活性天然產(chǎn)物蛋白靶點(diǎn)的快速篩選策略

陳鵬

（中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700）

活性天然產(chǎn)物是來源于自然界中具有生物活性和藥用潛力的化學(xué)物質(zhì)［1-2］。從意外發(fā)現(xiàn)青霉素到從柳樹皮中提取的阿司匹林［3-4］，歷史上天然產(chǎn)物及其衍生物占創(chuàng)新藥物總數(shù)的一半以上［5］。中藥是豐富的天然產(chǎn)物資源庫，從青蒿中提取的青蒿素直到今天仍是全球抗擊瘧疾的重要武器［6］，從砒霜得到的砷制劑成為治療白血病的良藥［7］。

現(xiàn)代藥物的研發(fā)通常從靶點(diǎn)出發(fā)，經(jīng)過計算機(jī)設(shè)計，合成，篩選，藥效驗證，具有較明確的藥理毒理說明［8］，而活性天然產(chǎn)物的篩選和使用往往基于實際藥效篩選，在成藥過程中需要對其藥理和毒理進(jìn)行補(bǔ)充性研究［9］。蛋白質(zhì)是細(xì)胞功能的主要行使者，細(xì)胞依托于蛋白質(zhì)的功能完成生命周期中的各種生命活動。藥物的重要作用途徑是與蛋白質(zhì)等大分子相互作用對細(xì)胞生命活動完成調(diào)控［10-11］。篩選和揭示天然藥物的靶點(diǎn)，是天然產(chǎn)物成藥過程中藥理和毒理解釋不可或缺的環(huán)節(jié)［12-14］。藥用植物資源的提取利用是提高藥用植物資源附加值的重要方式，中藥的科學(xué)內(nèi)涵需要進(jìn)行深入研究和闡釋，尋找和鑒定中藥的藥物靶點(diǎn)特別是復(fù)方制劑，是理解其藥理和有效物質(zhì)基礎(chǔ)的關(guān)鍵步驟［15-17］。在對抗新型冠狀病毒引起的疫情（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）中，一些中藥制劑展現(xiàn)了良好的療效［18］，明確其藥物靶點(diǎn)能夠為其在國際推廣提供科學(xué)依據(jù)。

傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物的蛋白靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)是利用探針標(biāo)記的方法對天然產(chǎn)物進(jìn)行示蹤［19］，對靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行親和純化后進(jìn)行鑒定，不論是早期簡單的標(biāo)記生物素、微球還是后來發(fā)展的柔性探針，活性探針，光催化探針等都無法避免固有的缺陷，首先探針合成依賴于專業(yè)的化學(xué)平臺，合成和表征的時間長，延長了藥物研發(fā)周期，其次天然產(chǎn)物的標(biāo)記大多會改變其原有的結(jié)構(gòu)，影響其活性［20-22］。針對以上問題，近年來發(fā)展了各種基于非標(biāo)記的快速天然產(chǎn)物靶點(diǎn)篩選技術(shù)。這些技術(shù)整體上可以歸納為兩大類，一類是利用天然產(chǎn)物自身以及與靶點(diǎn)互作的理化性質(zhì)進(jìn)行直接篩選；另一類是利用基因組文庫或者生命體宏觀表型變化對靶點(diǎn)進(jìn)行間接篩選。本文從以上角度綜合靶點(diǎn)驗證的技術(shù)對目前活性天然藥物的快速篩選方法進(jìn)行綜述，以期給讀者帶來有益參考。

