酶修飾到金納米粒子上，注射到毛細(xì)管中與靶標(biāo)發(fā)生反應(yīng)，形成MNPs-抗體-細(xì)菌-適配體-金納米粒子-脲酶復(fù)合物。大腸桿菌的濃度越大，引入的脲酶越多，脲酶催化尿素水解反應(yīng)從而降低了金電極的阻抗。而阻抗變化與靶濃度呈負(fù)相關(guān)。該傳感器在最優(yōu)條件下對大腸桿菌的最低檢測線為10 CFU/mL。

2.5 表面增強拉曼散射適配體傳感器

與光學(xué)、比色、熒光和電化學(xué)傳感器相比，表面增強拉曼散射（SERS）設(shè)備不需要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)就可以直接獲得分析物的SERS譜，從而將識別分子的分子譜指紋圖譜與分析結(jié)合物區(qū)分開來［81］。這種獨特的性能不僅有效地提高了樣品對矩陣干擾的選擇性，而且避免了在器件中使用傳感標(biāo)簽，簡化了設(shè)計，降低了成本。這些優(yōu)點有助于SERS在環(huán)境污染物和食品安全監(jiān)測的廣泛應(yīng)用。對于金黃色葡萄球菌，首先將樣品孵育并通過適配體-細(xì)菌-銀納米粒子復(fù)合物固定在銀納米粒子上。銀納米粒子的誘導(dǎo)極大地增強了SERS信號，因為一個細(xì)菌結(jié)合了許多適配體和銀納米粒子。在735 cm-1處觀察到SERS強度增加的信號，在10-107CFU/mL之間呈正相關(guān)，LOD低至1.5 CFU/mL。此外，很容易將金黃色葡萄球菌與病原體混合物區(qū)分開來，提高了其他類似分析的選擇性［63］。對于鼠傷寒沙門氏菌，在725 cm-1處的增加信號與其他細(xì)菌有明顯的區(qū)別［82］。

2.6 側(cè)流適配體傳感器

側(cè)流試紙條（LFS）又稱試紙測試條，是一種很有前景的現(xiàn)場檢測方法。我們的團(tuán)隊之前開發(fā)了不同類型的LFS用于核酸、金屬離子、病原體和干細(xì)胞的可視化檢測［83-85］。這些生物傳感器使用方便、靈敏、特異，并且不需要復(fù)雜昂貴的儀器。最重要的是，檢測結(jié)果可以用肉眼觀察到。試紙條適配體傳感器（LFA）是結(jié)合適配體作為識別元件的LFS。Wu等構(gòu)建了一個LFA，用于對常見海產(chǎn)品傳播的副溶血性弧菌進(jìn)行簡單直觀的檢測［19］（圖7）。該研究對兩種特定的適配體進(jìn)行了修飾，用于目標(biāo)捕獲和信號放大。當(dāng)副溶血性弧菌存在時，形成了a-適配體/靶標(biāo)/ c-適配體/磁珠復(fù)合體。然后以夾心復(fù)合物為模板進(jìn)行等溫擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的單鏈加到LFS上。整個過程可以在55 min內(nèi)完成；富集處理（20 min），等溫擴(kuò)增（30 min）和LFS測定（5 min）。在優(yōu)化條件下，副溶血性弧菌的LOD在純培養(yǎng)條件下計算低至5.6 CFU/mL。未觀察到與其他弧菌和非弧菌的交叉反應(yīng)。不需要提取DNA，簡化的操作和結(jié)果可視化使該LFA適用于臨床、食品和環(huán)境樣品中副溶血性弧菌的快速檢測。此外，這種類型的LFA也可以用于其他分析物。該研究成功地證明了LFA在食源性污染檢測中的有效性和敏感性。

圖7 用于食源性致病菌副溶血性弧菌檢測的試紙條傳感器（改編于［19］）

3 總結(jié)與展望

在過去的幾十年里，用于檢測不同分析物的各種適配體傳感器在這一領(lǐng)域受到了越來越多的關(guān)注。本文綜述了近年來應(yīng)用于食源性致病菌監(jiān)測和基于新型傳感器信號產(chǎn)生的研究進(jìn)展。

未來食源性致病菌檢測面臨的最大挑戰(zhàn)是如何在日益嚴(yán)重的食源性污染和越來越嚴(yán)格的環(huán)境友好性分析方法之間找到平衡點。正如我們所知的，適配體傳感器的化學(xué)分析是一個復(fù)雜的過程。綠色適配體傳感器存在6個重要的問題，包含樣本問題（最小樣本量），試劑問題（安全無毒試劑），儀器問題（小型化和節(jié)能儀器），轉(zhuǎn)換方法問題（自動化和現(xiàn)場信號讀?。瑥U棄物問題（合理處置廢棄物）以及操作問題（人性化）。隨著綠色分析化學(xué)的發(fā)展，食源性致病菌綠色傳感器的研制將會越來越成功。此外，這些展望將是生物傳感器領(lǐng)域的一個突破。

不可否認(rèn)生物傳感器在實際食源性致病菌檢測中仍存在一定的局限性。（1）食品樣品中通常含有多種干擾物質(zhì)（蛋白質(zhì)或糖類），可能會阻礙靶標(biāo)與適配體之間的特異性相互作用。因此，物理吸附法捕獲靶標(biāo)的穩(wěn)定性差，靈敏度低。為了解決這個問題，有必要對傳感器表面進(jìn)行修飾，以增強適配體與靶標(biāo)捕獲的固定性；（2）食品樣品中某些病原體濃度過低，無法準(zhǔn)確檢測。解決這一問題將有利于今后在提高靈敏度和選擇性以及提高樣品處理量等方面進(jìn)行創(chuàng)新。目前已有各種各樣的方法被用于信號放大，使得靈敏度更高，檢測限更低；（3）大部分報道的適配體傳感器在體外檢測食源性致病菌。因此，有必要在不進(jìn)行預(yù)富集的情況下設(shè)計用于測定體內(nèi)和復(fù)雜基質(zhì)中靶標(biāo)濃度的傳感器?？偟膩碚f，雖然還有一些障礙需要克服，但適配體傳感器在健康、環(huán)境和食品質(zhì)量領(lǐng)域具有巨大的未來潛力。

未來的發(fā)展方向是將納米技術(shù)結(jié)合到適配體傳感器中。由于納米技術(shù)具有良好的生物相容性、較高的比表面積和增強的電子傳遞性能等優(yōu)點，因此在生物傳感領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。結(jié)合了磁性納米粒子的適配體可以增強對靶標(biāo)的捕獲活性，提高選擇性。納米電極或納米材料可以顯著提高傳感器的靈敏度。應(yīng)用最小電極或磁珠來制造單個傳感裝置，為適配體對靶標(biāo)的響應(yīng)提供了新的視角。此外，芯片上實驗室納米技術(shù)具有最小的樣品負(fù)載、微電子機械傳感和高通量，是病原體生物傳感的一個理想的研究方向。