酒制延胡索微波炮制工藝的優(yōu)化研究

王斌 梁偉龍 林欽賢 康志英 王其豐

摘 要 目的：優(yōu)化酒制延胡索的微波炮制工藝。方法：采用高效液相色譜法測定微波炮制酒制延胡索中原阿片堿、鹽酸小檗堿、延胡索乙素的含量;采用熱浸法測定浸出物含量。在單因素試驗的基礎上，以微波炮制酒制延胡索的外觀性狀、浸出物和原阿片堿、鹽酸小檗堿、延胡索乙素含量為評價指標，以黃酒量、悶潤時間、火力大小、炮制時間為考察因素，采用正交試驗法結合綜合加權評分法優(yōu)化炮制工藝并驗證，同時與傳統(tǒng)酒制延胡索進行比較。結果：原阿片堿、鹽酸小檗堿、延胡索乙素檢測進樣量的線性范圍分別為0.100～1.500 μg（R 2=0.999 6）、0.012～0.188 μg（R 2=0.999 5）、0.050～0.750 μg（R 2=0.999 8）;精密度、穩(wěn)定性（12 h）、重復性試驗的RSD均小于2%;加樣回收率分別為99.15%～100.34%（RSD=0.54%，n=6）、99.52%～100.78%（RSD=0.69%，n=6）、99.26%～99.79%（RSD=0.28%，n=6）。最優(yōu)微波炮制工藝為黃酒用量4 g（約藥材量的20%）、微波火力40%、悶潤時間3 h、炮制時間3 min。3次驗證試驗結果顯示，浸出物、原阿片堿、鹽酸小檗堿、延胡索乙素的含量分別為15.7%～16.1%、0.061%～0.063%、0.003%～0.004%、0.061%～0.063%;綜合評分分別為97.916、94.730、97.217分，RSD分別為0.42%、0.38%、0.46%（n=3）;與傳統(tǒng)酒制法比較，原阿片堿等成分的含量無顯著性差異，但微波炮制酒制延胡索無焦斑、焦屑。結論：所建含量測定方法操作簡便、準確可靠、重復性好，可用于酒制延胡索中活性成分的定量分析;所得微波炮制工藝穩(wěn)定、可行，可用于酒制延胡索的炮制。

關鍵詞 微波炮制法;酒制延胡索;浸出物;原阿片堿;鹽酸小檗堿;延胡索乙素;正交試驗;高效液相色譜法

中圖分類號 R283;R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）20-2503-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.20.13

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To optimize the microwave processing technology of yellow wine-processed Corydalis yanhusuo. METHODS： The contents of opioid alkaloid， berberine hydrochloride and tetrahydropalmatine in C. yanhusuo processed with yellow wine were determined by HPLC. The contents of the extracts were determined by hot dipping method. Based on the single factor tests， using the appearance of yellow wine-processed C. yanhusuo with microwave processing technology， the contents of extract， opioid alkaloid， berberine hydrochloride and tetrahydropalmatine as indexes， with the amount of yellow wine， wetting time， microwave power and microwaving time as factors， the processing technology was optimized with orthogonal test combined with comprehensive weighted scoring method， and then validated and compared with traditional yellow wine-processed C. yanhusuo. RESULTS： The linear ranges of opioid alkaloid， berberine hydrochloride and tetrahydropalmatine were 0.100-1.500 μg （R 2=0.999 6）， 0.012-0.188 μg （R 2=0.999 5）， 0.050-0.750 μg （R 2=0.999 8）. RSDs of precision， stability （12 h） and repeatability tests were all less than 2%. The recoveries were 99.15%-100.34%（RSD=0.54%， n=6）， 99.52%-100.78%（RSD=0.69%， n=6）， 99.26%-99.79%（RSD=0.28%， n=6）.? The optimum microwave processing technology included that the amount of yellow wine was 4 g （about 20% of medicinal material amount）， microwave power was 40%， wetting time was 3 hour， processing time was 3 min. The results of three verification tests showed that the contents of extract， opioid alkaloid， berberine hydrochloride and tetrahydropalmatine were 15.7%-16.1%， 0.061%-0.063%， 0.003%-0.004% and 0.061%-0.063%. The comprehensive scores were 97.916， 94.730 and 97.217， and RSD were 0.42%， 0.38%， 0.46% （n=3）， respectively. Compared with traditional yellow wine processing technology， there was? no significant difference in the contents of opioid alkaloid and other components， but no scorched spot and crumbs was found in yellow wine-processed C. yanhusuo with microwave processing technology. CONCLUSIONS： Established method for content determination is simple， accurate， reliable and reproducible， and can be used for quantitative analysis of active components in yellow wine-processed C. yanhusuo. Optimized microwave processing technology is stable and feasible， and can be used for the processing of yellow wine-processed C. yanhusuo.