1 活性天然產(chǎn)物蛋白靶點(diǎn)的直接篩選策略

1.1 基于天然產(chǎn)物自身理化性質(zhì)的篩選策略

天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣，含有共軛結(jié)構(gòu)體系的分子往往具有紫外吸收，測定紫外吸收強(qiáng)度是這類物質(zhì)檢測的常用技術(shù)手段［23-24］，同時大共軛體系、分子環(huán)化以及苯環(huán)等官能團(tuán)的存在使得一部分天然產(chǎn)物具有熒光屬性，在一定波長的激發(fā)光下可以自發(fā)熒光，如白藜蘆醇等物質(zhì)具有一定的自發(fā)熒光［25］，這些特殊理化性質(zhì)的存在使得在篩選此類藥物的靶點(diǎn)時帶來便利。利用藥物的自發(fā)熒光可以研究細(xì)胞對藥物的利用吸收［26］，藥物的細(xì)胞定位，結(jié)合凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)可以方便快速的找到藥物結(jié)合的蛋白靶點(diǎn)，進(jìn)而進(jìn)行分子機(jī)制的研究。此類方法只局限于部分天然藥物，很多具有重要價值的藥物沒有明顯的紫外吸收和熒光光譜，比如青蒿素［27］。

1.2 基于天然產(chǎn)物靶點(diǎn)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的直接篩選

通常小分子藥物與靶蛋白的結(jié)合會增加蛋白的穩(wěn)定性，研究人員利用藥物小分子對蛋白質(zhì)氧化、酶解、加熱過程中穩(wěn)定性的影響，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)開發(fā)了一系列藥物靶點(diǎn)的非標(biāo)記快速篩選方法［28］。

1.2.1 基于靶點(diǎn)氧化穩(wěn)定性開發(fā)的SPROX技術(shù)基于氧化穩(wěn)定性結(jié)合定量質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)，研究人員構(gòu)建了SPROX（Stability of Proteins from Rates of Oxidation）技術(shù)，這種技術(shù)以不同濃度鹽酸胍處理混合蛋白（細(xì)胞組織裂解液），然后用同樣條件的H2O2處理，用蛋白質(zhì)組學(xué)定量氧化的甲硫氨酸的氧化比例，藥物的加入會使得靶點(diǎn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增加，進(jìn)而減少甲硫氨酸暴露和氧化。作者以免疫抑制劑環(huán)孢素A（Cyclosporin A，CsA）和酵母蛋白為例進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)CsA能顯著降低10種蛋白質(zhì)中甲硫氨酸的氧化比例，其中cyclophilin A和UDPglucose-4-epimerase是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的兩種效應(yīng)靶點(diǎn)，另外8個靶點(diǎn)同時為研究該藥的脫靶效應(yīng)提供了思路，同時利用該方法還能夠?qū)μ烊划a(chǎn)物與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合親和力進(jìn)行測定［29］。

Geer Wallace等［30］利用該技術(shù)結(jié)合標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究了天然產(chǎn)物manassantin A潛在作用靶點(diǎn)，該技術(shù)也可以研究生命過程中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的差異，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是近年抗衰老領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，Roberts等［31］利用該技術(shù)研究了衰老模型小鼠與青年小鼠腦中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的差異，為尋找抗衰老的蛋白質(zhì)治療靶點(diǎn)提供了示范。

1.2.2 基于靶點(diǎn)酶解穩(wěn)定性開發(fā)的DARTS技術(shù) DARTS（Drug affinity responsive target stability），是基于藥物親和反應(yīng)提高靶點(diǎn)蛋白抗蛋白酶水解的特性開發(fā)的新技術(shù)。Lomenick等［32］首先利用小分子雷帕霉素、FK506 抑制劑和其重組表達(dá)的靶蛋白FKBP12進(jìn)行了原理驗證，實驗結(jié)果表明加入與該蛋白結(jié)合的小分子可顯著提高其抗蛋白酶水解的特性，且與小分子濃度呈依賴性，同時mTOR激酶與其抑制劑E4的相互作用也驗證了上述原理。該團(tuán)隊運(yùn)用該技術(shù)進(jìn)行實踐，成功的篩選出了白藜蘆醇調(diào)控真核轉(zhuǎn)錄的靶點(diǎn)蛋白EIF4A，Lomenick認(rèn)為該方法不僅僅體現(xiàn)在對非標(biāo)記小分子產(chǎn)物靶點(diǎn)篩選得適用，而且也可以在生物分子相互作用篩選之間廣泛適用［32-34］，近年來該方法在天然產(chǎn)物應(yīng)用領(lǐng)域應(yīng)用比較廣泛［35］。該技術(shù)也具有一定的缺陷，酶解法對低豐度的蛋白損失嚴(yán)重，裂解液使用具有限制，獲得的靶點(diǎn)傾向于高豐度的蛋白。小分子本身對酶活的影響以及復(fù)雜的蛋白間相互作用也可能帶來結(jié)果的偏差，同時該方法也受凝膠、液相分離和質(zhì)譜儀器的檢測限的影響［20］。

