二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化葎草多糖提取工藝

韓丹

摘要：為確定超聲輔助提取葎草多糖的最佳工藝條件，通過單因素試驗(yàn)確定液料比、超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間等因素的較適宜范圍，并應(yīng)用二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝條件。超聲輔助提取葎草多糖的最佳工藝條件為：液料比34 mL ∶1 g，超聲功率134 W，超聲溫度61 ℃，超聲時(shí)間49 min，此時(shí)多糖提取率為352%。經(jīng)二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化后的葎草多糖提取工藝具有試驗(yàn)次數(shù)少、計(jì)算簡單、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，工藝穩(wěn)定可行。

關(guān)鍵詞：葎草多糖；超聲輔助提取；單因素試驗(yàn)；二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào)： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0308-04

葎草[Humulus scandens （Lour.）Merr.]別稱勒草、澀蘿蔓、拉拉秧、五爪龍等，為多年生莖蔓草本植物，是廣泛分布于我國（除新疆、青海、西藏外）各省份的常見雜草，其嫩莖和葉可作為食草動(dòng)物飼料。葎草是我國重要的中藥材，其味甘苦、寒、無毒，具有清熱解毒、利尿消腫的功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，葎草提取物具有抗菌、抗炎、止瀉抑菌、降壓、鎮(zhèn)痛等作用[2]。葎草中含有多糖、黃酮類化合物、膽堿、天門冬酰胺、揮發(fā)油、鞣質(zhì)等成分。近年來，對(duì)葎草中黃酮化合物、揮發(fā)油的成分與藥理研究已取得一些進(jìn)展，葎草黃酮類化合物主要包含秋英苷（cosmosiin）、本犀草素-7-葡萄糖苷（luteolin-7-D-glrcoside）、牡荊素（vitexin）等；揮發(fā)油主要包含β-葎草烯（β-humulene）、石竹烯（caryophyllene）、α-古巴烯（α-copaene）、α-，β-芹子烯（α-，β-selinene）、γ-畢澄茄烯（γ-cadinene）、苯甲醇、苯乙醇等[3]，然而關(guān)于葎草多糖的報(bào)道極為少見。超聲波輔助法具有簡單、便捷、安全等優(yōu)點(diǎn)，可縮短提取時(shí)間，增大多糖萃取率，目前已被廣泛應(yīng)用于植物多糖的提取。本研究采用超聲波輔助法提取葎草多糖，并應(yīng)用二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，以期為葎草資源的有效開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料與試劑葎草采自吉林工商學(xué)院周邊農(nóng)田，去掉根部及枯黃部分，洗凈后于60 ℃干燥8 h，粉碎后過60目篩，保存?zhèn)溆?。葡萄糖?biāo)準(zhǔn)品購自上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司，蒽酮、濃硫酸、乙醇等試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為去離子水。

1.1.2儀器KQ200-KDV型超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司），UV-160A型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司），R-301型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海科升儀器有限公司），SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（河南鄭州長城儀器有限公司），TGL-20M型離心機(jī)（湘潭湘儀儀器有限公司），F(xiàn)W177型中草藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1原料的預(yù)處理將粉碎后的原料按液料比5 mL ∶1 g加入石油醚，回流脫脂2次，每次1.5 h，濾去石油醚，濾渣揮干后獲得預(yù)處理葎草粉末。

1.2.2葎草多糖的提取將預(yù)處理葎草粉末按一定液料比加入水中，浸泡2 h后置于超聲波清洗器，固定超聲頻率為 40 kHz，以不同超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間進(jìn)行提取。提取結(jié)束后過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至適當(dāng)體積，加入3倍體積的95%乙醇醇沉24 h，離心烘干至恒質(zhì)量。采用Sevage的方法[4]除去蛋白質(zhì)，離心并取上清液進(jìn)行濃縮，加入3倍體積的95%乙醇醇沉，所得沉淀用乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌，真空烘干后得到葎草多糖。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

針對(duì)影響葎草多糖提取率的各因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并采用二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝條件。固定超聲功率120 W、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間50 min，分別按10 mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、30 mL ∶1 g、40 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g的液料比提取葎草多糖，以確定超聲輔助提取葎草多糖較適宜的液料比。固定液料比30 mL ∶1 g、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間50 min，分別按80、100、120、140、160 W的超聲功率提取葎草多糖，以確定超聲輔助提取葎草多糖較適宜的超聲功率。固定液料比 30 mL ∶1 g、超聲功率120 W、超聲時(shí)間50 min，分別按30、40、50、60、70 ℃的超聲溫度提取葎草多糖，以確定超聲輔助提取葎草多糖較適宜的超聲溫度。固定液料比30 mL ∶1 g、超聲功率120 W、超聲溫度50 ℃，分別按10、30、50、70、90 min 的超聲時(shí)間提取葎草多糖，以確定超聲輔助提取葎草多糖較適宜的超聲時(shí)間。在確定各因素的適宜范圍后，以葎草多糖提取率為指標(biāo)，作4因素5水平的二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化超聲輔助提取葎草多糖的工藝條件。

1.4分析及測定方法

采用蒽酮-硫酸法測定總糖含量[5]，采用二硝基水楊酸法測定還原糖含量[6]，多糖提取率按下式計(jì)算：

C=m1-m2m×100%。

式中：C為多糖提取率，%；m1為樣品中總糖含量，mg；m2為樣品中還原糖含量，mg；m為樣品的質(zhì)量，mg。

2結(jié)果與分析

2.1液料比對(duì)葎草多糖提取率的影響

分別以10 mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、30 mL ∶1 g、40 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g的液料比提取葎草多糖，研究液料比對(duì)多糖提取率的影響。結(jié)果表明，多糖提取率隨液料比的加大而增加，當(dāng)液料比超過30 mL ∶1 g后多糖提取率增加不明顯（圖1）。較大的液料比將為后期工藝帶來困難，且能耗較高，因此選擇30 mL ∶1 g左右的液料比。