KEYWORDS? ?Microwave processing technology; Yellow wine-processed Corydalis yanhusuo; Extract; Opioid alkaloid; Berberine hydrochloride; Tetrahydropalmatine; Orthogonal test; HPLC

延胡索，別名元胡、玄胡索、玄胡等，始載于《本草拾遺》，為罌粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W. T. Wang的干燥塊莖[1]，其味辛、苦，性溫，歸肝、脾經(jīng)，具有活血、行氣、止痛的功效[2]。延胡索主要含有生物堿類化學成分，其中原阿片堿、鹽酸小檗堿、延胡索乙素為其發(fā)揮鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用的活性成分[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，延胡索可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和內分泌系統(tǒng)，具有明顯鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、降壓和抗心律失常的作用，對冠心病、心律失常、胃潰瘍等疾病有較好的療效，臨床應用廣泛[4]。

目前，關于延胡索的炮制研究以醋制延胡索居多，且普遍以延胡索乙素為考察指標[5-9]。雖然延胡索乙素含量較高，但單一成分仍難以保障延胡索炮制品的藥效與內在質量。延胡索生品中游離生物堿類成分難溶于水，且不易煎出，止痛效果欠佳，但經(jīng)醋制、酒制后其生物堿類成分的煎出量均有所提升，鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用明顯增強[9]。酒制延胡索功效偏于活血化瘀[10]，在上海[11]、湖南[12]、河南[13]、陜西[14]等地方炮制規(guī)范中均有收載。傳統(tǒng)酒制法為加入黃酒悶潤后于鍋中炒干，但對炒制火力、炮制時間等條件的控制僅憑經(jīng)驗操作，存在火候難控、飲片色澤不均勻、焦斑、含水量高、難以保存等弊端[15]。微波炮制中藥不僅操作簡單、工藝可控，還能殺菌消毒[15]。加之在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，酒制延胡索的活血化瘀、止痛療效更好?；诖?，本研究建立了測定生物堿類成分（原阿片堿、鹽酸小檗堿、延胡索乙素）含量的高效液相色譜法（HPLC）;同時結合臨床實際需求，采用微波炮制法炮制酒制延胡索，并以其外觀性狀、浸出物、生物堿的含量為評價指標，以黃酒量、悶潤時間、火力大小、炮制時間為考察因素，采用正交試驗法結合綜合加權評分法對其微波炮制工藝進行優(yōu)化，以期為延胡索炮制新技術的開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

DIONEX Ultimate 3000型HPLC儀，包括雙三元高壓泵、自動進樣器、紫外檢測器、柱溫箱[賽默飛世爾科技（中國）有限公司];DHG-9245A型電熱鼓風干燥箱、HWS-28型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）;XS-204型萬分之一電子天平、MX5型百萬分之一電子天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司];G90F25CN3LN-C2型微波爐（廣東格蘭仕集團有限公司）。