1.2.3 基于靶點(diǎn)熱穩(wěn)定性開發(fā)的CETSA/TS-FITGE/TPP/ITSP技術(shù) 基于靶點(diǎn)熱穩(wěn)定性開發(fā)的靶點(diǎn)篩選技術(shù)是近幾年研究的熱點(diǎn)，實驗證實大部分情況下小分子和其靶點(diǎn)作用能夠增加靶點(diǎn)的穩(wěn)定性，同樣靶點(diǎn)蛋白質(zhì)隨溫度變化的變性曲線會因為與配體小分子的結(jié)合而變化，靶點(diǎn)蛋白的降解溫度和變化趨勢可以作為區(qū)分靶點(diǎn)蛋白和其他蛋白的一個參數(shù)，進(jìn)而完成靶點(diǎn)蛋白的篩選工作［36-38］。相比于氧化穩(wěn)定性和酶解穩(wěn)定性，靶點(diǎn)蛋白熱穩(wěn)定性無需化學(xué)試劑的添加，而是直接采用加熱超速離心，結(jié)合分離定量等技術(shù)測定對照組和藥物干預(yù)組可溶性蛋白的差異［39］。該原理基于不同的蛋白質(zhì)定量差異分析方法，形成了不同的細(xì)分技術(shù)種類。

研究人員將熱穩(wěn)定性與凝膠電泳和免疫印跡結(jié)合對藥物特異蛋白靶點(diǎn)結(jié)合進(jìn)行了分析，建立為細(xì)胞熱穩(wěn)定性遷移試驗CETSA（Cellular Thermal Shift Assay）技術(shù)，在溫度和加熱時間保持恒定的情況下，可獲得與藥物濃度依賴性的可溶性靶點(diǎn)蛋白特異性圖譜，這種方法依賴于特異性的抗體，因此通量較低［40］。另一組研究人員將熒光定量二維凝膠電泳蛋白質(zhì)組技術(shù)與熱穩(wěn)定性原理結(jié)合起來，繪制藥物干預(yù)下蛋白的熱穩(wěn)定性遷移曲線，開發(fā)出基于凝膠的蛋白質(zhì)組學(xué)篩選藥物靶點(diǎn)的新方法TS-FITGE（In-gel fluorescence difference caused by thermal stability shift），成功找到了大麥芽堿（Hordenine）新的藥物靶點(diǎn)并進(jìn)行了體外驗證［41］。但無論是普通的還是半定量的熒光染色差異凝膠二維電泳，其分辨率都有限。

研究人員將熱穩(wěn)定性與定量質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)聯(lián)合運(yùn)用在建立了TPP（Thermal proteome profiling）方法，在這項工作中細(xì)胞裂解液全蛋白在與廣譜激酶抑制劑staurosporine反應(yīng)，然后在不同溫度下加熱，使用基于質(zhì)譜的工作流程從每個樣品中提取、鑒定和定量可溶性蛋白質(zhì)。利用這種方法作者分析了激酶抑制劑staurosporine對其50多個靶點(diǎn)的影響，鑒定出血紅素生物合成酶鐵螯合酶作為該激酶抑制劑的新靶點(diǎn)，并認(rèn)為它的抑制作用導(dǎo)致了使用 vemurafenib和alectinib觀察到的光毒性，同時還觀察到該藥物治療下游通路蛋白的熱遷移［42］。利用該技術(shù)還發(fā)現(xiàn)methotrexate、（S）-crizotinib 和2'3'-cGAMP的細(xì)胞內(nèi)作用靶點(diǎn)，其中發(fā)現(xiàn)2'3'-cGAMP與先天免疫信號傳導(dǎo)的跨膜受體STRING蛋白相互作用［43］。

