豬牙皂的萃取方法研究及萃取成分的GC-MS分析

鄧鉍莉 董娜娜 王旭蘭 羅成月 陳曉蘭

摘 要 目的：建立豬牙皂的萃取方法并優(yōu)化，同時(shí)分析鑒定萃取物的化學(xué)成分。方法：采用CO2超臨界流體萃取（SFE）法對(duì)豬牙皂進(jìn)行萃取;在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以萃取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，萃取溫度、萃取壓強(qiáng)、萃取時(shí)間為考察因素，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化SFE工藝并進(jìn)行驗(yàn)證。采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)萃取物的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，并采用面積歸一化法計(jì)算各成分的相對(duì)百分含量。結(jié)果：豬牙皂的最優(yōu)SFE萃取工藝為萃取溫度60 ℃、萃取壓強(qiáng)300 MPa、萃取時(shí)間15 min;3次驗(yàn)證試驗(yàn)的平均萃取率為1.73%（RSD=1.78%，n=3）。共鑒定出豬牙皂萃取物中的48個(gè)成分，占萃取物總量的98.31%;其中，有機(jī)酸類成分最多，占總成分的36.99%;其次是生物堿類成分，占總成分的12.59%;主要成分包括棕櫚酸（16.62%）、油酸（14.12%）、N-氨基四氫吡咯（9.79%）、2，6-二甲基辛烷-1，7-二烯-3-醇（5.95%）、四氫吡喃（3.83%）、香蘭素（3.39%）等。結(jié)論：成功建立豬牙皂萃取的SFE法，萃取物主要為有機(jī)酸類成分。

關(guān)鍵詞 豬牙皂;CO2超臨界流體萃取法;單因素試驗(yàn);正交試驗(yàn);氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish and optimize a extraction method of Fructus Gleditsiae Abnormallis， and to analyze and identify chemical components of the extract simultaneously. METHODS： Fructus Gleditsiae Abnormallis was extracted with CO2 supercritical fluid extraction （SFE） method. Based on single factor tests， using extraction yield as index， extraction temperature， extraction pressure and extraction time as investigation factors， SFE technology was optimized with orthogonal test， and validation test was performed. Chemical components in the extract were identified by GC-MS. Relative percentage of each component was calculated with area normalization method. RESULTS： The optimal SFE extraction technology of Fructus Gleditsiae Abnormallis was extraction temperature of 60 ℃， extraction pressure of 300 MPa and pression time of 15 min. Average extraction of 3 times of validation tests was 1.73% （RSD=1.78%， n=3）. The 48 components in the extracts of Fructus Gleditsiae Abnormallis were identified， which accounted for 98.31% of the total amount of the extracts. The extracts of Fructus Gleditisae Abnormalis mainly included organic acids， accounting for 36.99%， followed by alkaloids， accounting for 12.59% in total. Main components were palmitic acid （16.62%）， oleic acid （14.12%）， N-aminotetrahydropyrrole （9.79%）， 2，6-dimethyloctane-1，7-dien-3-ol （5.95%）， tetrahydropyran （3.83%）， vanillin （3.39%）， etc. CONCLUSIONS： SFE method of Fructus Gleditisae Abnormalis is established successfully， and the extract is mainly organic acids.

KEYWORDS? ?Fructus Gleditisae Abnormalis; CO2 supercritical fluid extraction; Single factor test; Orthogonal test; GC-MS

豬牙皂Gleditsiae Fructus Abnormalis是豆科植物皂莢Gleditsia sinensis Lam.的干燥不育果實(shí)，具有祛痰開竅、消腫散結(jié)的功效[1]。在臨床上，單用豬牙皂可治療腦中風(fēng)后遺癥昏迷不醒、中風(fēng)口噤、關(guān)竅不通等癥，配以鵝不食草和細(xì)辛制成通關(guān)散可治療痰濁阻竅所致的氣閉神昏、牙關(guān)緊閉、不省人事等癥[1]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，豬牙皂對(duì)腦中風(fēng)后遺癥尤其是腦缺血后遺癥、高血脂后遺癥有顯著療效[2-4]。通過(guò)文獻(xiàn)[5-8]調(diào)研發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)，學(xué)者對(duì)于豬牙皂的研究大多集中在其皂苷類、多糖類等極性較大的物質(zhì)，而其中極性較小的成分則鮮有報(bào)道，根據(jù)該藥在臨床上吹鼻取嚏的使用方法，判斷其小極性成分有一定的藥理活性，故本試驗(yàn)欲提取豬牙皂中小極性成分。CO2超臨界流體萃?。⊿FE）法是一種萃取速度快、萃取效率高的萃取方法[9-13]，CO2超臨界流體兼有氣體、液體雙重特性，溶解能力強(qiáng)，流動(dòng)性、傳遞性良好;該法萃取過(guò)程易調(diào)節(jié)、能耗低，不僅能萃取出揮發(fā)性物質(zhì)，一些極性小且不易揮發(fā)的化學(xué)成分也能被萃取出來(lái)[14-16]。基于此，本研究采用SFE法對(duì)豬牙皂中的化學(xué)成分進(jìn)行萃取，并對(duì)萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化，再采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析萃取物中的化學(xué)成分及其含量，旨在為豬牙皂的深入研究和開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