1.2 藥品與試劑

延胡索乙素對照品（批號：110726-201819，純度：99.8%）、原阿片堿對照品（批號：110853-201805，純度：99.6%）、鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-201814，純度：86.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院;紹興黃酒（浙江圣塔紹興酒有限公司，批號：20181212，酒精度：10.0%）;乙腈為色譜純，冰乙酸、乙醇、氨水等均為分析純，水為超純水。延胡索藥材（批號：20200501）購自浙江省東陽市千祥中藥材市場，經(jīng)廣州市香雪制藥股份有限公司康志英制藥高級工程師鑒定為罌粟科植物延胡索C. yanhusuo W. T. Wang的干燥塊莖。

2 方法與結果

2.1 酒制延胡索的炮制

按照2015年版《中國藥典》（一部）延胡索[2]項下炮制方法炮制：延胡索藥材除去雜質，洗凈，切厚片，于60 ℃干燥至水分合格（≤15.0%），得延胡索飲片，待用。

2.1.1 傳統(tǒng)酒制法 取上述延胡索飲片20 g，加入20%黃酒拌勻，悶透，置于鍋中用文火加熱，炒干，取出，放涼。

2.1.2 微波炮制法 取上述延胡索飲片20 g，加入適量黃酒拌勻，悶透，單層鋪于微波爐托盤上，加熱，干燥。

2.2 浸出物的測定

以50%乙醇為溶劑，按照2015年版《中國藥典》（四部）通則“2201”項下“醇溶性浸出物測定法——熱浸法”測定[16]。

2.3 生物堿類成分的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：依利特Sino Chrom ODS-BP（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（三乙胺調pH至6.0）（B），梯度洗脫（0～60 min，80%A→40%A;60～70 min，40%A→30%A;70～75 min，30%A→15%A）;檢測波長：280 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;進樣量：10 μL。

2.3.2 混合對照品溶液的制備 取原阿片堿、鹽酸小檗堿、延胡索乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成上述成分質量濃度分別為200、25、100 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取“2.1.2”項下微波炮制酒制延胡索樣品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，加入濃氨試液-甲醇混合溶液（1 ∶ 20，V/V，下同）50 mL，稱定質量，冷浸1 h后加熱回流提取1 h，取出放冷，用濃氨試液-甲醇混合溶液補足減失的質量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性對照溶液的制備 除不加炮制樣品外，其余按“2.3.3”項下自“加入濃氨試液-甲醇混合溶液50 mL……經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液”操作，即得。

2.3.5 系統(tǒng)適用性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，各色譜峰均能實現(xiàn)基線分離，分離度均大于1.5;理論板數(shù)按延胡索乙素峰計均不低于3 000;陰性對照溶液對測定無干擾。

2.3.6 線性關系考察 分別精密量取“2.3.2”項下混合對照品溶液0.5、1、2、3、4、5、7.5 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得系列線性標準溶液。取上述系列線性標準溶液適量，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以進樣量為橫坐標（X，μg）、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，結果見表1。

2.3.7 精密度試驗 取“2.3.2”項下混合對照品溶液適量，加甲醇稀釋5倍，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，原阿片堿、鹽酸小檗堿、延胡索乙素峰面積的RSD分別為0.5%、1.1%、1.4%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.3.3”項下微波炮制酒制延胡索樣品的供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，原阿片堿、鹽酸小檗堿、延胡索乙素峰面積的RSD分別為1.1%、1.6%、0.7%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置12 h內基本穩(wěn)定。

2.3.9 重復性試驗 取“2.1.2”項下微波炮制酒制延胡索樣品粉末0.5 g，共6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算各待測成分的含量。結果，原阿片堿、鹽酸小檗堿、延胡索乙素的平均含量分別為0.051%、0.003%、0.051%，RSD分別為0.8%、1.0%、1.5%（n=6），表明方法重復性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的微波炮制酒制延胡索樣品粉末0.25 g，共6份，分別按質量比1 ∶ 1精密加入“2.3.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果，原阿片堿、鹽酸小檗堿、延胡索乙素的加樣回收率分別為99.15%～100.34%（RSD=0.54%，n=6）、99.52%～100.78%（RSD=0.69%，n=6）、99.26%～99.79%（RSD=0.28%，n=6）。