隨后研究人員對該方法進(jìn)行了更加詳細(xì)的描述，并對裂解液，離心條件，蛋白質(zhì)酶切條件，質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析流程等進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化［44-45］?；诎悬c(diǎn)熱穩(wěn)定性的技術(shù)也不可避免的存在一些缺陷，比如低豐度蛋白易降解難以檢測，產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)難以分析，藥物對熱穩(wěn)定性的影響具有不確定性以及間接作用的影響帶來假陽性。Ball等［46］提出TPP技術(shù)溫度設(shè)置點(diǎn)過多，操作繁瑣成本高，他們開發(fā)了基于單一溫度的熱穩(wěn)定性靶點(diǎn)篩選方法iTSA（Isothermal shift assay），該技術(shù)操作簡單，理想的情況下效率更高。

1.2.4 聚合物捕獲法 特異性聚合物捕獲法UPT（Unique Polymer Technology）不同于基于靶點(diǎn)穩(wěn)定性的方法，研究人員合成了一些特異的高分子聚合物材料，這些材料能夠非共價結(jié)合小分子藥物，進(jìn)而捕獲與小分子結(jié)合的蛋白靶點(diǎn)。研究人員將雙吲哚甲酰胺III（GSK3β的抑制劑）固定在聚合物表面，用免疫印跡分析方法證明了GSK3β的特異性捕獲［47］。UPT的方法顯然相對于以上基于穩(wěn)定性的方法操作更加簡單［48］，該方法的局限性是不僅僅把與小分子相互作用的靶蛋白富集出來，而且還會富集與靶蛋白相互作用的其他蛋白質(zhì)，假陽性率較高［48］。

2 天然產(chǎn)物靶點(diǎn)間接篩選方法

2.1 基因組文庫篩選

基因組文庫篩選是通過分子生物學(xué)方法得到基因敲除、表達(dá)量降低、過表達(dá)、突變的個體或者細(xì)胞，并將含有以上不同基因的模式生物個體或者細(xì)胞集合成文庫，進(jìn)行高通量藥物靶點(diǎn)篩選的方法。利用基因文庫對研究對象-天然產(chǎn)物進(jìn)行藥效學(xué)評價，產(chǎn)生藥性改變的對象可能就是敲除了天然藥物對應(yīng)的靶點(diǎn)，例如在敲除掉特定基因的細(xì)胞如果產(chǎn)生了對藥物的耐藥性，那么該基因編碼的蛋白就有可能是藥物的靶點(diǎn)。基因文庫構(gòu)建的方法主要有RNAi，同源重組，基因編輯等方法［49］。酵母是一種應(yīng)用廣泛具有價值的研究疾病和藥物作用機(jī)制的模式生物，擁有遺傳易感，穩(wěn)定，培養(yǎng)簡單的特點(diǎn)［50］?；诮湍附⒌幕蛉笔?、過表達(dá)的文庫已經(jīng)廣泛應(yīng)用于篩選藥物的靶標(biāo)［51］。最近，基于基因編輯技術(shù)CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）-Cas9技術(shù)獲取的真核細(xì)胞文庫也已經(jīng)構(gòu)建和應(yīng)用［52-53］。

2.2 其他間接篩選方法

除了通過天然產(chǎn)物小分子與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合后理化性質(zhì)的改變作為篩選方法，也可以間接的通過藥物刺激后觀察細(xì)胞生理、信號通路蛋白或者基因水平的變化，進(jìn)而利用功能分析和生物信息學(xué)輔助判斷可能的靶點(diǎn)蛋白。例如，活性產(chǎn)物小分子對血管生成產(chǎn)生影響、誘導(dǎo)自噬等現(xiàn)象［54-55］，就可以推斷分子可能的作用靶點(diǎn)范圍，進(jìn)而利用分子生物學(xué)方法逐一驗證，針對虎杖苷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激的現(xiàn)象，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)虎杖苷是一種新的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的抑制劑［56］。雷公藤甲素表現(xiàn)出強(qiáng)烈轉(zhuǎn)錄抑制現(xiàn)象，根據(jù)這一現(xiàn)象研究人員借助中心法則原理，推導(dǎo)并驗證出RNA聚合酶Ⅱ的亞基XPB是雷公藤甲素的靶點(diǎn)，解決了困擾科研人員多年的問題［57］。值得一提的是，無論是輔助組學(xué)技術(shù)進(jìn)行候選靶點(diǎn)的篩選，還是計算預(yù)測可能的結(jié)合位點(diǎn)，生物信息學(xué)都深度參與了整個研究過程，隨著人工智能的發(fā)展，這一趨勢將更明顯，甚至起到?jīng)Q定性作用［58-59］。