ASI型超臨界萃取儀（環(huán)球分析測(cè)試儀器有限公司）;Agilent 6890N-5975B型GC-MS儀[安捷倫科技（中國(guó)）有限公司];AE240萬(wàn)分之一電子天平[梅特勒托利多儀器（上海）有限公司];RRH-A500型高速多功能粉碎機(jī)（上海緣沃工貿(mào)有限公司）。

1.2 藥材和試劑

豬牙皂藥材（批號(hào)：20170408）由亳州市京皖中藥飲片廠提供，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鐘可副教授鑒定為豆科植物皂莢G. sinensis Lam.的干燥不育果實(shí);CO2和氦氣（青島合利氣體有限公司，純度：99.999%）;氯化鈉等其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 SFE法萃取豬牙皂

SFE法的基本原理是利用超臨界流體在超臨界狀態(tài)下的超常的溶解能力與該流體密度的關(guān)系，即利用壓力與溫度對(duì)其溶解能力的特殊影響而進(jìn)行分離[13，17-18]。從上述原理可知，影響SFE法的主要因素有萃取溫度、萃取壓強(qiáng)和萃取時(shí)間。本研究首先采用單因素試驗(yàn)確定影響因素的水平，再采用正交試驗(yàn)對(duì)萃取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.1 單因素試驗(yàn)

（1）萃取溫度的考察：取豬牙皂藥材適量，粉碎成粗粉，精密稱取3份，每份約15 g，置于萃取釜中，控制萃取時(shí)間為15 min、萃取壓強(qiáng)為300 MPa，分別在萃取溫度為30、60、90 ℃條件下進(jìn)行萃取，采用揮發(fā)性成分密閉收集瓶于冰浴下收集萃取物。以萃取率為指標(biāo)，考察萃取溫度的影響。萃取率=萃取量/藥材量×100%。結(jié)果，所得萃取物均為淡黃色粉末（下同）;當(dāng)萃取溫度為60 ℃時(shí)，萃取率最高，為1.45%，詳見表1。

（2）萃取壓強(qiáng)的考察：取豬牙皂藥材適量，粉碎成粗粉，精密稱取3份，每份約15 g，置于萃取釜中，控制萃取時(shí)間為15 min、萃取溫度為60 ℃，分別在萃取壓強(qiáng)為250、300、350 MPa條件下進(jìn)行萃取，同法收集萃取物并計(jì)算萃取率。結(jié)果，當(dāng)萃取壓強(qiáng)為300 MPa時(shí)，萃取率最高，為1.77%，詳見表2。

（3）萃取時(shí)間的考察：取豬牙皂藥材適量，粉碎成粗粉，精密稱取5份，每份約15 g，置于萃取釜中，控制萃取溫度為60 ℃、萃取壓強(qiáng)為300 MPa，分別萃取10、15、20 min，同法收集萃取物并計(jì)算萃取率。結(jié)果，當(dāng)萃取時(shí)間為15 min時(shí)，萃取率最高，為1.77%，詳見表3。

2.1.2 正交試驗(yàn)

在參考單因素試驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)方法[19]的基礎(chǔ)上，以萃取率為指標(biāo)，萃取溫度（A，℃）、萃取壓強(qiáng)（B，MPa）、萃取時(shí)間（C，min）為考察因素、以萃取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。因素與水平見表4，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

精密稱取豬牙皂粗粉3份，每份約15 g，分別置于萃取釜中，按“2.1.2”項(xiàng)下篩選的最優(yōu)萃取工藝進(jìn)行操作，同法收集萃取物并計(jì)算萃取率。結(jié)果，萃取率分別為1.71%、1.75%、1.69%，平均萃取率為1.72%（RSD=1.78%，n=3），表明優(yōu)化的萃取工藝穩(wěn)定、可行。