2.3.11 樣品含量測定 分別取傳統(tǒng)酒制法、微波炮制法制得的酒制延胡索樣品粉末各適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，平行操作3次，記錄峰面積并按標準曲線法計算各待測成分的含量。

2.4 單因素試驗

2.4.1 黃酒量考察 取延胡索飲片，每份20 g，共5份，分別加入黃酒1、2、4、6、8 g（約藥材量的5%～40%）和適量水，拌勻，待輔料（水和黃酒，下同）吸盡后悶潤2 h，單層鋪于微波爐托盤上，設定微波爐火力大小為30%，炮制時間為3 min，加熱后取出，放涼。按“2.3.11”項下方法測得3種生物堿類成分的總含量分別為0.104 5%、0.112 1%、0.112 4%、0.115 7%、0.109 8%[3種生物堿類成分的總含量=（原阿片堿質量+鹽酸小檗堿質量+延胡索乙素質量）/飲片質量×100%，下同]。結果，當黃酒量為6 g時，3種生物堿類成分的總含量最高，故選擇黃酒量4～8 g進行后續(xù)研究。

2.4.2 悶潤時間考察 取延胡索飲片，每份20 g，共5份，加入黃酒6 g和適量水，拌勻，待輔料吸盡后，分別悶潤0.5、1、2、3、4 h，單層鋪于微波爐托盤上，設定微波爐火力大小為30%，炮制時間為3 min，加熱后取出，放涼。按“2.3.11”項下方法測得3種生物堿類成分的總含量分別為0.106 8%、0.110 5%、0.114 6%、0.114 3%、0.110 4%。結果，當悶潤時間為2 h時，3種生物堿類成分的總含量最高，故選擇悶潤時間1～3 h進行后續(xù)研究。

2.4.3 火力大小考察 取延胡索飲片，每份20 g，共5份，加入黃酒6 g和適量水，拌勻，待輔料吸盡后悶潤2 h，單層鋪于微波爐托盤上，設定微波爐火力大小分別為20%、30%、40%、50%、60%，炮制時間為3 min，加熱后取出，放涼。按“2.3.11”項下方法測得3種生物堿類成分的總含量分別為0.107 6%、0.114 5%、0.115 3%、0.115 7%、0.115 6%。結果，當微波爐火力為50%時，3種生物堿類成分的總含量最高，故選擇火力大小40%～60%進行后續(xù)研究。

2.4.4 炮制時間考察 取延胡索飲片，每份20 g，共5份，加入黃酒6 g和適量水，拌勻，待輔料吸盡后悶潤2 h，單層鋪于微波爐托盤上，設定微波爐火力大小為50%，炮制時間分別為1、2、3、4、5 min，加熱后取出，放涼。按“2.3.11”項下方法測得3種生物堿類成分的總含量分別為0.110 3%、0.114 1%、0.114 6%、0.113 8%、0.114 0%。結果，當炮制時間為3 min時，3種生物堿類成分的總含量最高，故選擇炮制時間2～4 min進行后續(xù)研究。

2.5 正交試驗與驗證

在單因素試驗的基礎上，以黃酒量（A）、悶潤時間（B）、火力大?。–）、炮制時間（D）為考察因素，以微波炮制酒制延胡索的外觀性狀、浸出物以及原阿片堿、鹽酸小檗堿、延胡索乙素含量為評價指標，采用L9（34）表進行正交試驗。因素與水平見表2，試驗方案與結果見表3，方差分析結果見表4。酒制延胡索外觀性狀評分：深黃色5分、黃褐色3分、黃白色或黃色1分;酒香味濃5分、酒香味適中3分、酒香味淡1分，酒制延胡索外觀性狀評分越高表示質量越好[17]。參考相關文獻[18]確定權重，外觀性狀、浸出物均占20%，原阿片堿占40%，其余2種生物堿成分各占10%。綜合評分=外觀性狀×20%+浸出物含量×20%+原阿片堿含量×40%+鹽酸小檗堿含量×10%+延胡索乙素含量×10%，綜合評分越高表示樣品質量越好[18]。