2.2超聲功率對(duì)葎草多糖提取率的影響

分別以80、100、120、140、160 W的超聲功率提取葎草多

糖，研究超聲功率對(duì)多糖提取率的影響。結(jié)果表明，多糖提取率隨超聲功率的加大而增加，當(dāng)超聲功率超過140 W后多糖提取率反而下降（圖2）。超聲功率對(duì)葎草多糖提取率具有雙向影響，前期超聲功率必須達(dá)到一定強(qiáng)度才能產(chǎn)生空化作用，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)以便多糖的溶出；當(dāng)超聲功率超過140 W，超聲波的機(jī)械剪切作用會(huì)加快已溶出多糖糖苷鍵的斷裂，從而導(dǎo)致提取率下降，因此選擇140 W左右的超聲功率。

2.3超聲溫度對(duì)葎草多糖提取率的影響

分別以30、40、50、60、70 ℃的超聲溫度提取葎草多糖，研究溫度對(duì)多糖提取率的影響。結(jié)果表明，多糖提取率隨超聲溫度的升高而增加，當(dāng)超聲溫度超過60 ℃后多糖提取率反而下降（圖3）。溫度越高則分子運(yùn)動(dòng)越強(qiáng)，多糖越易溶出；而過高的溫度可與超聲波破碎共同作用，破壞多糖的某些結(jié)構(gòu)或使其降解，從而影響提取率，因此選擇60 ℃左右的超聲溫度。

2.4超聲時(shí)間對(duì)葎草多糖提取率的影響

分別以10、30、50、70、90 min的超聲時(shí)間提取葎草多糖，研究超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。結(jié)果表明，多糖提取率隨超聲時(shí)間的延長而增加，當(dāng)超聲時(shí)間超過50 min后多糖提取率反而下降（圖4）。前期超聲波機(jī)械剪切作用和空化作用使多糖快速溶出；而長時(shí)間持續(xù)的機(jī)械剪切作用使已溶出的多糖分子糖苷鍵斷裂， 從而降低提取率， 因此選擇50 min左

右的超聲時(shí)間。

2.5二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性檢驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取液料比、超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間4個(gè)因素，以葎草多糖提取率為指標(biāo)，采用二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)的因素與水平

因素0水平變化區(qū)間X1：液料比（mL ∶g）30 ∶15X2：超聲功率（W）14010X3：超聲溫度（℃）605X4：超聲時(shí)間（min）5010

2.5.3兩因素互作效應(yīng)分析由試驗(yàn)結(jié)果的方差分析可知，各因素間只有X2（超聲功率）與X3（超聲溫度）存在互作效應(yīng)并達(dá)到顯著水平（P<0.05），所以選取其他因素為0水平，分析X2與X3的互作效應(yīng)（圖6）。結(jié)果表明，當(dāng)X2處于較低編碼范圍（-2～+1），而X3處于較高編碼范圍（-0.5～+2）時(shí)，兩因素互作效應(yīng)明顯。在該范圍內(nèi)固定超聲溫度，則多糖提取率隨超聲功率的加大而先升后降；在該范圍內(nèi)固定超聲功率，則多糖提取率隨超聲溫度的升高而先升高后緩慢下降，表明超聲功率與超聲溫度協(xié)同作用時(shí)條件不宜過高。

2.5.4頻率分析與模型尋優(yōu)本研究采用頻率分析法尋找最優(yōu)工藝，采用DPS軟件對(duì)不同設(shè)計(jì)水平下的組合進(jìn)行模擬

試驗(yàn)，獲得97個(gè)大于臨界值2.94的方案，各變量取值的頻率分布見表5。當(dāng)X1在0.671～1.041、X2在-0.962～-0.585、X3在0.009～0.362、X4在-0.143～0.143時(shí)，多糖提取率高于2.94%的可能性為95%，此時(shí)優(yōu)化提取條件為：液料比33.36 mL ∶1 g～35.21 mL ∶1 g、超聲功率133.38～134.15 W、超聲溫度60.04～61.81 ℃、超聲時(shí)間48.57～5143 min。考慮到設(shè)備的可操作性，將提取工藝條件更改為：液料比 34 mL ∶1 g、超聲功率134 W、超聲溫度61 ℃、超聲時(shí)間49 min。對(duì)此方案進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，獲得葎草多糖提取率為3.52%，接近于理論最高提取率3.49%，因此確定此組合為超聲輔助提取葎草多糖的最優(yōu)工藝條件。表5二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)各變量取值的頻率分布

3結(jié)論

采用二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲輔助提取葎草多糖的工藝，獲得的回歸方程為：Y=3.352 86+0.186 67X1-0.139 17X2-0.094 67X12-0.098 42X22-0.127 17X32-0.214 67X42-0068 75X2X3。葎草多糖提取工藝條件為：液料比 34 mL ∶1 g、超聲功率134 W、超聲溫度61 ℃、超聲時(shí)間 49 min。二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化葎草多糖的提取具有試驗(yàn)次數(shù)少、計(jì)算簡單、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，可為葎草資源的有效開發(fā)提供技術(shù)參考。

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