2.2 GC-MS分析豬牙皂萃取物的化學(xué)成分

2.2.1 樣品前處理

參考文獻(xiàn)方法[20-23]，稱取豬牙皂的萃取物適量，置于頂空瓶中，密封，于60 ℃下平衡30 min，以固相微萃取針吸附60 min，待萃取結(jié)束后，再于進(jìn)樣口解吸5 min。

2.2.2 GC條件

色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;升溫程序：起始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速率升至160 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min的速率升至220 ℃，保持3 min;進(jìn)樣口溫度：250 ℃;載氣：氦氣;載氣流速：1.0 mL/min;進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣量：1μL。

2.2.3 MS條件

電子轟擊離子源;離子源溫度：230 ℃;四極桿溫度：180 ℃;接口溫度：280 ℃;電子能量：70 eV;溶劑延遲時(shí)間：3 min;掃描范圍：10～650 amu;掃描模式：全掃描模式。

2.2.4 數(shù)據(jù)處理

取“2.2.1”項(xiàng)下經(jīng)處理的樣品，按“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，獲得總離子流圖，見圖1。利用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)局（NIST）2011譜庫(kù)，對(duì)GC-MS測(cè)定所得到的質(zhì)譜信息進(jìn)行檢索，通過(guò)比對(duì)、分析保留時(shí)間，初步確定萃取物中的化學(xué)成分，并利用面積歸一化法分析各成分的相對(duì)百分含量。結(jié)果，從豬牙皂萃取物中鑒定出化學(xué)成分48種，占萃取物總量的98.31%。其中，包括有機(jī)酸類化合物7種，占總成分的36.99%;生物堿類化合物4種，占總成分的12.59%;酮類化合物10種（包括1種烯酮類），占總成分的11.64%;醛類化合物7種（包括3種萜烯醛類），占總成分的9.07%;烯醇類化合物3種，占總成分的8.71%;酯類化合物7種，占總成分的6.77%;烯烴類化合物5種，占總成分的4.04%;酚類化合物2種，占總成分的1.90%;以及3種苯環(huán)或雜環(huán)類化合物，占總成分的6.60%。主要成分包括棕櫚酸（16.62%）、油酸（14.12%）、N-氨基四氫吡咯（9.79%）、2，6-二甲基辛烷-1，7-二烯-3-醇（5.95%）、四氫吡喃（3.83%）、香蘭素（3.39%）等。豬牙皂萃取物中化學(xué)成分鑒定結(jié)果詳見表7。

3 討論

本研究采用單因素試驗(yàn)法考察了萃取溫度、萃取壓強(qiáng)、萃取時(shí)間對(duì)萃取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果顯示，各單影響因素各水平下的萃取率存在一定的差異。為了進(jìn)一步探討多因素多水平對(duì)萃取率的影響，本研究采用正交試驗(yàn)法進(jìn)一步對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，只有A因素對(duì)萃取率有顯著的影響。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，確定SFE最優(yōu)提取工藝為：萃取溫度為60 ℃、萃取壓強(qiáng)為300 MPa、萃取時(shí)間為15 min。

本研究利用GC-MS對(duì)萃取物進(jìn)行分析、鑒定，初步確定其化學(xué)成分和相對(duì)百分含量。結(jié)果顯示，從豬牙皂的SFE萃取物中共鑒定出48個(gè)成分，占萃取物總量的98.31%。萃取物成分種類較多，其中含量最多的是有機(jī)酸類化合物（占36.99%），其次是生物堿類（占12.59%）。與已有文獻(xiàn)報(bào)道的水蒸氣蒸餾法萃取出的成分[4]比較，兩種方法萃取出來(lái)的成分存在較大差異，只有極少數(shù)相同的成分，如棕櫚酸甲酯和苯甲醛等。水蒸氣蒸餾法萃取出的大多為易揮發(fā)類成分，其成分之間分子量大小差異相對(duì)較小;而SFE法萃取出的成分一部分是揮發(fā)性成分，而大多數(shù)是不易揮發(fā)的成分，且成分之間分子量大小差異較大，兩部分成分中均包括一些極性較小的成分，如分子量最小且極性較小的四氫吡喃，分子量?jī)H為86.130，而分子量最大的環(huán)五聚二甲基硅氧烷，分子量達(dá)到370.770。由此說(shuō)明SFE法不僅能萃取出分子量小、揮發(fā)性較強(qiáng)的成分，一些分子量大、揮發(fā)性較弱的成分也可能被萃取出來(lái)。

綜上所述，本文成功建立了豬牙皂萃取的SFE法，萃取物主要為有機(jī)酸類成分。本文為更全面地分析豬牙皂的有效成分奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：318、1448-1449.