2.6 傳統(tǒng)酒制法與微波炮制法比較

2.6.1 外觀比較 傳統(tǒng)酒制法炮制的延胡索表面呈深黃色或黃褐色，偶見焦斑、焦屑;微波炮制法炮制的延胡索表面呈深黃色，外觀完整、無焦斑、焦屑，符合延胡索炮制品的要求[2]。

2.6.2 含量比較 取同一批延胡索飲片20 g，分別按“2.5”項下最優(yōu)微波炮制工藝、“2.1.1”項下傳統(tǒng)酒制法炮制酒制延胡索，再按“2.2”“2.3.11”項下方法分別測定飲片和炮制品中浸出物、原阿片堿、鹽酸小檗堿、延胡索乙素的含量，平行操作3次。采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對浸出物、生物堿（原阿片堿、鹽酸小檗堿、延胡索乙素）的含量進行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果，不同炮制方法制得樣品中浸出物及生物堿類成分的含量均無顯著性差異（P>0.05），詳見表6。

3 討論

本研究參考相關文獻[19-21]，考察了超聲提取、回流提取、索氏提取等不同提取方法對原阿片堿、鹽酸小檗堿、延胡索乙素含量的影響。結果發(fā)現(xiàn)，當以冷浸后回流提取時，3種生物堿類成分含量較高，且色譜峰較多，故選擇冷浸后回流提取。同時，筆者又分別對乙腈-0.2%冰醋酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液（三乙胺調pH至6.0）、乙腈-醋酸-醋酸銨緩沖液（pH為6.0）等不同流動相體系進行了考察。結果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1%磷酸水溶液（三乙胺調pH至6.0）為流動相時，3種生物堿類成分對應色譜峰的峰形良好，均可達到基線分離，且分離度大于1.5，故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液（三乙胺調pH至6.0）為流動相進行梯度洗脫。

傳統(tǒng)酒制法在操作中火力、炮制時間難以控制，太過易炒焦，不及則達不到預期的炮制效果[15]。因此，尋找一種簡單、可控、可量化、可克服傳統(tǒng)方法不足的新型炮制工藝是保證炮制品藥效的關鍵。本研究采用微波炮制法，以黃酒量、悶潤時間、火力大小、炮制時間為考察因素，以微波炮制酒制延胡索的外觀性狀、浸出物、原阿片堿、鹽酸小檗堿、延胡索乙素含量為評價指標，同時結合綜合加權評分對工藝進行優(yōu)化，最終確定最優(yōu)微波炮制工藝為黃酒用量4 g（約藥材量的20%）、悶潤時間3 h、微波火力40%、炮制時間3 min。同時，通過與傳統(tǒng)酒制法進行比較，發(fā)現(xiàn)雖然微波炮制法所得酒制延胡索浸出物及3種生物堿類成分的含量與傳統(tǒng)酒制法比較無顯著性差異，但外觀性狀優(yōu)于傳統(tǒng)酒制法，且浸出物及3種生物堿類成分的含量均略高于延胡索飲片，該結果與文獻報道結果[22]一致。

綜上所述，本研究所建含量測定方法操作簡便、準確可靠、重復性好，可用于酒制延胡索中活性成分的定量分析;所得微波炮制工藝穩(wěn)定、可行，可用于酒制延胡索的炮制。雖然，微波炮制法具有能量集中、穿透力強、操作簡單、易于控制、節(jié)能衛(wèi)生等優(yōu)點，為中藥炮制提供了一種新的技術，但由于炮制工藝變化較大，是否能完全替代傳統(tǒng)的炮制方法，后續(xù)尚需藥理藥效試驗、毒理試驗、化學成分分析、臨床研究等進一步驗證。

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（收稿日期：2020-06-15 修回日期：2020-08-31）

（編輯：陳 宏）