3 天然活性產(chǎn)物靶點(diǎn)確證方法

在篩選得到天然產(chǎn)物的候選靶點(diǎn)后，需要進(jìn)一步的進(jìn)行確證，直接的方法就是采用與篩選方法一致的技術(shù)，如可以通過靶點(diǎn)的純蛋白與小分子進(jìn)行結(jié)合前后的穩(wěn)定性測試，如果小分子與蛋白質(zhì)之間是共價結(jié)合，還可以采用質(zhì)譜的方法測量結(jié)合分子后蛋白的分子量，從而判斷結(jié)合的小分子數(shù)目，甚至解析結(jié)合的位點(diǎn)［60-62］。除了這些常規(guī)的方法，還可以通過測量小分子與蛋白結(jié)合前后的理化參數(shù)來做出判斷，常用的方法有：等溫滴定量熱（Isothermal titration calorimetry，ITC）、表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）、光譜法、原子力顯微鏡、核磁共振法等［63-64］。

4 展望

中藥以及活性天然產(chǎn)物源自長期的實踐，具有真實可靠的療效，篩選挖掘其藥物靶點(diǎn)可能發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，同時新的藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)也為天然藥物的結(jié)構(gòu)改造，設(shè)計新的藥物提供了思路。如圖1所示，藥物與靶點(diǎn)就像太極圖的陰陽互補(bǔ)的兩面，“藥-靶互動”的思想將會促進(jìn)新藥的創(chuàng)新與改造。

圖1 活性天然產(chǎn)物蛋白靶點(diǎn)快速篩選與驗證策略總結(jié)

目前針對復(fù)方中藥復(fù)雜組分的藥物靶點(diǎn)篩選，主要是利用生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行的［65-67］。在COVID-2019疫情中也大量涌現(xiàn)了基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究成果［68］。組分復(fù)雜的中藥復(fù)合物是很難通過化學(xué)標(biāo)記的方法進(jìn)行分析，單個組分的研究也不可能解釋中藥復(fù)方多組分多靶點(diǎn)的優(yōu)勢，借助非標(biāo)記化合物的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)新型篩選策略，從宏觀角度研究中藥復(fù)方的靶點(diǎn)群，可能會對中藥的復(fù)方的分子機(jī)理解釋、解決中藥注射液不良反應(yīng)等問題提供幫助。

中藥的現(xiàn)代化需要科學(xué)的手段對中藥的科學(xué)內(nèi)涵進(jìn)行闡釋。尋找和鑒定中藥的藥物靶點(diǎn)，是理解中藥藥理和明確其有效物質(zhì)基礎(chǔ)的關(guān)鍵步驟。生物化學(xué)的發(fā)展給我們提供了有可能解決這些問題的技術(shù)手段。在COVID-2019新型冠狀病毒引起的突發(fā)公共衛(wèi)生事件中，一些老藥、中藥、天然產(chǎn)物顯示出明顯的療效［69-70］，快速的篩選這些藥物的作用靶點(diǎn)，可以為這些藥物的應(yīng)用和推廣提供科學(xué)依據(jù)和信服的實驗藥理證據(jù)。本文總結(jié)了活性天然產(chǎn)物效應(yīng)靶點(diǎn)的快速篩選策略，探討了各種技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及前景，希望能夠?qū)ο嚓P(guān)研究提供新的思路。