[ 2 ] 孫永康，楊海燕，王新志.王新志應(yīng)用豬牙皂治療腦系疾病經(jīng)驗(yàn)[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2019，25（9）：1238- 1240.

[ 3 ] 楊敬鴻，陳曉蘭，楊曉梅，等.基于信息熵理論和方差分析比較豬牙皂不同組分對(duì)小鼠缺血缺氧及血腦屏障通透性影響[J].中藥藥理與臨床，2018，34（6）：83-86.

[ 4 ] 周力，黎明，李鳳，等.豬牙皂?yè)]發(fā)性成分GC-MS分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（24）：156-159.

[ 5 ] 楊敬鴻，楊曉梅，謝浪，等.正交試驗(yàn)-聯(lián)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)法優(yōu)選豬牙皂提取工藝[J].貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2018，40（2）：31-35.

[ 6 ] 劉林華，許景薇，萬(wàn)玉英，等.豬牙皂正丁醇提取物體外對(duì)肝星狀細(xì)胞活性的影響研究[J].抗感染藥學(xué)，2015，12（6）：832-834.

[ 7 ] 張新軍，梁瑞雪，趙渤年，等.豬牙皂總皂苷提取適宜醇濃度的研究[J].藥學(xué)研究，2013，32（10）：571-573.

[ 8 ] 趙聲蘭，陳進(jìn)偉，劉芳，等.豬牙皂多糖提取工藝及體外抗氧化活性的研究[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，33（4）：15-18.

[ 9 ] 廖彭瑩，盧汝梅，邵敏敏，等.水蒸氣蒸餾法和二氧化碳超臨界流體萃取法提取柚寄生的揮發(fā)性成分[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（5）：1274-1276.

[10] 廖金花，葉勇樹，楊宜婷，等.廣陳皮的超臨界流體萃取和水蒸氣蒸餾揮發(fā)油的比較分析[J].中國(guó)藥房，2011，22（43）：4079-4080.

[11] 肖花艷，易延逵.更年安顆粒CO2超臨界流體萃取工藝與水蒸氣蒸餾提取工藝的比較研究[J/CD].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2011，5（14）：4261-4263.

[12] 賀東亮，張恒慧，李靜舒，等.響應(yīng)面法優(yōu)化綠薄荷精油的超臨界CO2萃取工藝[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（10）：61-66.

[13] 劉娜.超臨界流體萃取技術(shù)在中藥萃取的應(yīng)用[J].廣州化工，2017，45（24）：31-33.

[14] 丁仡，李源棟，劉秀明，等.超臨界CO2萃取印蒿精油工藝優(yōu)化及成分分析[J].食品研究與開發(fā)，2019，40（24）：167-172.

[15] 張紅英，姚元虎，顏雪明.超臨界流體萃取分離技術(shù)及其應(yīng)用[J].首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，37（6）：50-53.

[16] 趙茹.超臨界流體萃取技術(shù)在天然藥物提取中的應(yīng)用分析[J].化工管理，2019（36）：17-18.

[17] 邱采奕.超臨界流體萃取技術(shù)及其在食品中的應(yīng)用[J].科技經(jīng)濟(jì)導(dǎo)刊，2019，27（2）：149-151.

[18] 吳芳，李雄山，陳樂(lè)斌.超臨界流體萃取技術(shù)及其應(yīng)用[J].廣州化工，2018，46（2）：19-20.

[19] 張雅，王一喬，馬卓雅，等.藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)選壯藥柏金顆粒的水提醇沉工藝[J].中國(guó)藥房，2020，31（8）：919-925.

[20] 楊錦玲，梅文莉，董文化，等.沉香GC-MS指紋圖譜分析[J].中成藥，2016，38（8）：1765-1770.

[21] 劉清茹，譚偉民，文詩(shī)泳，等.枳殼藥材揮發(fā)油的GC-MS指紋圖譜研究[J].中國(guó)藥房，2018，29（4）：461-465.

[22] 李生茂，葉強(qiáng)，敖慧.砂仁揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜與其鎮(zhèn)痛作用的關(guān)系[J].中成藥，2016，38（2）：346-350.

[23] 張婷婷，郭夏麗，黃學(xué)勇，等.辛夷揮發(fā)油GC-MS分析及其抗氧化、抗菌活性[J].食品科學(xué)，2016，37（10）：144-150.

（收稿日期：2019-12-30 修回日期：2020-08-18）

（編輯：鄒麗娟）